Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
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Agradecemos a todos os membros do laboratório macho por discussões úteis, Alvaro López-García por aconselhamento estatístico, e Xinyu Jian por assistência técnica e administrativa durante este trabalho. Agradecemos ao núcleo de Biologia Celular do PSC pela assistência com imagens de fluorescência Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (bolsa XDB27040204), o Centro de Biologia do Estresse Vegetal de Xangai (chinês Academia de Ciências) e o programa chinês 1000 Talentos.

NOTA: Partes importantes deste método envolvem o manuseio de materiais vegetais in vitro e, portanto, é importante manter condições estéreis durante todos esses procedimentos, incluindo a visualização da fluorescência DsRed. Durante todo o processo de transformação, as mudas de tomate crescem a 25-28 °C e 16 h/8 h claro/escuro (130 μmol fótons m-2s-1 luz). As placas são seladas com fita microporos a fim de facilitar a troca e transpiração gasosa.
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<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum representa uma ameaça importante para a agricultura; no entanto, sua interação com hospedeiros naturais de importância agrícola ainda é pouco compreendida em comparação com outros patógenos bacterianos, especialmente em espécies de plantas agrícolas. Na maioria dos casos, a análise genética é dificultada pelo tempo e gastos necessários para modificar geneticamente plantas hospedeiras. Para enfrentar esse problema e facilitar a análise genética da infecção por R. sola...

Ralstonia solanacearum, o agente causal da doença da murcha bacteriana, é um patógeno vascular devastador do solo com uma distribuição mundial que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, incluindo batata, tomate, tabaco, banana, pimenta e berinjela, entre outras1,2. As perdas de rendimento causadas pela Ralstonia podem chegar a 80-90% da produção em tomate, batata ou banana, dependendo da cultivar, clima, solo e outros fatores3. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos de plantas bacterianas, tais como Pseudomonas singae ou Xanthomonas spp. Além disso, a maioria dos estudos em interações entre plantas e micróbios está focada na planta modelo Arabidopsis thaliana. Embora a pesquisa que utiliza esses modelos tenha contribuído em grande parte para a nossa compreensão das interações entre plantas e bactérias, elas não abordam a necessidade atual de entender essas interações nas plantas agrícolas. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação. Particularmente, o tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia,é a segunda cultura vegetal mais importante do mundo e é afetado por uma infinidade de doenças4, incluindo a doença de murcha bacteriana. Neste trabalho, desenvolvemos um método fácil para realizar análisegenética da infecção por Ralstonia do tomate. Este método baseia-se na transformação mediada de raízes de tomate da Agrobacterium,utilizando fluorescência DsRed como marcador de seleção5,seguida pela inoculação de drenagem do solo de Ralstonia das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi.
Uma limitação potencial deste método consiste no crescimento residual de raízes não transformadas. Isso é particularmente importante nos casos em que o plasmídeo utilizado carece de um gene de repórter que permita a seleção de raízes transformadas. Para resolver esse problema, desenvolvemos um método alternativo baseado na seleção de antibióticos, que inibe o crescimento de raízes não transformadas, permitindo ao mesmo tempo o crescimento de raízes transformadas saudáveis resistentes a antibióticos. Uma vez que A. rizógenes não induz a transformação de brotos, eles são suscetíveis ao antibiótico e, portanto, devem ser mantidos separados do meio contendo antibióticos.
Embora a resistência vegetal contra a Ralstonia não seja bem compreendida, vários relatos associaram alterações na parede celular ao aumento da resistência à murcha bacteriana6,,7,,8,9. Sugere-se que essas alterações na parede celular afetem o desenvolvimento vascular, aspecto essencial para o estilo de vida da Ralstonia dentro da planta10. Mutações nos genes que codificam os sintetizadores de celulose CESA4, CESA7 e CESA8 em Arabidopsis thaliana têm sido demonstradas para prejudicar a integridade da parede celular secundária, causando maior resistência à Ralstonia,que parece estar ligada à sinalização ABA8. Portanto, como prova de conceito para o nosso método, realizamos o silenciamento genético mediado pela RNAi de SlCESA6 (Solyc02g072240), um sintetizador secundário de celulose de parede celular, e ortolog de AtCESA8 (At4g18780). A inoculação subseqüente de drenagem do solo com ralstonia mostrou que silenciar SlCESA6 aumentou a resistência aos sintomas de murcha bacteriana, sugerindo que a resistência mediada pela parede celular à Ralstonia é provavelmente conservada no tomate, e validando nosso método para realizar análise genética da resistência bacteriana murcha nas raízes do tomate. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum é um patógeno vascular devastador que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, causando uma importante ameaça à agricultura. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos bacterianos vegetais, como pseudomonas singae em Arabidopsis. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação em plantas hospedeiras nativas. Nesse cenário, desenvolvemos um método para realizar a análise genética da infecção por Ralstonia do tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia. Este método baseia-se na transformação mediada do Agrobacterium rhizogenesdas raízes do tomate, seguida pela inoculação de ralstonia encharcada de solo das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi. Como prova de conceito, utilizou-se este método para mostrar que o silenciamento mediado pela RNAI de Sisa6 nas raízes do tomate conferiu resistência à Ralstonia. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.

