Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Vi tackar alla labbmedlemmar i Macho-laboratoriet för hjälpsamma diskussioner, Alvaro López-García för statistisk rådgivning och Xinyu Jian för tekniskt och administrativt bistånd under detta arbete. Vi tackar PSC Cell Biology kärnanläggning för hjälp med fluorescensimaging Detta arbete stöddes av strategic priority research program of the Chinese Academy of Sciences (grant XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinese Academy of Sciences (grant XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinese Academy of Sciences) och det kinesiska 1000 Talents-programmet.

OBS: Viktiga delar av denna metod innebär hantering av växtmaterial in vitro, och därför är det viktigt att hålla sterila förhållanden under alla dessa förfaranden, inklusive visualisering av DsRed fluorescens. Under all omvandlingsprocess växer tomatplantorna vid 25−28 °C och 16 h/8 h ljus/mörker (130 μmol fotoner m-2s-1 ljus). Plattorna är förseglade med mikropore tejp för att underlätta gasutbyte och transpiration.
1. Beredning av tom...

<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum utgör ett viktigt hot mot jordbruket. Dess interaktion med naturliga värdar av jordbruksbetydelse är dock fortfarande dåligt förstås jämfört med andra bakteriella patogener, särskilt hos växtarter. I de flesta fall hindras genetisk analys av den tid och de kostnader som krävs för att genetiskt modifiera värdväxter. För att lösa detta problem och underlätta genetisk analys av R. solanacearum infektion i tomat, har vi utvecklat en enkel metod baserad på Agrobac...

