Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Macho por sus útiles debates, a Alvaro López-García por el asesoramiento estadístico y a Xinyu Jian por su asistencia técnica y administrativa durante este trabajo. Agradecemos a la instalación central de Biología Celular del PSC por la asistencia con la imagen por fluorescencia Este trabajo fue apoyado por el Programa Estratégico de Investigación Prioritaria de la Academia China de Ciencias (concesión XDB27040204), el Centro de Shanghai para biología del estrés vegetal (chino Academia de Ciencias) y el programa chino 1000 Talents.

NOTA: Las partes importantes de este método implican la manipulación de materiales vegetales in vitro, y por lo tanto es importante mantener las condiciones estériles durante todos estos procedimientos, incluida la visualización de la fluorescencia DsRed. Durante todo el proceso de transformación, las plántulas de tomate crecen a 25 o28 oC y 16 h/8 h de luz/oscuridad (130 mmol fotones m-2s-1 luz). Las placas están selladas con cinta adhesiva de microporos para facilitar el i...

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	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum representa una amenaza importante para la agricultura; sin embargo, su interacción con los huéspedes naturales de importancia agrícola todavía se entiende mal en comparación con otros patógenos bacterianos, especialmente en especies de plantas de cultivo. En la mayoría de los casos, el análisis genético se ve obstaculizado por el tiempo y los gastos necesarios para modificar genéticamente las plantas anfitrionas. Para abordar este problema y facilitar el análisis genético de la...

Ralstonia solanacearum, agente causal de la enfermedad bacteriana de wilt, es un patógeno vascular devastador transmitido por el suelo con una distribución mundial que puede infectar una amplia gama de especies vegetales, incluyendo papa, tomate, tabaco, plátano, pimienta y berenjena, entre otros1,2. Las pérdidas de rendimiento causadas por Ralstonia pueden alcanzar el 80-90% de la producción en tomate, patata o plátano, dependiendo del cultivar, clima, suelo y otros factores3. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae o Xanthomonas spp. Además, la mayoría de los estudios en interacciones entre plantas y microbios se centran en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Aunque la investigación utilizando estos modelos ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones entre plantas y bacterias, no abordan la necesidad actual de entender estas interacciones en las plantas de cultivo. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción. Particularmente, el tomate, un huésped natural de Ralstonia,es el segundo cultivo vegetal más importante a nivel mundial y se ve afectado por una plétora de enfermedades4,incluida la enfermedad bacteriana de wilt. En este trabajo, hemos desarrollado un método fácil para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia del tomate. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, utilizando la fluorescencia DsRed como marcador de selección5,seguido de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI.
Una limitación potencial de este método consiste en el crecimiento residual de raíces no transformadas. Esto es particularmente importante en los casos en que el plásmido utilizado carece de un gen reportero que permita la selección de raíces transformadas. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método alternativo basado en la selección de antibióticos, que inhibe el crecimiento de raíces no transformadas al tiempo que permite el crecimiento de raíces transformadas sanas resistentes a los antibióticos. Dado que A. rhizogenes no induce la transformación de los brotes, son susceptibles al antibiótico y, por lo tanto, deben mantenerse separados del medio que contiene antibióticos.
Aunque la resistencia de las plantas contra Ralstonia no se entiende bien, varios informes han asociado alteraciones de la pared celular a una mayor resistencia a la marchitabacteriana6,,7,8,9. Se ha sugerido que estas alteraciones de la pared celular afectan el desarrollo vascular, un aspecto esencial para el estilo de vida de Ralstonia dentro de la planta10. Se ha demostrado que las mutaciones en genes que codifican las sinteas de celulosa CESA4, CESA7 y CESA8 en Arabidopsis thaliana afectan la integridad de la pared celular secundaria, causando una mayor resistencia a Ralstonia,que parece estar vinculada a la señalización ABA8. Por lo tanto, como prueba de concepto para nuestro método, realizamos silenciamiento de genes mediado por ARNi de SlCESA6 (Solyc02g072240), una celulosa de pared celular secundaria sintasa, y ortolog de AtCESA8 (At4g18780). La posterior inoculación de drenado del suelo con Ralstonia mostró que silenciar SlCESA6 mejoró la resistencia a los síntomas de marchitamiento bacteriano, lo que sugiere que la resistencia mediada por la pared celular a Ralstonia probablemente se conserva en el tomate, y validando nuestro método para llevar a cabo análisis genéticos de la resistencia bacteriana a la marchitamiento en las raíces del tomate. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum es un patógeno vascular devastador que puede infectar a una amplia gama de especies vegetales, causando una amenaza importante para la agricultura. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae en Arabidopsis. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción en las plantas anfitrionas nativas. En este escenario, hemos desarrollado un método para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia de tomate, un huésped natural de Ralstonia. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, seguida de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI. Como prueba de concepto, utilizamos este método para demostrar que el silenciamiento mediado por ARNi de SlCESA6 en raíces de tomate confirió resistencia a Ralstonia. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

