Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Vi takker alle laboratoriemedlemmer av Macho-laboratoriet for nyttige diskusjoner, Alvaro López-García for statistisk rådgivning, og Xinyu Jian for teknisk og administrativ hjelp under dette arbeidet. Vi takker KJERNEanlegget for PSC Cell Biology for hjelp med fluorescensavbildning Dette arbeidet ble støttet av Strategic Priority Research Program for det kinesiske vitenskapsakademiet (gi XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (kinesisk Academy of Sciences) og det kinesiske 1000 Talents-programmet.

MERK: Viktige deler av denne metoden innebærer håndtering av plantematerialer in vitro, og derfor er det viktig å holde sterile forhold under alle disse prosedyrene, inkludert visualisering av DsRed fluorescens. Under hele transformasjonsprosessen vokser tomatfrøplanter ved 25-28 °C og 16 timer/8 timer lys/mørk (130 μmolfotoner m-2s-1 lys). Platene er forseglet med mikroporetape for å lette gassutveksling og transpirasjon.
1. Utarbeidelse av tomatp...

<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum utgjør en viktig trussel mot landbruket; Men samspillet med naturlige verter av landbruksbetydning er fortsatt dårlig forstått sammenlignet med andre bakterielle patogener, spesielt i planteplantearter. I de fleste tilfeller er genetisk analyse hindret av tid og utgifter som kreves for å genetisk modifisere vertsplanter. For å løse dette problemet og lette genetisk analyse av R. solanacearum infeksjon i tomat, har vi utviklet en enkel metode basert på Agrobacterium rhiz...

Ralstonia solanacearum, årsaksmidlet av bakteriell wilt sykdom, er et ødeleggende jordbåren vaskulær patogen med en verdensomspennende fordeling som kan infisere et stort utvalg av plantearter, inkludert potet, tomat, tobakk, banan, pepper og aubergine, blant annet1,2. Yield tap forårsaket av Ralstonia kan nå 80-90% av produksjonen i tomat, potet eller banan, avhengig av sort, klima, jord og andre faktorer3. Ralstonia-modellen er imidlertid betydelig underutforsket i forhold til andre modeller som involverer bakterielle plantepatogener, for eksempel Pseudomonas syringae eller Xanthomonas spp. I tillegg er de fleste studier i plantemikrobeinteraksjoner fokusert på modellanlegget Arabidopsis thaliana. Selv om forskning ved hjelp av disse modellene i stor grad har bidratt til vår forståelse av plantebakterier interaksjoner, de ikke ta opp dagens nødvendighet for å forstå disse interaksjonene i avlingplanter. Forskning rettet mot å forstå samspillet mellom Ralstonia og avlingsanlegg er avgjørende for å utvikle bærekraftige løsninger for å bekjempe bakteriell wilt sykdom, men er for tiden hindret av mangel på enkle eksperimentelle analyser for å karakterisere de ulike komponentene i samspillet. Spesielt tomat, en naturlig vert for Ralstonia, er den nest viktigste vegetabilske avlingen over hele verden og påvirkes av en mengde sykdommer4, inkludert bakteriell wilt sykdom. I dette arbeidet har vi utviklet en enkel metode for å utføre genetisk analyse av Ralstonia infeksjon av tomat. Denne metoden er basert på Agrobacterium rhizogenes-mediert transformasjon av tomatrøtter, ved hjelp av DsRed fluorescens som utvalgsmarkør5, etterfulgt av Ralstonia jord-drenching inokulasjon av de resulterende plantene, som inneholder forvandlede røtter som uttrykker konstruksjonen av interesse. Allsidigheten til rottransformasjonsanalysen gjør det mulig å utføre enten genoveruttrykk eller gendeaktivering mediert av RNAi.
En potensiell begrensning av denne metoden består på gjenværende vekst av ikke-forvandlede røtter. Dette er spesielt viktig i de tilfellene hvor plasmidbrukt mangler et reportergen som gjør det mulig å velge transformerte røtter. For å løse dette problemet har vi utviklet en alternativ metode basert på antibiotikavalg, som hemmer veksten av ikke-forvandlede røtter samtidig som veksten av sunne antibiotikaresistente forvandlede røtter. Siden A. rhizogenes ikke induserer transformasjonen av skudd, er de utsatt for antibiotika, og derfor bør de holdes atskilt fra det antibiotikaholdige mediet.