A Figura 5 mostra o desenvolvimento de sintomas da doença de plantas de tomate com raízes transformadas com um vetor vazio (EV), e plantas com raízes transformadas com um construto RNAi direcionado aoSolyc02g072240). SlCESA6 Os dados do índice da doença (Figura 5A) são coletados da mesma unidade experimental (cada planta) ao longo do tempo de acordo com uma escala arbitrária de 0 a 4, e n...

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Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Aqui, apresentamos um método versátil para transformação da raiz do tomate seguido de inoculação com Ralstonia solanacearum para realizar análise genética simples para o estudo da doença de murcha bacteriana.

Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Este protocolo é significativo porque permite que os cientistas realizem uma análise genética simples da doença bacteriana do murcho no tomate. A principal vantagem dessa técnica é que a manipulação da expressão genética e dos ensaios subsequentes pode ser realizada em pouco tempo e com os pequenos requisitos de equipamentos e espaço de crescimento da planta. Este método é muito versátil, e pode ser aplicado a outras plantas agrícolas para realizar tanto a inoculação de patógenos quanto outros ensaios fisiológicos.Para manter a esterilidade durante a manipulação das mudas in vitro, é importante manter as placas fechadas quando estiverem fora do capô de fluxo. Esta é uma técnica fácil, mas requer vários passos para manipulação. A visualização deste método ajudará a ver pequenos truques difíceis de explicar no manuscrito, ajudando outros pesquisadores a implementar o método em seus laboratórios.Ajudando a demonstrar este procedimento será Achen Zhao, um estudante de pós-graduação. Depois de esterilizar e lavar as sementes de tomate, transfira-as para o meio Murashige e Skoog sem sacarose. Mantenha as sementes no escuro a uma temperatura entre 25 e 28 graus Celsius por três dias.Coloque filtros de 8,5 centímetros quadrados dentro de placas de Petri de nove centímetros quadrados contendo meio-forte Murashige e Skoog médio, e coloque seis sementes de tomate germinadas em cada prato. Sele a placa com fita micropora, e incuba as sementes germinadas a 25 a 28 graus Celsius por três a quatro dias. Cultivar o Agrobacterium rizogenes MSU440 em meio LB sólido com antibióticos apropriados por dois dias a 28 graus Celsius antes da transformação da planta.Usando um bisturi estéril, corte o radículo e o fundo do hipocótel das mudas de tomate. Use pontas plásticas ou uma lâmina de bisturi para colher biomassa A.rizogenes da superfície do meio LB, e mergulhe cuidadosamente as mudas de tomate cortadas na biomassa bacteriana. Depois disso, cubra as mudas de tomate com um papel filtro semicircular de dois centímetros por quatro centímetros, a fim de manter uma alta umidade e facilitar a sobrevivência e o desenvolvimento de novas raízes.É importante manter as mudas em alta umidade em um ambiente que permita a transpiração. Para isso, cubra as mudas com papel filtro e feche a placa com fita micropore. Armazene as mudas de tomate transformadas por seis a sete dias em uma câmara de crescimento a uma temperatura entre 25 e 28 graus Celsius.Em seguida, use um bisturi estéril para cortar as novas raízes peludas emergentes, e permitir que as mudas produzam novas raízes peludas. Uma vez que a segunda geração de novas raízes peludas apareça, remova o papel filtro em cima das mudas e sele novamente a placa com fita micropore. Para visualizar a fluorescência DsRed ou qualquer outro equipamento para imagem in vivo da planta, marque as raízes positivas transformadas, que podem ser identificadas pela fluorescência vermelha.Use um bisturi para remover as raízes negativas não transformadas, que podem ser identificadas pela falta de fluorescência vermelha. Transfira as mudas que mostram fluorescência vermelha para uma nova placa contendo meio-forte Murashige e Skoog médio, a fim de facilitar o desenvolvimento da raiz transformada como a raiz principal. Mantenha as mudas que não apresentam fluorescência vermelha na mesma placa para verificar o surgimento de raízes fluorescentes em pontos de tempo posteriores.Cubra as mudas com um papel filtro de semicirculação de dois centímetros por quatro centímetros, sele a placa e incuba as mudas para que elas desenvolvam novas raízes peludas. Prepare os potes de inoculação onde a superfície das raízes será