Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Wij danken alle lableden van het Macho laboratorium voor nuttige discussies, Alvaro López-García voor statistisch advies, en Xinyu Jian voor technische en administratieve bijstand tijdens dit werk. Wij danken de PSC Cell Biology kernfaciliteit voor hulp bij fluorescentie beeldvorming Dit werk werd ondersteund door het Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (subsidie XDB27040204), het Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinees Academy of Sciences) en het Chinese 1000 Talents programma.

OPMERKING: Belangrijke onderdelen van deze methode zijn het hanteren van plantaardige materialen in vitro, en daarom is het belangrijk om steriele omstandigheden te behouden tijdens al deze procedures, inclusief de visualisatie van DsRed fluorescentie. Tijdens het hele transformatieproces groeien tomatenzaailingen bij 25−28 °C en 16 h/8 h licht/donker (130 μmol fotonen m-2s-1 licht). Platen zijn verzegeld met microporietape om gasuitwisseling en transpiratie te vergemakkelijken...

<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum vormt een belangrijke bedreiging voor de landbouw; echter, de interactie met natuurlijke gastheren van agrarisch belang is nog steeds slecht begrepen in vergelijking met andere bacteriële pathogenen, vooral in gewasplantensoorten. In de meeste gevallen wordt genetische analyse belemmerd door de tijd en kosten die nodig zijn om waardplanten genetisch te modificeren. Om dit probleem aan te pakken en de genetische analyse van R. solanacearum-infectie bij tomaat te vergemakkelijken, ...

