Name: tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Macho laboratuvarının tüm laboratuvar üyelerine yararlı tartışmalar için, alvaro López-García'ya istatistiksel tavsiyeler için ve Xinyu Jian'a bu çalışma sırasında teknik ve idari yardım için teşekkür ederiz. Biz floresan görüntüleme ile yardım için PSC Hücre Biyolojisi çekirdek tesisi teşekkür Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelik Araştırma Programı (hibe XDB27040204), Şangay Merkezi Bitki Stres Biyolojisi (Çince) tarafından desteklendi Bilimler Akademisi) ve Çince 1000 Talents programı.

NOT: Bu yöntemin önemli bölümleri, bitki malzemelerinin vitro olarak işlenmesini içerir ve bu nedenle DsRed floresanlarının görselleştirilmesi de dahil olmak üzere tüm bu işlemler sırasında steril koşulların tutulması önemlidir. Tüm dönüşüm sürecinde domates fideleri 25−28 °C ve 16 saat açık/koyu (130 μmol foton m-2s-1 ışık) olarak büyür. Plakalar gaz değişimi ve transpirasyonu kolaylaştırmak için mikropore bant ile mühürlenir.
<p clas...

<ol>
	<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Wilt+in+China:+History,+Current+Status,+and+Future+Perspectives.">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).</li><li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).</li><li>Ho-Pl&#225;garo, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34 (2018).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+of+homogalacturonan,+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum.">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li><li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum.">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li><li>Hern&#225;ndez-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance.">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li><li>Denanc&#233;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+wat1+(walls+are+thin1)-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen,+Ralstonia+solanacearum,+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism.">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li><li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction:+focus+at+the+plant+cell+wall.">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li><li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses.">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li><li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts.">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum.">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Le&#243;n-Morcillo, R. J., Mart&#237;n-Rodr&#237;guez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., Garc&#237;a-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling.">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li><li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retire+statistical+significance.">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li></ol>

Ralstonia solanacearum tarım için önemli bir tehdit oluşturmaktadır; ancak, tarımsal önemi doğal konakları ile etkileşimi hala diğer bakteriyel patojenler ile karşılaştırıldığında, özellikle bitki türlerinde kötü anlaşılmaktadır. Çoğu durumda, genetik analiz zaman ve giderleri genetik konak bitkiler değiştirmek için gerekli tarafından engellenir. Bu sorunu çözmek ve domateste R. solanacearum enfeksiyonunun genetik analizini kolaylaştırmak için, domates köklerini...