Ralstonia solanacearum, orsaksmedlet för bakteriell vissnande sjukdom, är en förödande jordburen vaskulär patogen med en världsomspännande distribution som kan infektera ett stort antal växtarter, inklusive potatis, tomat, tobak, banan, peppar och aubergine, bland annat1,2. Avkastning förluster orsakade av Ralstonia kan nå 80-90% av produktionen i tomat, potatis eller banan, beroende på sort, klimat, jord och andra faktorer3. Emellertid, Ralstonia modellen är betydligt underutforskad i jämförelse med andra modeller som involverar bakteriella växtpatogener, såsom Pseudomonas syringae eller Xanthomonas spp. Dessutom är de flesta studier i växt-mikrob interaktioner inriktade på modellen anläggningen Arabidopsis thaliana. Även om forskning med hjälp av dessa modeller till stor del har bidragit till vår förståelse av växt-bakterier interaktioner, de tar inte upp den nuvarande nödvändigheten att förstå dessa interaktioner i växtväxter. Forskning som syftar till att förstå samspelet mellan Ralstonia och växtväxter är viktigt att utveckla hållbara lösningar för att bekämpa bakteriell vissnande sjukdom, men för närvarande hindras av bristen på enkla experimentella analyser för att karakterisera de olika komponenterna i interaktionen. Särskilt tomat, en naturlig värd för Ralstonia, är den näst viktigaste grönsaksodlingen i världen och påverkas av en uppsjö av sjukdomar4, inklusive bakteriell vissna sjukdom. I detta arbete har vi utvecklat en enkel metod för att utföra genetisk analys av Ralstonia infektion av tomat. Denna metod är baserad på Agrobacterium rhizogenes-medieradomvandling av tomatrötter, med hjälp av DsRed fluorescens som urval markör5, följt av Ralstonia jord-dränkande inokulering av de resulterande växterna, som innehåller transformerade rötter som uttrycker byggandet av intresse. Mångsidigheten hos rotomvandlingsanalysen gör det möjligt att utföra antingen genöveruttryck eller genljuddämpning medhjälp av RNAi.
En potentiell begränsning av denna metod består av resttillväxt av icke-transformerade rötter. Detta är särskilt viktigt i de fall där plasmid används saknar en reporter gen som gör att valet av transformerade rötter. För att lösa detta problem har vi utvecklat en alternativ metod baserad på antibiotikaval, som hämmar tillväxten av icke-transformerade rötter samtidigt som tillväxten av friska antibiotikaresistenta transformerade rötter tillåts. Eftersom A. rhizogenes inte inducerar omvandlingen av skott, är de mottagliga för antibiotika, och därför bör de hållas åtskilda från det antibiotikainnehållande mediet.
Även om växtmotståndet mot Ralstonia inte är väl förstått, har flera rapporter associerade cellväggsförändringar till ökad motståndskraft mot bakteriell vissna6,7,8,9. Det har föreslagits att dessa cellvägg förändringar påverkar vaskulär utveckling, en viktig aspekt för livsstil Ralstonia inne i anläggningen10. Mutationer i gener som kodar cellulosasyntiserar CESA4, CESA7 och CESA8 i Arabidopsis talian har visat sig försämra sekundär cellväggintegritet, vilket orsakar ökat motstånd mot Ralstonia, som verkar vara kopplat till ABA signalering8. Därför, som ett proof of concept för vår metod, utförde vi RNAi-medierad gen ljuddämpning av SlCESA6 (Solyc02g072240), en sekundär cellulosasynthas för cellulosa och ortolog av AtCESA8 (At4g18780). Efterföljande jord-dränkning inokulering med Ralstonia visade att tysta SlCESA6 förbättrad motståndskraft mot bakteriell vissna symtom, vilket tyder på att cellen väggmedierad resistens mot Ralstonia sannolikt bevaras i tomat, och validera vår metod för att utföra genetisk analys av bakteriell vissna resistens i tomat rötter. Här beskriver vi denna metod i detalj, vilket gör det möjligt för genetiska metoder att förstå bakteriell vissna sjukdom på relativt kort tid och med små krav på utrustning och växttillväxtutrymme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum är en förödande jordburen vaskulär patogen som kan infektera ett stort spektrum av växtarter, vilket orsakar ett viktigt hot mot jordbruket. Emellertid, Ralstonia modellen är betydligt underutforskad i jämförelse med andra modeller som involverar bakteriella växtpatogener, såsom Pseudomonas syringae i Arabidopsis. Forskning som syftar till att förstå samspelet mellan Ralstonia och växtväxter är viktigt att utveckla hållbara lösningar för att bekämpa bakteriell vissnande sjukdom, men för närvarande hindras av bristen på enkla experimentella analyser för att karakterisera de olika komponenterna i interaktionen i inhemska värdväxter. I detta scenario har vi utvecklat en metod för att utföra genetisk analys av Ralstonia infektion av tomat, en naturlig mängd Ralstonia. Denna metod är baserad på Agrobacterium rhizogenes-medieradomvandling av tomatrötter, följt av Ralstonia jord-dränkande inokulering av de resulterande växterna, som innehåller förvandlade rötter som uttrycker byggandet av intresse. Mångsidigheten hos rotomvandlingsanalysen gör det möjligt att utföra antingen genöveruttryck eller genljuddämpning medhjälp av RNAi. Som ett proof of concept, använde vi denna metod för att visa att RNAi-medierad tystas av SlCESA6 i tomat rötter tilldelas motstånd mot Ralstonia. Här beskriver vi denna metod i detalj, vilket gör det möjligt för genetiska metoder att förstå bakteriell vissna sjukdom på relativt kort tid och med små krav på utrustning och växttillväxtutrymme.

Figur 5 visar utvecklingen av sjukdomssymtom på tomatplantor med rötter omvandlas med en tom vektor (EV), och växter med rötter omvandlas med en RNAi konstruktion inriktning SlCESA6 (Solyc02g072240). Sjukdomsindexdata (figur 5A) samlas in från samma försöksenhet (varje anläggning) över tiden enligt en godtycklig skala från 0 till 4, och följer inte en gaussisk distribution, utesluta a...

Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Här presenterar vi en mångsidig metod för tomatrotomvandling följt av inokulering med Ralstonia solanacearum för att utföra enkel genetisk analys för studier av bakteriell vissnande sjukdom.