Ralstonia solanacearum, het oorzakelijk middel van bacteriële verwelkingsziekte, is een verwoestende bodem gedragen vasculaire ziekteverwekker met een wereldwijde distributie die een groot scala van plantensoorten kan infecteren, waaronder aardappel, tomaat, tabak, banaan, peper en aubergine, onder andere1,2. Opbrengstverliezen veroorzaakt door Ralstonia kunnen 80-90% van de productie in tomaat, aardappel of banaan bereiken, afhankelijk van cultivar, klimaat, bodem en andere factoren3. Echter, de Ralstonia model is aanzienlijk onderonderzocht in vergelijking met andere modellen met bacteriële plantenpathogenen, zoals Pseudomonas syringae of Xanthomonas spp. Bovendien zijn de meeste studies in plantenmicrobe interacties gericht op de modelplant Arabidopsis thaliana. Hoewel onderzoek met behulp van deze modellen grotendeels heeft bijgedragen aan ons begrip van planten-bacteriën interacties, ze niet ingaan op de huidige noodzaak om deze interacties in gewasplanten te begrijpen. Onderzoek gericht op het begrijpen van de interactie tussen Ralstonia en gewasplanten is essentieel voor het ontwikkelen van duurzame oplossingen voor de bestrijding van bacteriële verwelkingziekte, maar wordt momenteel belemmerd door het ontbreken van eenvoudige experimentele testen om de verschillende componenten van de interactie te karakteriseren. In het bijzonder, tomaat, een natuurlijke gastheer voor Ralstonia, is de tweede belangrijkste groentegewas wereldwijd en wordt beïnvloed door een overvloed aan ziekten4, met inbegrip van bacteriële verwelking ziekte. In dit werk hebben we een eenvoudige methode ontwikkeld om genetische analyse van Ralstonia-infectie van tomaat uit te voeren. Deze methode is gebaseerd op Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van tomatenwortels, met behulp van DsRed fluorescentie als selectiemarker5, gevolgd door Ralstonia bodem-drenken van de resulterende planten, met getransformeerde wortels die de constructie van belang uitdrukken. De veelzijdigheid van de root transformatie test maakt het mogelijk het uitvoeren van ofwel gen overexpressie of gen uitschakeling bemiddeld door RNAi.
Een mogelijke beperking van deze methode bestaat uit de restgroei van niet-getransformeerde wortels. Dit is vooral belangrijk in de gevallen waarin de gebruikte plasmid een reportergen mist dat de selectie van getransformeerde wortels mogelijk maakt. Om dit probleem op te lossen, hebben we een alternatieve methode ontwikkeld op basis van antibioticaselectie, die de groei van niet-getransformeerde wortels remt en tegelijkertijd de groei van gezonde antibioticaresistente getransformeerde wortels mogelijk maakt. Aangezien A. rhizogenes de transformatie van scheuten niet induceert, zijn ze vatbaar voor het antibioticum en moeten ze daarom gescheiden worden gehouden van het antibioticahoudende medium.
Hoewel de weerstand van planten tegen Ralstonia niet goed wordt begrepen, hebben verschillende rapporten celwandwijzigingen geassocieerd met een verbeterde weerstand tegen bacteriële verwelking6,7,8,9. Er is gesuggereerd dat deze celwandveranderingen de vasculaire ontwikkeling beïnvloeden, een essentieel aspect voor de levensstijl van Ralstonia in de plant10. Mutaties in genen die de cellulose synthases CESA4, CESA7 en CESA8 in Arabidopsis thaliana coderen, zijn aangetoond dat secundaire celwand integriteit schaden, waardoor een verbeterde weerstand tegen Ralstonia, die lijkt te zijn gekoppeld aan ABA signalering8. Daarom hebben we als proof of concept voor onze methode RNAi-gemedieerde genuitschakeling van SlCESA6 (Solyc02g072240), een secundaire celwandcellulose synthase en ortholog van AtCESA8 (At4g18780) uitgevoerd. Latere bodem-drenken inenting met Ralstonia bleek dat het uitschakelen van SlCESA6 verbeterde weerstand tegen bacteriële wilt symptomen, wat suggereert dat cel wandgemedieerde weerstand tegen Ralstonia is waarschijnlijk bewaard in tomaat, en valideren van onze methode uit te voeren genetische analyse van bacteriële wilt resistentie in wortels tomaat. Hier beschrijven we deze methode in detail, waardoor genetische benaderingen om bacteriële verwelkingziekte te begrijpen in een relatief korte tijd en met kleine eisen van apparatuur en plant groeiruimte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum is een verwoestende bodem gedragen vasculaire ziekteverwekker die een groot scala van plantensoorten kan infecteren, waardoor een belangrijke bedreiging voor de landbouw. Echter, de Ralstonia model is aanzienlijk onderonderzocht in vergelijking met andere modellen met bacteriële plantenpathogenen, zoals Pseudomonas syringae in Arabidopsis. Onderzoek gericht op het begrijpen van de interactie tussen Ralstonia en gewasplanten is essentieel voor het ontwikkelen van duurzame oplossingen voor de bestrijding van bacteriële verwelkingziekte, maar wordt momenteel belemmerd door het ontbreken van eenvoudige experimentele testen om de verschillende componenten van de interactie in inheemse waardplanten te karakteriseren. In dit scenario hebben we een methode ontwikkeld om genetische analyse van Ralstonia-infectie van tomaat uit te voeren, een natuurlijke gastheer van Ralstonia. Deze methode is gebaseerd op Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van tomatenwortels, gevolgd door Ralstonia bodem-drenken van de resulterende planten, met getransformeerde wortels die de constructie van belang uitdrukken. De veelzijdigheid van de root transformatie test maakt het mogelijk het uitvoeren van ofwel gen overexpressie of gen uitschakeling bemiddeld door RNAi. Als een proof of concept, gebruikten we deze methode om aan te tonen dat RNAi-gemedieerde uitschakeling van SlCESA6 in tomatenwortels de weerstand tegen Ralstoniaverleende. Hier beschrijven we deze methode in detail, waardoor genetische benaderingen om bacteriële verwelkingziekte te begrijpen in een relatief korte tijd en met kleine eisen van apparatuur en plant groeiruimte.

Figuur 5 toont de ontwikkeling van ziektesymptomen van tomatenplanten met wortels getransformeerd met een lege vector (EV), en planten met wortels getransformeerd met een RNAi-constructie gericht op SlCESA6 (Solyc02g072240). De ziekteindexgegevens (figuur 5A) worden verzameld van dezelfde experimentele eenheid (elke installatie) in de loop van de tijd volgens een willekeurige schaal van 0 tot 4,...

Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Hier presenteren we een veelzijdige methode voor tomatenworteltransformatie, gevolgd door inenting met Ralstonia solanacearum om eenvoudige genetische analyse uit te voeren voor de studie van bacteriële verwelkingsziekte.

