Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Vi takker alle lab medlemmer af Macho laboratorium for nyttige diskussioner, Alvaro López-García for statistisk rådgivning, og Xinyu Jian for teknisk og administrativ bistand under dette arbejde. Vi takker PSC Cell Biology kernefacilitet for bistand med fluorescens imaging Dette arbejde blev støttet af den strategiske prioritet Forskningsprogram af den kinesiske Academy of Sciences (tilskud XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (kinesisk Academy of Sciences) og det kinesiske 1000 Talents program.

BEMÆRK: Vigtige dele af denne metode omfatter håndtering af plantematerialer in vitro, og derfor er det vigtigt at holde sterile forhold under alle disse procedurer, herunder visualisering af DsRed fluorescens. Under hele transformationsprocessen vokser tomatplanter ved 25−28 °C og 16 h/8 h lys/mørke (130 μmolfotoner m-2s-1 lys). Pladerne forsegles med mikroportape for at lette gasudveksling og -transpiration.
1. Fremstilling af tomatplanter og ...

<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum udgør en stor trussel mod landbruget. men dens interaktion med naturlige værter af landbrugsbetydning er stadig dårligt forstået sammenlignet med andre bakterielle patogener, især i plantearter. I de fleste tilfælde hæmmes genetisk analyse af den tid og de udgifter, der er nødvendige for at genetisk modificere værtsplanter. For at løse dette problem og lette genetisk analyse af R. solanacearum infektion i tomat, har vi udviklet en nem metode baseret på Agrobacterium...