Ralstonia solanacearum, bakteriyel solgunluk hastalığının nedensel ajan, diğerleri arasında patates, domates, tütün, muz, biber ve patlıcan da dahil olmak üzere bitki türlerinin geniş bir yelpazede enfekte olabilir dünya çapında bir dağıtım ile yıkıcı bir toprak kaynaklı vasküler patojen, diğerleri arasında1,2. Ralstonia'nın neden olduğu verim kayıpları, çeşitlerin, iklimin, toprağın ve diğer faktörlere bağlı olarak domates, patates veya muz üretiminin %80-90'ına ulaşabilir3. Ancak, Ralstonia modeli, Pseudomonas syringae veya Xanthomonas sppgibi bakteriyel bitki patojenlerini içeren diğer modellere kıyasla oldukça az keşfedilmemiştir. Ayrıca, bitki-mikrop etkileşimleri en çalışmalar model bitki Arabidopsis thalianaodaklanmıştır. Bu modelleri kullanarak araştırma büyük ölçüde bitki-bakteri etkileşimleri anlayışımıza katkıda bulunmuş olsa da, onlar ekin bitkilerde bu etkileşimleri anlamak için mevcut gerekliliği ele almamıştır. Araştırma Ralstonia ve bitki bitkileri arasındaki etkileşimi anlamak için bakteriyel solgunluk hastalığı ile mücadele için sürdürülebilir çözümler geliştirmek için gerekli olan ancak şu anda etkileşimin farklı bileşenleri karakterize etmek için basit deneysel tahliller eksikliği engellenir. Özellikle, domates, Ralstoniaiçin doğal bir ev sahibi , dünya çapında ikinci en önemli bitkisel ürün ve hastalıkların bir bolluk etkilenir4, bakteriyel solgunluk hastalığı da dahil olmak üzere. Bu çalışmada, domatesralstonia enfeksiyonu genetik analizi gerçekleştirmek için kolay bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem agrobacterium rhizogenesdayanmaktadır -domates köklerinin aracılı dönüşümü, seçim marker olarak DsRed floresan kullanarak5, Ralstonia toprak sırılsıklam aşılama takip ortaya çıkan bitkilerin, dönüştürülmüş kökleri içeren ilgi inşa ifade içeren. Kök dönüşüm testinin çok yönlülüğü, rnai aracılığında gen aşırı ekspresyonu veya gen susturma gerçekleştirmeyi sağlar.
Bu yöntemin potansiyel bir sınırlama dönüştürülmeyen köklerin artık büyüme oluşur. Bu plazmid kullanılan durumlarda özellikle dönüştürülmüş köklerin seçimi sağlayan bir muhabir gen yoksun olduğu durumlarda önemlidir. Bu sorunu çözmek için, antibiyotik seçimine dayalı alternatif bir yöntem geliştirdik, bu da dönüşümsüz köklerin büyümesini engellerken, aynı yandan da antibiyotiğe dirençli dönüştürülmüş köklerin büyümesini sağladı. A. rhizogenes sürgünlerin dönüşümüne neden olmadığından, antibiyotiğe karşı duyarlıdırlar ve bu nedenle antibiyotik içeren ortamdan ayrı tutulmalıdırlar.
Ralstonia karşı bitki direnci iyi anlaşılamamasına rağmen, çeşitli raporlar bakteriyel solgunluk 6 gelişmiş direnç için hücre duvarı değişiklikleri ilişkili var66 ,7,8,9. Bu hücre duvarı değişiklikleri vasküler gelişimi etkilediği ileri sürülmüştür, bitki içinde Ralstonia yaşam tarzı için önemli bir yönü10. Arabidopsis thaliana selüloz sintazları CESA4, CESA7 ve CESA8 kodlama genlerde mutasyonlar ikincil hücre duvar bütünlüğünü bozan gösterilmiştir, Ralstoniagelişmiş direnç neden , Hangi ABA sinyalizasyon bağlı gibi görünüyor8. Bu nedenle, bizim yöntem için kavram kanıtı olarak, biz SlCESA6 RNAi aracılı gen susturma yapıldı(Solyc02g072240),ikincil bir hücre duvarı selüloz synthase, ve AtCESA8 ortolog (At4g18780). Ralstonia ile sonraki toprak sırılsıklam aşılama slCESA6 bakteriyel solgunluk belirtilerine karşı direnci ni artırdı gösterdi, Ralstonia hücre duvar aracılı direnç büyük olasılıkla domates korunmuş olduğunu düşündüren, ve domates kökleribakteriyel solgunluk direnci genetik analizi yürütmek için yöntemimizi doğrulayan. Burada, genetik yaklaşımların bakteriyel solgunluk hastalığını nispeten kısa sürede ve küçük ekipman ve bitki büyüme alanı gereksinimleriyle anlamasını sağlayan bu yöntemi ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 mm square Petri-dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD (Becton and Dickinson)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jiffy pots</td>
			<td>Jiffy Products International A.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (M519)</td>
			<td>Phytotechlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pindstrup substrate</td>
			<td>Pindstrup Mosebrug A/S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clean bench</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahtman paper</td>
			<td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tomato root transformation followed by inoculation with ralstonia solanacearum for straightforward genetic analysis of bacterial wilt disease