Tomato Root Transformatie gevolgd door inenting met Ralstonia Solanacearum voor eenvoudige genetische analyse van bacteriële wilt ziekte

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Dit protocol is belangrijk omdat het wetenschappers in staat stelt om eenvoudige genetische analyse van bacteriële verwelking ziekte in tomaat uit te voeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de manipulatie van genexpressie en daaropvolgende testen in korte tijd en met de kleine eisen van apparatuur en plantengroeiruimte kan worden uitgevoerd. Deze methode is zeer veelzijdig, en het kan worden toegepast op andere gewasplanten om zowel pathogenenenting als andere fysiologische tests uit te voeren.Om de steriliteit te behouden tijdens manipulatie van zaailingen in vitro, is het belangrijk om de platen gesloten te houden wanneer ze zich buiten de stroomkap bevinden. Dit is een eenvoudige techniek, maar het vereist meerdere stap voor manipulatie. De visualisatie van deze methode zal helpen om kleine trucs die moeilijk uit te leggen zijn in het manuscript te zien, andere onderzoekers helpen om de methode in hun laboratoria te implementeren.Helpen om deze procedure aan te tonen zal Achen Zhao, een afgestudeerde student. Na het steriliseren en wassen van de tomatenzaden, breng ze naar half-sterkte Murashige en Skoog medium zonder sacharose. Houd de zaden in het donker op een temperatuur tussen 25 en 28 graden Celsius gedurende drie dagen.Plaats autoclaved 8,5 vierkante centimeter filters in negen vierkante centimeter petrischaaltjes met halve sterkte Murashige en Skoog medium, en plaats zes ontkiemde tomatenzaden op elk bord. Verzegel de plaat met Micropore tape en ontcued de ontkiemde zaden op 25 tot 28 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen. Kweek de Agrobacterium rhizogenes MSU440 in vaste LB medium met de juiste antibiotica voor twee dagen op 28 graden Celsius voor de transformatie van de plant.Met behulp van een steriele scalpel, snijd de radicle en de onderkant van de hypocotyl van de tomatenzaailingen. Gebruik plastic tips of een scalpelblad om biomassa van A.rhizogenes te oogsten van het oppervlak van het LB-medium en dompel de gesneden tomatenzaailingen voorzichtig onder in de bacteriële biomassa. Bedek hierna de tomatenzaailingen met een halfomvormig filterpapier van twee centimeter bij vier centimeter om een hoge luchtvochtigheid te behouden en overleving en nieuwe wortelontwikkeling te vergemakkelijken.Het is belangrijk om de zaailingen in een hoge luchtvochtigheid te houden in een omgeving die transpiratie mogelijk maakt. Om dit te doen, bedek de zaailingen met filterpapier, en sluit de plaat met Micropore tape. Bewaar de getransformeerde tomatenzaailingen zes tot zeven dagen in een groeikamer bij een temperatuur tussen de 25 en 28 graden Celsius.Gebruik dan een steriele scalpel om de nieuwe opkomende harige wortels te knippen en laat de zaailingen nieuwe harige wortels produceren. Zodra de tweede generatie van nieuwe harige wortels verschijnt, verwijder het filterpapier op de top van de zaailingen, en verzegel de plaat met Micropore tape opnieuw. Om DsRed fluorescentie of andere apparatuur voor plant in vivo beeldvorming te visualiseren, markeer de positieve getransformeerde wortels, die kunnen worden geïdentificeerd door de rode fluorescentie.Gebruik een scalpel om de negatieve niet-getransformeerde wortels te verwijderen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun gebrek aan rode fluorescentie. Breng de zaailingen die rode fluorescentie vertonen over naar een nieuwe plaat met halfsterkte Murashige en Skoog medium om de ontwikkeling van de getransformeerde wortel als hoofdwortel te vergemakkelijken. Houd de zaailingen die geen rode fluorescentie vertonen in dezelfde plaat om de opkomst van fluorescerende wortels in latere tijdstippen te controleren.Bedek de zaailingen met een twee centimeter-bij-vier centimeter halve cirkel filter papier, verzegel de plaat, en broeden de zaailingen om ze te laten ontwikkelen nieuwe harige wortels. Bereid de inentingpotten waar het oppervlak van de wortels zal worden blootgesteld aan de bacteriële entmateriaal door eerst weken de inenting potten met water, gieten uit overtollig water, en vervolgens het plaatsen van hen in een plastic plantbak. Breng met behulp van een pincet de geselecteerde zaailingen met getransformeerde wortels over