exposta ao inóculo bacteriano, primeiro absorvendo os potes de inoculação com água, derramando qualquer excesso de água e, em seguida, colocando-os em uma bandeja de plantio de plástico. Utilizando pinças, transfira as mudas selecionadas com raízes transformadas para os potes de inoculação.Cubra a bandeja com plástico ou uma tampa transparente, e mantenha-as a 25 a 28 graus Celsius com 65% de umidade. Remova a tampa após cinco ou seis dias. Cresça Ralstonia em cinco LB médio líquido em um agitador orbital a 28 graus Celsius, com agitação a 200 rpm, até a fase estacionária.Meça a densidade óptica em 600 nanômetros para determinar os números bacterianos. Diluir a cultura bacteriana com água para um OD600 de 1. Coloque de 16 a 20 potes de inoculação que contenham plantas de tomate transformadas em uma bandeja de inoculação.Em seguida, despeje 300 mililitros de inóculo bacteriano diluído na bandeja, e deixe as plantas de molho no inóculo por 20 minutos. Depois disso, prepare uma nova bandeja com uma camada de solo de vaso. Mova os potes inoculados para a nova bandeja, e coloque as bandejas em uma câmara de crescimento com 75% de umidade, uma temperatura entre 26 e 28 graus Celsius, e um fotoperóudo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.Aqui, as raízes do tomate são transformadas e inoculadas com a Ralstonia para realizar análisegens simples para o estudo da doença bacteriana murcha. O desenvolvimento dos sintomas da doença é acompanhado em plantas de tomate com raízes transformadas com um vetor vazio e aquelas transformadas com uma construção RAI voltada para o tomate CESA6. Os dados do índice da doença são coletados da mesma unidade experimental ao longo do tempo de acordo com uma escala arbitrária de zero a quatro e não seguem uma distribuição gaussiana, excluindo o uso de testes padrão para dados paramétricos.Como abordagem padrão, um teste U Mann-Whitney, de duas caudas, não paramétrico, para comparar as curvas de controle e infecção é usado. De acordo com esta análise, a diferença entre as medianas de ambas as curvas parece não ser significativa. Também é possível quantificar a área sob a curva de progresso da doença, o que permite combinar múltiplas observações do progresso da doença em um único valor.A área sob a curva de progresso da doença mostra maior valor para as plantas de controle em comparação com as plantas de tomate CESA6 RNAi no final do processo de infecção, indicando que as plantas silenciadas pelo tomate CESA6 são mais resistentes à infecção por Ralstonia do que as plantas de controle. Os intervalos de confiança oferecem uma forma de estimar, com alta probabilidade, uma gama de valores em que o valor populacional de uma determinada variável é encontrado. Como visto aqui, a área do intervalo de confiança de 95% para as curvas de controle e infecção estima uma maior chance de resistência quando o CESA6 é silenciado.Os valores do índice da doença podem ser transformados em dados binários, considerando um índice de doença inferior a dois correspondentes a zero e um índice de doença igual ou superior a dois correspondentes a um. Isso permite a representação de uma curva de sobrevivência após a inoculação de Ralstonia. As diferenças na taxa de sobrevivência entre o controle e as plantas infectadas não são estatisticamente significativas de acordo com o teste estatístico Gehan-Breslow-Wilcoxon.A expressão do CESA6 é então analisada em duas raízes transformadas selecionadas aleatoriamente antes da etapa de inoculação, mostrando que a resistência aumentada à Ralstonia se correlaciona com a expressão reduzida do CESA6. Após duas rodadas de seleção, uma taxa de transformação de 35 a 40% pode ser obtida, e esse valor pode ser aumentado realizando rodadas de seleção adicionais. Durante a realização deste procedimento, é importante manter as mudas cobertas com um pedaço de papel filtro para manter a alta umidade e selar as placas com Micropore para garantir a troca de gás.Após a transformação da raiz, muitos dos tratamentos podem ser aplicados para estudar a resposta vegetal por observação da fisiologia radicular ou usando biologia molecular, biologia celular ou bioquímica. Principalmente, essa técnica permitirá que pesquisadores com recursos limitados realizem análisegens genéticas de infecção bacteriana em raízes de tomate.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genética

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...