Tomat rotomvandling följt av inokulering med Ralstonia Solanacearum för enkel genetisk analys av bakteriell vissna sjukdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Detta protokoll är betydande eftersom det tillåter forskare att utföra enkel genetisk analys av bakteriell vissna sjukdom i tomat. Den största fördelen med denna teknik är att manipuleringen av genuttryck och efterföljande analyser kan utföras på kort tid och med de små kraven på utrustning och växttillväxtutrymme. Detta är metod är mycket mångsidig, och det kan tillämpas på andra grödor för att utföra både patogen inokulering och andra fysiologiska analyser.För att bibehålla steriliteten under manipulering av plantor in vitro är det viktigt att hålla plattorna stängda när de är utanför flödeshuven. Detta är en enkel teknik, men det kräver flera steg för manipulation. Visualiseringen av denna metod kommer att hjälpa till att se små knep som är svåra att förklara i manuskriptet, vilket hjälper andra forskare att implementera metoden i sina labb.Att hjälpa till att visa detta förfarande kommer att Achen Zhao, en doktorand. Efter sterilisering och tvättning av tomatfröna, överför dem till halvstyrka Murashige och Skoog medium utan sackaros. Håll fröna i mörker vid en temperatur mellan 25 och 28 grader Celsius i tre dagar.Placera autoklaverade 8,5-kvadrat-centimeterfilter inuti nio kvadratcenti-rätter som innehåller halvstyrka Murashige och Skoog medium, och placera sex grodda tomatfrön på varje tallrik. Försegla plattan med Micropore tejp, och ruva groda de grodda fröna vid 25 till 28 grader Celsius i tre till fyra dagar. Odla Agrobacterium rhizogenes MSU440 i fast LB medium med lämpliga antibiotika för två dagar vid 28 grader Celsius innan växtomvandling.Med hjälp av en steril skalpell, skär radikeln och botten av hypocotyl av tomat plantor. Använd plastspetsar eller ett skalpellblad för att skörda A.rhizogenes biomassa från lb-mediets yta, och doppa försiktigt de skurna tomatplantorna i bakteriebiomassan. Efter detta, täck tomat plantor med en två centimeter-av-fyra-centimeters halvcirkelformad filterpapper för att hålla en hög luftfuktighet och underlätta överlevnad och ny rot utveckling.Det är viktigt att hålla plantorna i hög luftfuktighet i en miljö som tillåter transpiration. För att göra detta, täck plantorna med filterpapper, och stäng plattan med Micropore tejp. Förvara de transformerade tomatplantorna i sex till sju dagar i en tillväxtkammare vid en temperatur mellan 25 och 28 grader Celsius.Använd sedan en steril skalpell för att klippa de nya framväxande håriga rötterna, och låt plantorna producera nya håriga rötter. När den andra generationen av nya håriga rötter visas, ta bort filterpapper ovanpå plantorna, och försegla plattan med Micropore tejp igen. För att visualisera DSRed fluorescens eller någon annan utrustning för anläggning in vivo imaging, markera de positiva omvandlas rötter, som kan identifieras genom den röda fluorescens.Använd en skalpell för att ta bort de negativa icke-transformerade rötterna, som kan identifieras genom deras brist på röd fluorescens. Överför plantorna som visar röd fluorescens till en ny platta som innehåller halvstyrka Murashige och Skoog medium för att underlätta utvecklingen av den omvandlade roten som huvudrot. Håll plantorna som inte visar röd fluorescens i samma platta för att kontrollera uppkomsten av fluorescerande rötter i senare tidspunkter.Täck plantorna med en två centimeter-av-fyra-centimeters halvcirkelfilterpapper, försegla plattan och inkubera plantorna för att låta dem utveckla nya håriga rötter. Förbered inokulering krukor där ytan av rötterna kommer att utsättas för den bakteriella inokulaten genom att först blötlägga inokulering krukor med vatten, hälla av eventuellt överflödigt vatten, och sedan placera dem i en plast plantering bricka. Med hjälp av pincett, överföra de valda plantorna med transformerade rötter till inokuleringspottorna.Täck facket med plastfolie eller ett genomskinligt lock, och håll dem på 25 till 28 grader Celsius med 65%luftfuktighet. Ta bort skyddet efter fem eller sex dagar. Odla Ralstonia i fem LB flytande medium i en orbital shaker vid 28 grader Celsius, med skakningar på 200 rpm, fram till den stationära fasen.Mät den optiska