La Figura 5 muestra el desarrollo de síntomas de enfermedad de plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío (EV), y plantas con raíces transformadas con una construcción de ARNi dirigida a SlCESA6 (Solyc02g072240). Los datos del índice de la enfermedad(Figura 5A)se recopilan de la misma unidad experimental (cada planta) a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbi...

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Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Aquí, presentamos un método versátil para la transformación de la raíz de tomate seguido de la inoculación con Ralstonia solanacearum para realizar un análisis genético sencillo para el estudio de la enfermedad bacteriana de la enfermedad de wilt.

Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Este protocolo es significativo porque permite a los científicos realizar análisis genéticos sencillos de la enfermedad bacteriana de marchitamiento en el tomate. La principal ventaja de esta técnica es que la manipulación de la expresión génica y los ensayos posteriores se pueden realizar en poco tiempo y con los pequeños requisitos de equipos y espacio de crecimiento de la planta. Este método es muy versátil, y se puede aplicar a otras plantas de cultivo para realizar tanto la inoculación de patógenos y otros ensayos fisiológicos.Para mantener la esterilidad durante la manipulación de plántulas in vitro, es importante mantener las placas cerradas cuando están fuera de la campana de flujo. Esta es una técnica fácil, pero requiere varios pasos para la manipulación. La visualización de este método ayudará a ver pequeños trucos que son difíciles de explicar en el manuscrito, ayudando a otros investigadores a implementar el método en sus laboratorios.Ayudar a demostrar este procedimiento será Achen Zhao, un estudiante graduado. Después de esterilizar y lavar las semillas de tomate, transfiéralas a media fuerza Murashige y Skoog medio sin sacarosa. Mantenga las semillas en la oscuridad a una temperatura entre 25 y 28 grados Celsius durante tres días.Coloque filtros autoclavedos de 8,5 centímetros cuadrados dentro de platos Petri de nueve centímetros cuadrados que contengan Murashige de media fuerza y medio Skoog, y coloque seis semillas de tomate germinadas en cada plato. Selle la placa con cinta de micropore e incubar las semillas germinadas a 25 a 28 grados centígrados durante tres o cuatro días. Cultivar el Agrobacterium rhizogenes MSU440 en medio LB sólido con antibióticos adecuados durante dos días a 28 grados Celsius antes de la transformación de la planta.Usando un bisturí estéril, corta el radio y la parte inferior del hipocotilo de las plántulas de tomate. Utilice puntas de plástico o una cuchilla de bisturí para cosechar biomasa A.rhizogenes de la superficie del medio LB, y sumerja cuidadosamente las plántulas de tomate cortadas en la biomasa bacteriana. Después de esto, cubra las plántulas de tomate con un papel de filtro semicircular de dos centímetros por cuatro centímetros con el fin de mantener una alta humedad y facilitar la supervivencia y el desarrollo de nuevas raíces.Es importante mantener las plántulas en alta humedad en un ambiente que permita la transpiración. Para ello, cubra las plántulas con papel de filtro y cierre la placa con cinta Micropore. Almacene las plántulas de tomate transformadas durante seis a siete días en una cámara de crecimiento a una temperatura de entre 25 y 28 grados centígrados.Luego usa un bisturí estéril para cortar las nuevas raíces peludas emergentes, y deja que las plántulas produzcan nuevas raíces peludas. Una vez que aparezca la segunda generación de nuevas raíces peludas, retire el papel de filtro en la parte superior de las plántulas y selle la placa con cinta de microprés de nuevo. Para visualizar la fluorescencia DsRed o cualquier otro equipo para la toma de imágenes in vivo de la planta, marque las raíces transformadas positivas, que pueden ser identificadas por la fluorescencia roja.Usa un bisturí para eliminar las raíces negativas no transformadas, que pueden ser identificadas por su falta de fluorescencia roja. Transfiera las plántulas que muestran fluorescencia roja a una nueva placa que contenga medio Murashige y Skoog de media resistencia para facilitar el desarrollo de la raíz transformada como raíz principal. Mantenga las plántulas que no muestran fluorescencia roja en la misma placa para comprobar la aparición de raíces fluorescentes en puntos de tiempo posteriores.Cubra las plántulas con un papel de filtro semicírculo de dos centímetros por cuatro centímetros, selle la placa e incubar las plántulas para que desarrollen nuevas raíces peludas. Preparar las ollas de inoculación donde la superficie de las raíces se expondrá al inóculo bacteriano remojando primero las ollas de inoculación con agua, vertiendo cualquier exceso de agua, y luego colocándolas en una bandeja de siembra de plástico. Con pinzas, transfiera las plántulas seleccionadas con raíces transformadas a las macetas de inoculación.Cubra la bandeja con una envoltura de plástico o una tapa transparente, y manténgala a 25 a 28 grados centígrados con 65% de humedad. Retire la cubierta después de cinco o seis días. Cultivar Ralstonia en cinco LB medio líquido en un agitador orbital a 28 grados Celsius, con temblor a 200 rpm, hasta la fase estacionaria.