naar de inentingspotten.Bedek de lade met plastic folie of een transparant deksel, en houd ze op 25 tot 28 graden Celsius met 65% vochtigheid. Verwijder het deksel na vijf of zes dagen. Kweek Ralstonia in vijf LB vloeibaar medium in een orbitale shaker bij 28 graden Celsius, met schudden bij 200 rpm, tot de stationaire fase.Meet de optische dichtheid op 600 nanometer om de bacteriële getallen te bepalen. Verdun de bacteriële cultuur met water tot een OD600 van 1. Plaats 16 tot 20 inentingspotten die omgevormde tomatenplanten bevatten in een inentingslade.Giet vervolgens 300 milliliter verdund bacterieel en in de lade en laat de planten 20 minuten in het entmateriaal weken. Bereid hierna een nieuwe lade met een laag potgrond. Verplaats de ingeënte potten in de nieuwe lade en plaats de trays in een groeikamer met een luchtvochtigheid van 75%, een temperatuur tussen 26 en 28 graden Celsius en een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur duisternis.Hier worden tomatenwortels getransformeerd en ingeënt met Ralstonia om eenvoudige genetische analyse uit te voeren voor de studie van bacteriële verwelkingsziekte. De ontwikkeling van ziektesymptomen wordt bijgehouden in tomatenplanten met wortels getransformeerd met een lege vector en die getransformeerd met een RAI constructie gericht op tomaat CESA6. De ziekte-index gegevens worden verzameld uit dezelfde experimentele eenheid in de tijd volgens een willekeurige schaal van nul tot vier en niet volgen een Gaussische distributie, het uitsluiten van het gebruik van standaardtests voor parametrische gegevens.Als standaardbenadering wordt een U Mann-Whitney, tweestaartige, niet-parametrische test gebruikt om zowel de controle- als infectiecurven te vergelijken. Volgens deze analyse lijkt het verschil tussen de medianen van beide krommen niet significant te zijn. Het is ook mogelijk om het gebied onder de progressiecurve van de ziekte te kwantificeren, waardoor meerdere waarnemingen van de vooruitgang van de ziekte kunnen worden gecombineerd tot één waarde.Het gebied onder de ziekte voortgangscurve toont een hogere waarde voor controleplanten in vergelijking met tomaat CESA6 RNAi planten aan het einde van het infectieproces, wat aangeeft dat tomaat CESA6-zwijgende planten zijn beter bestand tegen Ralstonia infectie dan controleplanten. Betrouwbaarheidsintervallen bieden een manier om, met grote waarschijnlijkheid, een reeks waarden te schatten waarin de bevolkingswaarde van een bepaalde variabele wordt gevonden. Zoals hier te zien, het gebied van de 95%betrouwbaarheid interval voor de controle en infectie curven schatten een hogere kans op weerstand wanneer CESA6 wordt gedempt.Ziekte-indexwaarden kunnen worden omgezet in binaire gegevens, rekening houdend met een ziekte-index lager dan twee die overeenkomt met nul en een ziekte-index gelijk aan of hoger dan twee die overeenkomen met een. Dit maakt de vertegenwoordiging van een overlevingscurve na Ralstonia inenting mogelijk. De verschillen in de overlevingskans tussen de controle en de besmette planten zijn niet statistisch significant volgens de Gehan-Breslow-Wilcoxon statistische test.De expressie van CESA6 wordt vervolgens geanalyseerd in twee willekeurig geselecteerde getransformeerde wortels voor de inentingsstap, waaruit blijkt dat de verbeterde weerstand tegen Ralstonia correleert met de verminderde expressie van CESA6. Na twee selectierondes kan een transformatiepercentage van 35 tot 40% worden verkregen en deze waarde kan worden verhoogd door extra selectierondes uit te voeren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de zaailingen bedekt te houden met een stuk filterpapier om een hoge luchtvochtigheid te behouden en om de platen te verzegelen met Micropore om gasuitwisseling te garanderen.Na de worteltransformatie kunnen veel van de behandelingen worden toegepast om de plantrespons te bestuderen door observatie van wortelfysiologie of het gebruik van moleculaire biologie, celbiologie of biochemie. Voornamelijk zal deze techniek onderzoekers met beperkte middelen in staat stellen om genetische analyse van bacteriële infectie in tomatenwortels uit te voeren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation Sequencing en Bioinformatics pijpleiding om te evalueren van genetische determinanten van constitutionele ziekte gericht

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...