Ralstonia solanacearum, årsagssammenhæng agent for bakteriel visne sygdom, er en ødelæggende jordbårne vaskulære patogen med en verdensomspændende fordeling, der kan inficere en lang række plantearter, herunder kartoffel, tomat, tobak, banan, peber og aubergine, blandt andre1,2. Udbyttetab forårsaget af Ralstonia kan nå 80-90% af produktionen i tomat, kartoffel eller banan, afhængigt af sort, klima, jord og andre faktorer3. Men, Ralstonia model er betydeligt underudforsket i forhold til andre modeller, der involverer bakterielle plante patogener, såsom Pseudomonas syringae eller Xanthomonas spp. Derudover er de fleste undersøgelser i plante-mikrobe interaktioner fokuseret på modellen plante Arabidopsis thaliana. Selv om forskning ved hjælp af disse modeller i høj grad har bidraget til vores forståelse af plante-bakterier interaktioner, de ikke løse den nuværende nødvendighed for at forstå disse interaktioner i afgrøder planter. Forskning, der er målrettet mod at forstå samspillet mellem Ralstonia og afgrødeplanter, er afgørende for at udvikle bæredygtige løsninger til bekæmpelse af bakteriel leflen, men er i øjeblikket hæmmet af manglen på enkle eksperimentelle analyser, der karakteriserer de forskellige komponenter i interaktionen. Især tomat, en naturlig vært for Ralstonia, er den næstvigtigste vegetabilske afgrøde på verdensplan og er ramt af en overflod af sygdomme4, herunder bakteriel visne sygdom. I dette arbejde har vi udviklet en nem metode til at udføre genetisk analyse af Ralstonia infektion af tomat. Denne metode er baseret på Agrobacterium rhizogenes-medieret transformation af tomat rødder, ved hjælp af DsRed fluorescens som udvælgelse markør5, efterfulgt af Ralstonia jord-drenching podning af de resulterende planter, der indeholder transformerede rødder udtrykke konstruktion af interesse. Alsidigheden af rodtransformationsanalysen gør det muligt at udføre enten genoverekspression eller genhæmning medieret af RNAi.
En potentiel begrænsning af denne metode består i den resterende vækst af ikke-transformerede rødder. Dette er især vigtigt i de tilfælde, hvor plasmid anvendes mangler en reporter gen, der tillader udvælgelse af omdannede rødder. For at løse dette problem har vi udviklet en alternativ metode baseret på antibiotikaudvælgelse, som hæmmer væksten af ikke-transformerede rødder, samtidig med at vi tillader vækst af sunde antibiotikaresistente transformerede rødder. Da A. rhizogenes ikke fremkalder omdannelse af skud, er de modtagelige for antibiotika, og de bør derfor holdes adskilt fra det antibiotiske medium.
Selv om plantenmodstand mod Ralstonia ikke er godt forstået, har flere rapporter forbundet cellevæg ændringer til øget resistens over for bakteriel visne6,7,8,9. Det er blevet foreslået, at disse cellevæg ændringer påvirker vaskulær udvikling, et væsentligt aspekt for livsstil Ralstonia inde i anlægget10. Mutationer i gener, der koder cellulosesynthaserne CESA4, CESA7 og CESA8 i Arabidopsis thaliana, har vist sig at forringe sekundære cellevægintegritet, hvilket medfører øget resistens over for Ralstonia, som synes at være forbundet med ABA-signalering8. Derfor, som et proof of concept for vores metode, udførte vi RNAi-medieret genhæmning af SlCESA6 (Solyc02g072240), en sekundær celle-væg cellulose syntase, og ortolog af AtCESA8 (At4g18780). Efterfølgende jord-drenching vaccination med Ralstonia viste, at lyddæmpning SlCESA6 øget resistens over for bakterielle visne symptomer, hvilket tyder på, at celle væg-medieret resistens over for Ralstonia sandsynligvis bevares i tomat, og validering af vores metode til at udføre genetisk analyse af bakteriel visneresistens i tomat rødder. Her beskriver vi denne metode i detaljer, så genetiske tilgange til at forstå bakteriel visne sygdom i en relativt kort tid og med små krav til udstyr og plantevækst plads.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum er en ødelæggende jordbårne vaskulære patogen, der kan inficere en lang række plantearter, der forårsager en betydelig trussel mod landbruget. Men, Ralstonia model er betydeligt underudforsket i forhold til andre modeller, der involverer bakterielle plante patogener, såsom Pseudomonas syringae i Arabidopsis. Forskning, der er målrettet mod at forstå samspillet mellem Ralstonia og afgrødeplanter, er afgørende for at udvikle bæredygtige løsninger til bekæmpelse af bakteriel leflen, men er i øjeblikket hæmmet af manglen på enkle eksperimentelle analyser for at karakterisere de forskellige komponenter i samspillet i indfødte værtsplanter. I dette scenario har vi udviklet en metode til at udføre genetisk analyse af Ralstonia infektion af tomat, en naturlig vært for Ralstonia. Denne metode er baseret på Agrobacterium rhizogenes-medieret transformation af tomat rødder, efterfulgt af Ralstonia jord-drenching podning af de resulterende planter, der indeholder transformerede rødder udtrykke konstruktion af interesse. Alsidigheden af rodtransformationsanalysen gør det muligt at udføre enten genoverekspression eller genhæmning medieret af RNAi. Som et proof of concept, vi brugte denne metode til at vise, at RNAi-medieret lyddæmpning af SlCESA6 i tomat rødder gav resistens over for Ralstonia. Her beskriver vi denne metode i detaljer, så genetiske tilgange til at forstå bakteriel visne sygdom i en relativt kort tid og med små krav til udstyr og plantevækst plads.

Figur 5 viser udviklingen af sygdomssymptomer på tomatplanter med rødder omdannet med en tom vektor (EV), og planter med rødder omdannet med en RNAi konstruktion rettet mod SlCESA6 (Solyc02g072240). Sygdomsindeksdataene (figur 5A) indsamles fra den samme forsøgsenhed (hvert anlæg) over tid i henhold til en vilkårlig skala fra 0 til 4 og følger ikke en gaussisk fordeling, idet de udelukker...

Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Her præsenterer vi en alsidig metode til tomatrodtransformation efterfulgt af podning med Ralstonia solanacearum for at udføre ligetil genetisk analyse til undersøgelse af bakteriel visnesygdom.

