Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
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우리는 유용한 토론에 대한 마초 실험실의 모든 실험실 구성원, 통계 적 조언 알바로 로페즈 - 가르시아, 이 작업 중에 기술 및 관리 지원을 위한 신유 지안에게 감사드립니다. 우리는 형광 이미징에 대한 지원을 위한 PSC 세포 생물학 핵심 시설에 감사드립니다 이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (부여 XDB27040204), 식물 스트레스 생물학을위한 상하이 센터 (중국어)에 의해 지원되었습니다. 과학 아카데미) 및 중국 1000 인재 프로그램.

참고 :이 방법의 중요한 부분은 시험관에서 식물 재료를 처리하는 것을 포함, 따라서 DsRed 형광의 시각화를 포함하여 이러한 모든 절차 동안 멸균 조건을 유지하는 것이 중요하다. 모든 변형 과정에서 토마토 모종은 25-28 °C 및 16 h /8 h /8 빛 / 어두운 (130 μmol 광자 m-2s-1 빛)에서 자랍니다. 플레이트는 가스 교환 및 증발을 용이하게하기 위해 마이크로 포어 테이프로 밀봉...

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	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

랄스토니아 솔라나세아룸은 농업에 중요한 위협이 됩니다. 그러나, 농업 중요성의 자연 호스트와의 상호 작용은 여전히 제대로 다른 세균성 병원 체에 비해 이해, 특히 작물 식물 종에. 대부분의 경우, 유전 분석은 호스트 식물을 유전적으로 수정하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해됩니다. 이러한 문제를 해결하고 토마토에 있는 R. solanacearum 감염의 유전 분석을 용이하게 하기 ?...

Ralstonia solanacearum,세균성 wilt 질병의 인과 에이전트는, 감자, 토마토, 담배, 바나나, 후추 및 가지를 포함하여 식물 종의 큰 범위를 감염시킬 수 있는 세계적인 분포를 가진 파괴적인 토양 품어진 혈관 병원체, 그 외의 사이에서1,,2. 랄스토니아에 의한 수율 손실은 품종, 기후, 토양 및 기타 요인에 따라 토마토, 감자 또는 바나나생산의 80-90 %에 도달 할 수 있습니다3. 그러나, 랄스토니아 모델은 슈도모나스 주사기 또는 산토모나스 종과같은 세균성 식물 병원균을 포함하는 다른 모델과 비교하여 상당히 미개척이다. 추가적으로, 식물 미생물 상호 작용에 있는 대부분의 연구 결과는 모델 식물 애기장대 탈리아나에 집중됩니다. 비록 이러한 모델을 사용 하 여 연구는 크게 식물-박테리아 상호 작용의 우리의 이해에 기여, 그들은 작물 식물에서 이러한 상호 작용을 이해 하는 현재 필요성을 해결 하지 않습니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 특히, 랄스토니아의천연 숙주인 토마토는 전 세계적으로 두 번째로 중요한 채소 작물이며 세균성 질병을 포함한 과다한 질병4의영향을 받습니다. 이 작품에서, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전자 분석을 수행하는 쉬운 방법을 개발했다. 이 방법은 Agrobacterium 뿌리 줄기-중재 된 토마토 뿌리의 매개 형질에 기초하여, 선택 마커5로DsRed 형광을 사용하여, 그 결과 식물의 랄스토니아 토양 흠뻑 접종, 관심의 구성을 표현하는 변형 뿌리를 포함. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다.
이 방법의 잠재적 제한은 변형되지 않은 뿌리의 잔류 성장에 있습니다. 이것은 플라스미드가 사용된 경우에 특히 중요합니다 형질전환된 뿌리의 선택을 허용하는 리포터 유전자가 결여됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 건강한 항생제 내성 형질전환 뿌리의 성장을 허용하면서 비 형질전환 뿌리의 성장을 억제하는 항생제 선택에 기초한 대체 방법을 개발했습니다. A. 뿌리 줄기 유전자는 싹의 변형을 유발하지 않기 때문에 항생제에 취약하므로 항생제 함유 배지와 분리되어 보관해야합니다.
랄스토아에 대한 식물 저항이 잘 이해되지 않지만, 여러 보고서는 세균 윌트6,7,7,8,,9에대한 향상된 저항에 세포벽 변경을 연관시켰습니다. 이러한 세포벽 변경이 혈관 발달에 영향을 미친다는 것이 제안되었으며, 이는 식물10내부의 랄스토니아 의 생활 방식에 필수적인 측면입니다. 애기장대에서 셀룰로오스 synthases CESA4, CESA7 및 CESA8을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 이차 세포벽 무결성을 손상시키는 것으로 나타났으며, 이는 ABA신호8에연결된 것으로 보이는 랄스토니아에대한 향상된 저항성을 유발한다. 따라서, 우리의 방법에 대한 개념의 증거로, 우리는 SlCESA6의 RNAi 매개 유전자 침묵(Solyc02g072240),이차 세포 벽 셀룰로오스 synthase, 및 AtCESA8의 직교(At4g18780)를수행했다. 랄스토니아와 후속 토양 흠뻑 접종은 SlCESA6 침묵 세균성 시류 증상에 대한 저항을 강화 것으로 나타났다, 랄스토니아에 세포 벽 매개 저항가능성이 토마토에 보존 제안, 토마토 뿌리에서 세균 윌트 저항의 유전자 분석을 수행하는 우리의 방법을 검증. 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