Selv om plantemotstand mot Ralstonia ikke er godt forstått, har flere rapporter tilhørende celleveggendringer til økt motstand mot bakteriell wilt6,7,8,9. Det har blitt foreslått at disse celleveggendringene påvirker vaskulær utvikling, et viktig aspekt for livsstilen til Ralstonia inne i anlegget10. Mutasjoner i gener som koder cellulosesynthasene CESA4, CESA7 og CESA8 i Arabidopsis thaliana har vist seg å svekke sekundær celleveggintegritet, noe som forårsaker økt motstand mot Ralstonia, som synes å være knyttet til ABA-signalering8. Derfor, som et bevis på konseptet for vår metode, utførte vi RNAi-mediert gendeaktivering av SlCESA6 (Solyc02g072240), en sekundær celleveggcellulose synthase, og ortholog av AtCESA8 (At4g18780). Påfølgende jord-drenching inokulasjon med Ralstonia viste at deaktivering Av SlCESA6 forbedret motstand mot bakterielle wilt symptomer, noe som tyder på at celle veggmediert motstand mot Ralstonia er sannsynlig bevart i tomat, og validere vår metode for å utføre genetisk analyse av bakteriell wilt resistens i tomat røtter. Her beskriver vi denne metoden i detalj, slik at genetiske tilnærminger til å forstå bakteriell wilt sykdom på relativt kort tid og med små krav til utstyr og plantevekstplass.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum er et ødeleggende jordbåren vaskulært patogen som kan infisere et stort utvalg av plantearter, noe som forårsaker en viktig trussel mot landbruket. Ralstonia-modellen er imidlertid betydelig underutforsket i forhold til andre modeller som involverer bakterielle plantepatogener, som Pseudomonas syringae i Arabidopsis. Forskning rettet mot å forstå samspillet mellom Ralstonia og avlingsanlegg er avgjørende for å utvikle bærekraftige løsninger for å bekjempe bakteriell wilt sykdom, men er for tiden hindret av mangel på enkle eksperimentelle analyser for å karakterisere de ulike komponentene i samspillet i innfødte vertsplanter. I dette scenariet har vi utviklet en metode for å utføre genetisk analyse av Ralstonia infeksjon av tomat, en naturlig vert for Ralstonia. Denne metoden er basert på Agrobacterium rhizogenes-mediert transformasjon av tomatrøtter, etterfulgt av Ralstonia jord-drenching inokulasjon av de resulterende plantene, som inneholder forvandlede røtter som uttrykker konstruksjonen av interesse. Allsidigheten til rottransformasjonsanalysen gjør det mulig å utføre enten genoveruttrykk eller gendeaktivering mediert av RNAi. Som et konseptbevis brukte vi denne metoden til å vise at RNAi-mediert deaktivering av SlCESA6 i tomatrøtter ga motstand mot Ralstonia. Her beskriver vi denne metoden i detalj, slik at genetiske tilnærminger til å forstå bakteriell wilt sykdom på relativt kort tid og med små krav til utstyr og plantevekstplass.

Figur 5 viser utviklingen av sykdomssymptomer på tomatplanter med røtter forvandlet med en tom vektor (EV), og planter med røtter forvandlet med en RNAi-konstruksjon rettet mot SlCESA6 (Solyc02g072240). Sykdomsindeksdataene (Figur 5A) samles inn fra samme eksperimentelle enhet (hvert anlegg) over tid i henhold til en vilkårlig skala fra 0 til 4, og følger ikke en gaussisk fordeling, og utel...

Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Her presenterer vi en allsidig metode for tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia solanacearum for å utføre enkel genetisk analyse for studiet av bakteriell wilt sykdom.

Tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia Solanacearum for enkel genetisk analyse av bakteriell wiltsykdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Denne protokollen er betydelig fordi det tillater forskere å utføre enkel genetisk analyse av bakteriell wilt sykdom i tomat. Den største fordelen med denne teknikken er at manipulering av genuttrykk og påfølgende analyser kan utføres på kort tid og med de små kravene til utstyr og plantevekstplass. Dette er metoden er svært allsidig, og den kan brukes på andre avlingsplanter for å utføre både patogen inokulasjon og andre fysiologiske analyser.For å opprettholde steriliteten under manipulering av frøplanter in vitro, er det viktig å holde platene lukket når de er utenfor strømningshetten. Dette er en enkel teknikk, men det krever flere trinn for manipulasjon. Visualiseringen av denne metoden vil bidra til å se små triks som er vanskelige å forklare i manuskriptet, og hjelper andre forskere til å implementere metoden i sine laboratorier.Å bidra til å demonstrere denne prosedyren vil være Achen Zhao, en utdannet student. Etter sterilisering og vasking av tomatfrøene, overfør dem til halvfast Murashige og Skoog medium uten sukrose. Hold frøene i mørket ved en temperatur mellom 25 og 28 grader Celsius i tre dager.Plasser autoklaverte 8,5 kvadratcentimeter filtre inne i ni kvadratcentimeter Petri-retter som inneholder halvfast Murashige og Skoog medium, og legg seks spirede tomatfrø på hver tallerken. Forsegle platen med Micropore tape, og inkuber de spirede frøene ved 25 til 28 grader Celsius i tre til fire dager. Vokse Agrobacterium rhizogenes MSU440 i solid LB medium med passende antibiotika i to dager ved 28 grader Celsius før anlegget transformasjon.Bruk en steril skalpell, kutt radikkelen og bunnen av hypocotyl av tomatplanter. Bruk plastspisser eller et skalpellblad for å høste biomassen A.rhizogenes fra overflaten av LB-mediet, og dypp forsiktig de kuttede tomatplantene i bakteriebiomassen. Etter dette dekker du tomatplantene med et to centimeter-med-fire centimeter halvsirkelformet filterpapir for å holde høy luftfuktighet og lette overlevelse og ny rotutvikling.Det er viktig å holde plantene i høy luftfuktighet i et miljø som tillater transpirasjon. For å gjøre dette, dekk plantene med filterpapir, og lukk platen med Micropore tape. Oppbevar de forvandlede tomatplantene i seks til syv dager i et vekstkammer ved en temperatur mellom 25 og 28 grader Celsius.Bruk deretter en steril skalpell for å kutte de nye nye hårete røttene, og la plantene produsere nye hårete røtter. Når den andre generasjonen av nye hårete røtter vises, fjern filterpapiret på toppen av plantene, og forsegle platen med Micropore tape igjen. For å visualisere DsRed fluorescens eller annet utstyr for anlegg in vivo imaging, markere de positive forvandlede røttene, som kan identifiseres ved den røde fluorescens.Bruk en skalpell for å fjerne de negative ikke-forvandlede røttene, som kan identifiseres ved deres mangel på rød fluorescens. Overfør plantene som viser rød fluorescens til en ny plate som inneholder halvfast Murashige og Skoog medium for å lette utviklingen av den forvandlede roten som hovedroten. Hold plantene som ikke viser rød fluorescens i samme plate for å sjekke fremveksten av fluorescerende røtter i senere tidspunkter.Dekk plantene med et to centimeter-av-fire centimeter halvsirkelfilterpapir, forsegle platen og inkuber plantene for å la dem utvikle nye hårete røtter. Forbered inokulasjonspottene hvor overflaten av røttene vil bli utsatt for bakteriell inokulering ved først å slikke inokulasjonspottene med vann, helle av overflødig vann og deretter plassere dem i et plastplantingsbrett. Ved hjelp av pinsett, overfør de valgte plantene med forvandlede røtter til inokulasjonspottene.Dekk brettet med plastfolie eller et gjennomsiktig lokk, og hold dem på 25 til 28 grader Celsius med 65% fuktighet. Fjern dekselet etter fem eller seks dager. Grow Ralstonia i fem LB flytende medium i en orbital shaker på 28 grader Celsius, med risting på 200 rpm, til den