Tomatrod Transformation Efterfulgt af podning med Ralstonia Solanacearum for ligetil genetisk analyse af bakteriel visnesygdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Denne protokol er betydelig, fordi det giver forskerne mulighed for at udføre ligetil genetisk analyse af bakteriel visne sygdom i tomat. Den største fordel ved denne teknik er, at manipulation af genekspression og efterfølgende analyser kan udføres på kort tid og med de små krav til udstyr og plantevækst plads. Dette er metode er meget alsidig, og det kan anvendes til andre afgrøder planter til at udføre både patogen inokulering og andre fysiologiske analyser.For at opretholde steriliteten under manipulation af planter in vitro, er det vigtigt at holde pladerne lukket, når de er uden for flowhætten. Dette er en nem teknik, men det kræver flere trin for manipulation. Visualiseringen af denne metode vil bidrage til at se små tricks, der er vanskelige at forklare i manuskriptet, hjælpe andre forskere til at gennemføre metoden i deres laboratorier.Bidrage til at demonstrere denne procedure vil være Achen Zhao, en kandidat studerende. Efter sterilisering og vask af tomatfrø, overføre dem til halv styrke Murashige og Skoog medium uden saccharose. Hold frøene i mørke ved en temperatur mellem 25 og 28 grader Celsius i tre dage.Placer autoklavede 8,5-kvadrat-centimeter filtre inde ni-kvadrat-centimeter petriskåle, der indeholder halv styrke Murashige og Skoog medium, og sted seks spirede tomatfrø på hver plade. Forsegle pladen med Micropore tape, og inkubere de spirede frø ved 25 til 28 grader Celsius i tre til fire dage. Dyrk Agrobacterium rhizogener MSU440 i fast LB medium med passende antibiotika i to dage ved 28 grader Celsius før plantens transformation.Ved hjælp af en steril skalpel, skære radikel og bunden af hypocotyl af tomat planter. Brug plast tips eller en skalpel klinge til at høste A.rhizogenes biomasse fra overfladen af LB medium, og forsigtigt dyppe skåret tomat planter i den bakterielle biomasse. Efter dette, dække tomat planter med en to-centimeter-by-fire-centimeter halvcirkelformet filter papir for at holde en høj luftfugtighed og lette overlevelse og nye rod udvikling.Det er vigtigt at holde planterne i høj luftfugtighed i et miljø, der tillader transpiration. For at gøre dette skal du dække frøplanterne med filterpapir og lukke pladen med Mikroporetape. Opbevar de omdannede tomatplanter i seks til syv dage i et vækstkammer ved en temperatur mellem 25 og 28 grader Celsius.Brug derefter en steril skalpel til at skære de nye behårede rødder, og lad planterne til at producere nye behårede rødder. Når anden generation af nye behårede rødder vises, skal du fjerne filterpapiret oven på planterne og forsegle pladen med Mikroportape igen. For at visualisere DsRed fluorescens eller andet udstyr til plantein vivo billeddannelse, markere de positive transformerede rødder, som kan identificeres ved den røde fluorescens.Brug en skalpel til at fjerne de negative ikke-transformerede rødder, som kan identificeres ved deres mangel på rød fluorescens. Overfør de planter, der viser rød fluorescens til en ny plade, der indeholder halvstyrke Murashige og Skoog medium for at lette udviklingen af den transformerede rod som hovedroden. Hold de planter, der ikke viser rød fluorescens i samme plade for at kontrollere fremkomsten af fluorescerende rødder i senere tidspunkter.Dæk frøplanter med en to-centimeter-by-fire-centimeter halvcirkel filter papir, forsegle pladen, og inkubere planter for at lade dem udvikle nye behårede rødder. Forbered podning potter, hvor overfladen af rødderne vil blive udsat for den bakterielle inokulum ved først iblødsætning af podning potter med vand, hælde overskydende vand, og derefter placere dem i en plastik plantning bakke. Ved hjælp af pincet overføres de valgte planter med transformerede rødder til vaccinationspotterne.Dæk bakken med plastfolie eller et gennemsigtigt låg, og hold dem på 25 til 28 grader Celsius med 65% fugtighed. Tag dækslet ud efter fem eller seks dage. Grow Ralstonia i fem LB flydende medium i en orbital shaker ved 28 grader Celsius, med omrystning ved 200 rpm, indtil den stationære fase.Mål den optiske tæthed ved 600 nanometer for at