Ralstonia solanacearum, tarım için önemli bir tehdit neden, bitki türlerinin geniş bir yelpazede enfekte olabilir yıkıcı bir toprak kaynaklı vasküler patojendir. Ancak, Ralstonia modeli önemli ölçüde bakteriyel bitki patojenleri içeren diğer modellere göre underexploreed, Arabidopsis Pseudomonas syringae gibi . Ralstonia ve bitki bitkileri arasındaki etkileşimi anlamayı hedefleyen araştırmalar, bakteriyel solgunluk hastalığına karşı mücadele etmek için sürdürülebilir çözümler geliştirmek için gereklidir, ancak şu anda yerli konak bitkilerdeki etkileşimin farklı bileşenlerini karakterize etmek için basit deneysel tahlillerin olmaması engellenmiştir. Bu senaryoda, biz domates Ralstonia enfeksiyonu genetik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem geliştirdik, Ralstoniadoğal bir ev sahibi . Bu yöntem, domates köklerinin Agrobacterium rhizogenes-aracılıdönüşümüne dayanır ve bunu ralstonia toprak-ıslatma aşılaması ile ortaya çıkan bitkilerin, ilgi yapısını ifade eden dönüştürülmüş kökleri içeren aşılamaya dayanmaktadır. Kök dönüşüm testinin çok yönlülüğü, rnai aracılığında gen aşırı ekspresyonu veya gen susturma gerçekleştirmeyi sağlar. Kavramın bir kanıtı olarak, domates kökleri Nde SlCESA6 RNAi aracılı susturma Ralstoniadirenç verilen göstermek için bu yöntemi kullandı. Burada, genetik yaklaşımların bakteriyel solgunluk hastalığını nispeten kısa sürede ve küçük ekipman ve bitki büyüme alanı gereksinimleriyle anlamasını sağlayan bu yöntemi ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.

Şekil 5 boş bir vektör (EV) ile dönüştürülmüş kökleri ile domates bitkileri hastalık belirtileri gelişimini gösterir ve kökleri bir RNAi ile dönüştürülmüş bitkiler SlCESA6 hedefleme(Solyc02g072240). Hastalık indeksi verileri(Şekil 5A)zaman içinde aynı deneysel birimden (her bitki) 0'dan 4'e rasgele bir ölçeğe göre toplanır ve parametrik veriler için standart testl...

Watch this Scientific Journal Video about Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease at JoVE.com

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Burada, bakteriyel solgunluk hastalığı nın incelenmesi için basit genetik analiz yapmak için Ralstonia solanacearum ile aşılama takip domates kökü dönüşümü için çok yönlü bir yöntem satMaktadır.

Bakteriyel Solgunluk Hastalığının Basit Genetik Analizi için Ralstonia Solanacearum ile Aşılama Takip Domates Kökü Dönüşümü