랄스토니아 솔라나세아룸은 광범위한 식물 종을 감염시켜 농업에 중요한 위협을 야기할 수 있는 파괴적인 토양 매개 혈관 병원체입니다. 그러나, Ralstonia 모형은 애기장대에있는 슈도모나스 주사기와 같은 세균성 식물 병원체를 관련시키는 그밖 모형에 비해 상당히 미개척입니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 네이티브 호스트 식물에서 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 이 시나리오에서는, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전 분석을 수행하는 방법을 개발했다, 랄스토니아의자연 호스트. 이 방법은 아그로박테리움 뿌리줄기-매개형질전환, 그 다음에 생성된 식물의 랄스토니아 토양-흠뻑 적시성 접종, 관심의 구성을 표현하는 형질전환 뿌리를 함유한다. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다. 개념의 증거로, 우리는 RNAi 매개 토마토 뿌리에서 SlCESA6의 침묵이 랄스토니아에저항을 부여 것을 보여주기 위해이 방법을 사용 . 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.

도 5는 SlCESA6(Solyc02g07240)를 대상으로 RNAi 시공체로 SlCESA6 변형된 뿌리를Solyc02g072240빈 벡터(EV)로 변형시킨 뿌리를 가진 토마토 식물의 질병 증상의 발달을 나타낸다. 질병 지수데이터(도5A)는0에서 4까지의 임의의 척도에 따라 시간에 따라 동일한 실험 단위(각 식물)로부터 수집되며, 가우시안 분포를 따?...

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Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

여기에서, 우리는 세균성 wilt 질병의 연구 연구를 위한 간단한 유전 분석을 능력을 발휘하기 위하여 랄스토니아 solanacearum를 가진 접종에 선행된 토마토 뿌리 변환을 위한 다재다능한 방법을 제시합니다.