densiteten vid 600 nanometer för att bestämma bakterietalen. Späd bakteriekulturen med vatten till en OD600 av 1. Placera 16 till 20 inokulering krukor som innehåller omvandlas tomatplantor till en inokulering bricka.Häll sedan 300 milliliter utspädd bakteriell inokulat i facket, och låt växterna att suga i inokulat i 20 minuter. Efter detta, förbereda en ny bricka med ett lager av krukväxtjord. Flytta inokulerade krukor i det nya facket, och placera brickorna i en tillväxtkammare med 75%luftfuktighet, en temperatur mellan 26 och 28 grader Celsius, och en fotoperiod på 12 timmar av ljus och 12 timmars mörker.Här omvandlas tomatrötter och inokuleras med Ralstonia för att utföra okomplicerad genetisk analys för studier av bakteriell vissna sjukdom. Utvecklingen av sjukdomssymptom spåras i tomatplantor med rötter omvandlas med en tom vektor och de omvandlas med en RAI konstruera inriktning tomat CESA6. Sjukdomsindexdata samlas in från samma experimentella enhet över tiden enligt en godtycklig skala från noll till fyra och följer inte en gaussisk fördelning, som utesluter användningen av standardtester för parametriska data.Som en standard metod, en U Mann-Whitney, två-tailed, icke-parametriska test för att jämföra både kontroll och infektion kurvor används. Enligt denna analys förefaller skillnaden mellan medianerna för båda kurvorna vara icke-signifikant. Det är också möjligt att kvantifiera området under sjukdomsförloppskurvan, vilket gör det möjligt att kombinera flera observationer av sjukdomsförlopp till ett enda värde.Området under sjukdomsförloppskurvan visar ett högre värde för kontrollväxter jämfört med tomat CESA6 RNAi-växter i slutet av infektionsprocessen, vilket indikerar att tomat CESA6-tystade växter är mer motståndskraftiga mot Ralstonia-infektion än bekämpningsanläggningar. Konfidensintervall erbjuder ett sätt att uppskatta, med hög sannolikhet, ett intervall av värden där populationens värde för en given variabel hittas. Som sett här, området för 95%konfidensintervall för kontroll och infektion kurvor uppskattar en högre risk för resistens när CESA6 tystas.Sjukdomsindexvärden kan omvandlas till binära data, med tanke på ett sjukdomsindex lägre än två som motsvarar noll och ett sjukdomsindex lika eller högre än två som motsvarar ett. Detta gör att representationen av en överlevnadskurva efter Ralstonia inympning. Skillnaderna i överlevnadsgraden mellan kontrollen och de infekterade växterna är inte statistiskt signifikanta enligt gehan-Breslow- Wilcoxons statistiska test.Uttrycket för CESA6 analyseras sedan i två slumpmässigt utvalda omvandlade rötter före inokuleringssteget, som visar att det förstärkta motståndet mot Ralstonia korrelerar med det minskade uttrycket för CESA6. Efter två omgångar av val kan en transformationshastighet på 35 till 40 %erhållas, och detta värde kan ökas genom att utföra ytterligare urvalsomgångar. Medan du utför denna procedur är det viktigt att hålla plantorna täckta med en bit filterpapper för att bibehålla hög luftfuktighet och för att täta plattorna med Micropore för att säkerställa gasutbyte.Efter rotomvandlingen kan många av behandlingarna tillämpas för att studera växtresponsen genom observation av rotfysiologi eller med hjälp av molekylärbiologi, cellbiologi eller biokemi. Främst, denna teknik kommer att tillåta forskare med begränsade resurser att utföra genetisk analys av bakteriell infektion i tomat rötter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering och jämförande analys av organellära DNA-berikningsmetoder lämpliga för nästa generations sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Riktade nästa generations sekvensering och bioinformatik Pipeline för att utvärdera genetiska determinanter av konstitutionella sjukdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat Gene tester i klinisk kohortstudier med multiplexade genotypning och masspektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifiering av spår av RNA: protein komplex via RNA immunoprecipitation i tandem följt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartläggning av Termotolerans skillnader mellan arter av Saccharomyces jäst via Genomomfattande ömsesidig Hemizygosity analys

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...