stasjonære fasen.Mål den optiske tettheten ved 600 nanometer for å bestemme bakterietallene. Fortynn bakteriekulturen med vann til en OD600 av 1. Plasser 16 til 20 inokulasjonspotter som inneholder forvandlede tomatplanter til et inokulasjonsbrett.Hell deretter 300 milliliter fortynnet bakteriell inokus i skuffen, og la plantene suge i inokulumet i 20 minutter. Etter dette, forberede en ny skuff med et lag av potting jord. Flytt de vaksinerte pottene inn i det nye brettet, og legg brettene i et vekstkammer med 75% fuktighet, en temperatur mellom 26 og 28 grader Celsius, og en fotoperiode på 12 timer med lys og 12 timer med mørke.Her blir tomatrøtter forvandlet og inokulert med Ralstonia for å utføre enkel genetisk analyse for studiet av bakteriell wilt sykdom. Utviklingen av sykdomssymptomer spores i tomatplanter med røtter forvandlet med en tom vektor og de som er forvandlet med en RAI-konstruksjon rettet mot tomat CESA6. Sykdomsindeksdataene samles inn fra samme eksperimentelle enhet over tid i henhold til en vilkårlig skala fra null til fire og følger ikke en gaussisk fordeling, og utelukker bruk av standardtester for parametriske data.Som en standard tilnærming brukes en U Mann-Whitney, to-tailed, ikke-parametrisk test for å sammenligne både kontroll- og infeksjonskurvene. Ifølge denne analysen ser forskjellen mellom medianene i begge kurvene ut til å være ikke signifikant. Det er også mulig å kvantifisere området under sykdomsprogresjonskurven, noe som gjør det mulig å kombinere flere observasjoner av sykdomsfremgang til en enkelt verdi.Området under sykdomsprogresjonskurven viser en høyere verdi for kontrollplanter sammenlignet med tomat CESA6 RNAi-planter på slutten av infeksjonsprosessen, noe som indikerer at tomat CESA6-stilnede planter er mer motstandsdyktige mot Ralstonia-infeksjon enn kontrollanlegg. Konfidensintervaller gir en måte å estimere, med høy sannsynlighet, et verdiområde der befolkningsverdien til en gitt variabel er funnet. Som sett her, området av 95% konfidensintervall for kontroll og infeksjon kurver anslå en høyere sjanse for motstand når CESA6 er dempet.Sykdomsindeksverdier kan forvandles til binære data, med tanke på en sykdomsindeks lavere enn to som tilsvarer null og en sykdomsindeks lik eller høyere enn to tilsvarende en. Dette gjør det mulig å fremse en overlevelseskurve etter Ralstonia inokulasjon. Forskjellene i overlevelsesraten mellom kontrollen og de infiserte plantene er ikke statistisk signifikante i henhold til gehan-Breslow-Wilcoxon statistisk test.Uttrykket for CESA6 analyseres deretter i to tilfeldig utvalgte transformerte røtter før inokulasjonstrinnet, noe som viser at den forbedrede motstanden mot Ralstonia korrelerer med det reduserte uttrykket for CESA6. Etter to runder med valg kan en transformasjonshastighet på 35 til 40 %oppnås, og denne verdien kan økes ved å utføre flere valgrunder. Mens du utfører denne prosedyren, er det viktig å holde plantene dekket med et stykke filterpapir for å opprettholde høy luftfuktighet og forsegle platene med Micropore for å sikre gassutveksling.Etter rottransformasjonen kan mange av behandlingene brukes til å studere planteresponsen ved observasjon av rotfysiologi eller ved hjelp av molekylærbiologi, cellebiologi eller biokjemi. Hovedsakelig vil denne teknikken tillate forskere med begrensede ressurser til å utføre genetisk analyse av bakteriell infeksjon i tomatrøtter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisering og sammenligningsanalyse av organellar DNA-berigelsesmetoder som er egnet for neste generasjons sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Neste generasjons sekvensering og bioinformatikk rørledning for å evaluere genetisk determinanter av konstitusjonelle sykdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten Gene Testing i klinisk Kohortstudier multiplex genotyperingteknologi og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartlegging av Thermotolerance forskjeller mellom arter av Saccharomyces gjær via Genova-bredt gjensidige Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...