세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

이 프로토콜은 과학자들이 토마토에서 세균성 wilt 질병의 간단한 유전 분석을 수행 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 및 후속 검사의 조작이 단기간에 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 수행 될 수 있다는 것입니다. 이것은 방법이 매우 다재다능하며 병원체 접종 및 기타 생리적 검사를 수행하기 위해 다른 작물 식물에 적용 될 수 있습니다.체외에서 모종을 조작하는 동안 멸균을 유지하기 위해, 그들은 흐름 후드 의 외부에있을 때 플레이트를 닫아 유지하는 것이 중요하다. 이것은 쉬운 기술이지만 조작을 위해 여러 단계가 필요합니다. 이 방법의 시각화는 원고에서 설명하기 어려운 작은 트릭을 보는 데 도움이 될 것입니다, 자신의 실험실에서 방법을 구현하는 다른 연구자 도움.이 절차를 입증하는 데 도움이 아헨 자오, 대학원생이 될 것입니다. 토마토 씨를 살균하고 세척한 후, 자당없이 반강도 무라시게와 스쿠그 배지로 옮긴다. 3 일 동안 25 ~28도 사이의 온도에서 어둠 속에서 씨앗을 유지합니다.반강도 무라시게와 스쿠그 매체가 포함된 9평방센티미터 페트리 접시 안에 오토클레이브 8.5평방센티미터 의 필터를 놓고 각 접시에 발아 토마토 씨앗 6개를 놓습니다. 마이크로포어 테이프로 접시를 밀봉하고 발아 씨앗을 3~4일 동안 섭씨 25~28도에서 배양합니다. 식물 변환 전에 섭씨 28도에서 2 일 동안 적절한 항생제로 고체 LB 배지에서 Agrobacterium rhizogenes MSU440을 성장하십시오.멸균 메스를 사용하여 토마토 모종의 고체 코틸의 방광과 바닥을 자른다. 플라스틱 팁이나 메스 블레이드를 사용하여 LB 배지 표면에서 A.rhizogenes 바이오매스를 수확하고 박테리아 바이오 매스에서 잘라낸 토마토 묘목을 조심스럽게 담급하십시오. 그 후, 높은 습도를 유지하고 생존과 새로운 뿌리 개발을 용이하게하기 위해 2 센티미터 4 센티미터 반원형 필터 용지와 토마토 묘목을 커버.모종을 고습도 유지하게 하는 환경의 경우 발생이 가능합니다. 이렇게 하려면 모종을 필터 용지로 덮고 마이크로포어 테이프로 플레이트를 닫습니다. 변형된 토마토 묘목을 섭씨 25~28도의 온도로 성장 챔버에 6~7일 동안 보관하십시오.그런 다음 멸균 메스를 사용하여 새로운 털이 많은 뿌리를 자르고 모종이 새로운 털이 많은 뿌리를 생성 할 수 있게합니다. 새로운 털이 뿌리의 2 세대가 나타나면, 묘목 위에 필터 종이를 제거하고 다시 마이크로 포어 테이프로 접시를 밀봉. DsRed 형광 또는 생체 내 이미징 내 식물을 위한 다른 장비를 시각화하려면 적색 형광으로 식별 될 수있는 긍정적 인 변형 뿌리를 표시하십시오.메스를 사용하여 적색 형광의 부족으로 식별 될 수있는 부정적인 비 변형 뿌리를 제거하십시오. 변형된 뿌리의 개발을 용이하게 하기 위해 반강도 무라시게및 스쿠그 배지를 포함하는 새로운 플레이트에 적색 형광을 보이는 묘목을 전달한다. 같은 접시에 적색 형광이 나타나지 않는 묘목을 유지하여 나중에 형광 뿌리의 출현을 확인하십시오.모종을 2센티미터/4센티미터 반원 필터 용지로 덮고, 접시를 밀봉하고, 모종을 배양하여 새로운 털이 많은 뿌리를 개발합니다. 뿌리의 표면이 먼저 물로 접종 냄비를 담그고, 여분의 물을 부어 플라스틱 심기 트레이에 놓음으로써 뿌리의 표면이 세균 접종에 노출될 예방 접종 냄비를 준비하십시오. 핀셋을 사용하여 선택한 묘목을 변형된 뿌리로 접종 냄비로 옮킵니다.트레이를 플라스틱 랩이나 투명 뚜껑으로 덮고 습도가 65%인 섭씨 25~28도까지 유지하십시오. 5~6일 후에 덮개를 제거합니다. 