bestemme bakterietallene. Bakteriekulturen fortyndes med vand til en OD600 på 1. Placer 16 til 20 vaccination potter, der indeholder omdannet tomatplanter i en vaccinationsbakke.Hæld derefter 300 milliliter fortyndet bakteriel inokulum i bakken, og lad planterne suge i inokulum i 20 minutter. Derefter skal du forberede en ny bakke med et lag pottejord. Flyt de podede potter ind i den nye bakke, og placer bakkerne i et vækstkammer med 75% fugtighed, en temperatur mellem 26 og 28 grader Celsius, og en fotoperiode på 12 timers lys og 12 timers mørke.Her omdannes tomatrødder og podes med Ralstonia for at udføre simpel genetisk analyse til undersøgelse af bakteriel visnesygdom. Udviklingen af sygdomssymptomer spores i tomatplanter med rødder omdannet med en tom vektor og dem, der omdannes med en RAI konstruktion rettet mod tomat CESA6. Data om sygdomsindekset indsamles fra samme forsøgsenhed over tid efter en vilkårlig skala fra nul til fire og følger ikke en gaussisk fordeling, hvilket udelukker brugen af standardtest for parametriske data.Som en standardtilgang anvendes en U Mann-Whitney, tosidet, ikke-parametrisk test for at sammenligne både kontrol- og infektionskurverne. Ifølge denne analyse synes forskellen mellem medianerne af begge kurver at være ikke-signifikant. Det er også muligt at kvantificere området under sygdomsfremdriftskurven, hvilket gør det muligt at kombinere flere observationer af sygdomsfremdrift i en enkelt værdi.Området under sygdommens fremskridtskurve viser en højere værdi for kontrolplanter sammenlignet med tomat CESA6 RNAi planter i slutningen af infektionsprocessen, hvilket indikerer, at tomat CESA6-tavshed planter er mere modstandsdygtige over for Ralstonia infektion end kontrol planter. Konfidensintervaller giver mulighed for med stor sandsynlighed at anslå en række værdier, hvor populationsværdien for en given variabel findes. Som det ses her, området af 95% tillid interval for kontrol og infektion kurver skøn en højere chance for resistens, når CESA6 er bragt til tavshed.Sygdom indeks værdier kan omdannes til binære data, overvejer en sygdom indeks lavere end to svarende til nul og en sygdom indeks lig med eller højere end to svarende til en. Dette gør det muligt at repræsentere en overlevelseskurve efter Ralstonia-vaccination. Forskellene i overlevelsesraten mellem kontrol- og de inficerede planter er ikke statistisk signifikante i henhold til den statistiske test Gehan-Breslow-Wilcoxon.Ekspressionen af CESA6 analyseres derefter i to tilfældigt udvalgte transformerede rødder før vaccinationstrinnet, hvilket viser, at den øgede modstand mod Ralstonia korrelerer med det reducerede udtryk for CESA6. Efter to runder af udvælgelse, en transformation sats på 35 til 40%kan opnås, og denne værdi kan øges ved at udføre yderligere udvælgelse runder. Under udførelsen af denne procedure, er det vigtigt at holde planterne dækket med et stykke filterpapir for at opretholde høj luftfugtighed og for at forsegle pladerne med Micropore for at sikre gasudveksling.Efter rodtransformationen kan mange af behandlingerne anvendes til at studere planteresponsen ved observation af rodfysiologi eller ved hjælp af molekylærbiologi, cellebiologi eller biokemi. Hovedsageligt, denne teknik vil give forskere med begrænsede ressourcer til at udføre genetisk analyse af bakteriel infektion i tomat rødder.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering og sammenligningsanalyse af planteorganell DNA-berigelsesmetoder egnet til næste generations sekventering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse af Optimal kromosomale placering for en DNA Element i Escherichia coli ved hjælp af en roman Transposon-medieret tilgang

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Målrettet næste generation Sequencing og bioinformatik rørledningen for at evaluere genetiske determinanter for forfatningsmæssige sygdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvleder sekvensering for præimplantations genetisk testning for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kortlægning af termo Toleranceforskelle mellem arter af Saccharomyces gær via Genome-Wide gensidig Hemizygosity analyse

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...