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros para determinar los números bacterianos. Diluir el cultivo bacteriano con agua a un OD600 de 1. Coloque de 16 a 20 ollas de inoculación que contengan plantas de tomate transformadas en una bandeja de inoculación.A continuación, vierta 300 mililitros de inóculo bacteriano diluido en la bandeja, y deje que las plantas se empapen en el inóculo durante 20 minutos. Después de esto, preparar una nueva bandeja con una capa de tierra para macetas. Mueva las ollas inoculadas a la nueva bandeja y coloque las bandejas en una cámara de crecimiento con 75% de humedad, una temperatura entre 26 y 28 grados centígrados, y un fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.Aquí, las raíces de tomate se transforman e inoculan con Ralstonia para realizar análisis genéticos sencillos para el estudio de la enfermedad bacteriana. El desarrollo de los síntomas de la enfermedad se rastrea en plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío y las transformadas con una construcción RAI dirigida al tomate CESA6. Los datos del índice de enfermedades se recopilan de la misma unidad experimental a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbitraria de cero a cuatro y no siguen una distribución gaussiana, descartando el uso de pruebas estándar para datos paramétricos.Como enfoque estándar, se utiliza una prueba U Mann-Whitney, de dos colas y no paramétrica para comparar las curvas de control e infección. Según este análisis, la diferencia entre las medianas de ambas curvas parece no ser significativa. También es posible cuantificar el área bajo la curva de progreso de la enfermedad, lo que permite combinar múltiples observaciones del progreso de la enfermedad en un solo valor.El área bajo la curva de progreso de la enfermedad muestra un mayor valor para las plantas de control en comparación con las plantas de tomate CESA6 RNAi al final del proceso de infección, lo que indica que las plantas silenciadas por CESA6 de tomate son más resistentes a la infección por Ralstonia que las plantas de control. Los intervalos de confianza ofrecen una forma de estimar, con alta probabilidad, un rango de valores en el que se encuentra el valor poblacional de una variable determinada. Como se ve aquí, el área del intervalo de confianza del 95% para las curvas de control e infección estima una mayor probabilidad de resistencia cuando se silencia CESA6.Los valores del índice de enfermedad se pueden transformar en datos binarios, teniendo en cuenta un índice de enfermedad inferior a dos correspondiente a cero y un índice de enfermedad igual o superior a dos correspondiente a uno. Esto permite la representación de una curva de supervivencia después de la inoculación de Ralstonia. Las diferencias en la tasa de supervivencia entre el control y las plantas infectadas no son estadísticamente significativas según la prueba estadística Gehan-Breslow-Wilcoxon.La expresión de CESA6 se analiza en dos raíces transformadas seleccionadas aleatoriamente antes del paso de inoculación, mostrando que la resistencia mejorada a Ralstonia se correlaciona con la expresión reducida de CESA6. Después de dos rondas de selección, se puede obtener una tasa de transformación de 35 a 40%, y este valor se puede aumentar realizando rondas de selección adicionales. Al realizar este procedimiento, es importante mantener las plántulas cubiertas con un pedazo de papel de filtro para mantener una alta humedad y sellar las placas con Micropore para garantizar el intercambio de gas.Después de la transformación de la raíz, muchos de los tratamientos se pueden aplicar para estudiar la respuesta vegetal mediante la observación de la fisiología de la raíz o utilizando biología molecular, biología celular, o bioquímica. Principalmente, esta técnica permitirá a los investigadores con recursos limitados realizar análisis genéticos de la infección bacteriana en las raíces de tomate.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Investigación

Genética

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Dirigida tubería de Bioinformática y secuenciación de próxima generación para evaluar determinantes genéticos de la enfermedad constitucional

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Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

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