궤도 셰이커에서 5LB 액체 배지에서 랄스토니아를 성장, 200 rpm에서 흔들어, 고정 된 단계까지.600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 세균 수를 결정합니다. 1의 OD600에 물로 세균 배양을 희석. 변형된 토마토 식물을 포함하는 16-20개의 접종 냄비를 접종 트레이에 넣습니다.그런 다음 300 밀리리터의 희석된 세균 접종을 트레이에 붓고 식물이 20 분 동안 접종에 담글 수 있게합니다. 그 후, 포팅 토양의 층으로 새로운 트레이를 준비합니다. 접종된 냄비를 새 트레이에 넣고 75%의 습도, 섭씨 26~28도 사이의 온도, 12시간의 빛과 12시간의 어둠의 광기간을 가진 성장 챔버에 트레이를 놓습니다.여기서 토마토 뿌리는 성모세포와 함께 변형되고 접종되어 세균성 위트 질환 연구를 위한 간단한 유전자 분석을 수행합니다. 질병 현상의 발달은 빈 벡터로 변형된 뿌리와 토마토 CESA6를 표적으로 하는 RAI 구조로 변형된 그 와 토마토 식물에서 추적됩니다. 질병 지수 데이터는 0에서 4까지 임의의 척도에 따라 시간이 지남에 따라 동일한 실험 단위에서 수집되며 가우시안 분포를 따르지 않으며 파라메트릭 데이터에 대한 표준 테스트의 사용을 배제합니다.표준 접근법으로, U Mann-Whitney, 두 꼬리, 비 파라메트릭 테스트가 사용되어 제어 및 감염 곡선을 모두 비교합니다. 이 분석에 따르면 두 곡선의 중앙값 간의 차이는 중요하지 않은 것으로 보입니다. 또한 질병 진행 곡선 하에서 영역을 정량화할 수 있으며, 이는 질병의 여러 관측을 단일 값으로 결합할 수 있다.질병 진행 곡선 아래 영역은 감염 과정의 끝에 토마토 CESA6 RNAi 식물에 비해 제어 식물에 대한 높은 가치를 보여줍니다, 토마토 CESA6 침묵 식물은 제어 식물보다 랄스토니아 감염에 더 저항한다는 것을 나타내는. 신뢰 도면은 지정된 변수의 모집단 값이 발견되는 값의 범위가 높을 확률이 높은 예측 방법을 제공합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 제어 및 감염 곡선에 대한 95% 신뢰 구간의 영역은 CESA6이 침묵할 때 저항의 더 높은 확률을 추정합니다.질병 지수 값은 0에 해당하는 2개 미만의 질병 지수와 질병에 해당하는 2개 이상의 질병 지수를 고려하여 이진 데이터로 변환될 수 있으며, 질병 지수가 하나에 해당하는 2개 이상입니다. 이를 통해 랄스토니아 접종 후 생존 곡선을 나타낼 수 있습니다. 게한 브레슬로-윌콕슨 통계 시험에 따르면 대조군과 감염된 식물 간의 생존율 차이는 통계적으로 유의하지 않다.CESA6의 발현은 접종 단계 전에 무작위로 선택된 두 개의 변형된 뿌리로 분석되어 Ralstonia에 대한 강화된 저항이 CESA6의 감소된 발현과 상관관계가 있음을 보여준다. 두 번의 선택 후에는 35~40%의 변환 율을 얻을 수 있으며, 추가 선택 라운드를 수행하여 이 값을 높일 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 높은 습도를 유지하고 가스 교환을 보장하기 위해 마이크로 포어로 플레이트를 밀봉하기 위해 필터 종이 조각으로 덮여 묘목을 유지하는 것이 중요합니다.루트 변환 후, 많은 치료법이 뿌리 생리학의 관찰 또는 분자 생물학, 세포 생물학 또는 생화학을 사용하여 식물 반응을 연구하기 위해 적용될 수 있다. 주로,이 기술은 제한된 자원을 가진 연구원이 토마토 뿌리에 있는 세균성 감염의 유전 분석을 능력을 발휘할 수 있게 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

연구

유전학

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...