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Bilim adamları domates bakteriyel solgunluk hastalığının basit genetik analizi ni yapmak için izin verir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gen ekspresyonu ve sonraki tahlillerin manipülasyonunun kısa sürede ve ekipman ve bitki büyüme alanının küçük gereksinimleriyle yapAbildiğidir. Bu yöntem çok yönlüdür ve hem patojen aşılama ve diğer fizyolojik tahlilleri gerçekleştirmek için diğer bitki bitkilere uygulanabilir.Fidelerin in vitro manipülasyonu sırasında kısırlığı korumak için, akış kaputunun dışında yken plakaları kapalı tutmak önemlidir. Bu kolay bir tekniktir, ancak manipülasyon için birden çok adım gerektirir. Bu yöntemin görselleştirilmesi, el yazmasında açıklanması zor olan küçük hilelerin görülmesine yardımcı olacak ve diğer araştırmacıların bu yöntemi laboratuvarlarında uygulamalarına yardımcı olacaktır.Bu prosedürü göstermek için yardımcı Achen Zhao, bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Domates tohumlarını sterilize edip yıkadıktan sonra, onları sakarozsuz yarım güçlü Murashige ve Skoog ortamına aktarın. Tohumları 25 ile 28 derece arasında bir sıcaklıkta karanlıkta üç gün bekletin.Yarım mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı içeren dokuz santimetre karelik Petri yemeklerinin içine otoklavlı 8,5 santimetre karelik filtreler yerleştirin ve her tabağa altı tane çimlenmiş domates tohumu yerleştirin. Mikropore bant ile plaka mühür ve 3-4 gün boyunca 25-28 santigrat derece çimlenmiş tohumları kuluçka. Bitki dönüşümünden önce 28 santigrat derecede iki gün boyunca uygun antibiyotikler ile katı LB orta Agrobacterium rhizogenes MSU440 büyümek.Steril bir neşter kullanarak, radicle ve domates fidelerinin hipokotil alt kesti. LB ortamının yüzeyinden A.rhizogenes biyokütlesi hasat etmek için plastik uçlar veya neşter bıçak kullanın ve dikkatlice bakteriyel biyokütle kesilmiş domates fideleri daldırma. Bundan sonra, yüksek nem tutmak ve hayatta kalma ve yeni kök gelişimini kolaylaştırmak için iki santimetre-dört santimetre yarım daire filtre kağıdı ile domates fideleri kapağı.Fidelerin transpirasyona izin veren bir ortamda yüksek nemde tutulması önemlidir. Bunu yapmak için, filtre kağıdı ile fideler kapağı ve Micropore bant ile plaka kapatın. Dönüştürülmüş domates fidelerini 25 ila 28 santigrat derece arasında bir büyüme odasında altı ila yedi gün saklayın.Sonra yeni ortaya çıkan tüylü kökleri kesmek için steril bir neşter kullanın, ve fideler yeni tüylü kökleri üretmek için izin. İkinci nesil yeni tüylü kökler göründükten sonra, fidelerin üstündeki filtre kağıdını çıkarın ve plakayı tekrar Mikropore bandıyla kapatın. DsRed floresansını veya in vivo görüntüleme tesisi için başka herhangi bir ekipmanı görselleştirmek için, kırmızı floresan tarafından tanımlanabilen pozitif dönüştürülmüş kökleri işaretleyin.Kırmızı floresan eksikliği ile tespit edilebilir negatif olmayan dönüşümolmayan kökleri kaldırmak için bir neşter kullanın. Ana kök olarak dönüştürülmüş kökün gelişimini kolaylaştırmak için kırmızı floresan gösteren fideleri yarı mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı içeren yeni bir tabağa aktarın. Daha sonraki zaman noktalarında floresan köklerin ortaya çıkışını kontrol etmek için aynı plaka içinde kırmızı floresan göstermeyen fideler tutun.Fidelerin üzerini iki santimetreye dört santimetrelik yarım daireşeklinde bir filtre kağıdıyla kapatın, tabağı kapatın ve yeni kıllı kökler geliştirmeleri için fideleri kuluçkaya yatırın. Köklerin yüzeyinin ilk olarak aşı kaplarını suyla ıslatarak, fazla su dökerek ve plastik bir ekim tepsisine koyarak bakteriin yüzeyine maruz kalacakları aşı kaplarını hazırlayın. Cımbız kullanarak, dönüştürülmüş kökleri ile seçilen fideler aşılama kapları aktarın.Tepsiyi plastik bir sargı veya şeffaf bir kapakla kaplayın ve %65 nem oranıyla 25 ila 28 santigrat derecede tutun. Beş ya da altı gün sonra kapağı çıkarın. 28 santigrat derece bir orbital shaker beş LB sıvı ortamda Ralstonia büyümek, 200 rpm sallayarak, sabit faza kadar.Bakteri sayılarını belirlemek için optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün. 1 OD600 su ile bakteri kültürünü seyreltin. Dönüştürülmüş domates bitkilerini içeren 16 ila 20 aşı kabını aşı tepsisine yerleştirin.Sonra tepsiye seyreltilmiş bakteriyel inoculum 300 mililitre dökün ve bitkilerin 20 dakika boyunca inoculum emmek için izin verin. Bundan sonra, çömlekçilik toprak tabakası ile yeni bir tepsi hazırlayın. Aşılanmış kapları yeni tepsiye taşıyın ve tepsileri %75 nem, 26 ila 28 derece arasında bir sıcaklık ve 12 saatlik ışık ve 12 saatlik karanlık bir fotoperiile bir büyüme odasına yerleştirin.Burada, domates kökleri dönüştürülür ve bakteriyel solgunluk hastalığı nın çalışması için basit genetik analiz yapmak için Ralstonia ile aşılanır. Hastalık belirtilerinin gelişimi boş bir vektör ile dönüştürülmüş kökleri ile domates bitkileri ve domates CESA6 hedefleyen bir RAI yapı ile dönüştürülmüş olanlar izlenir. Hastalık indeksi verileri, zaman içinde aynı deneysel birimden sıfırdan dörde kadar rasgele bir ölçeğe göre toplanır ve parametrik veriler için standart testlerin kullanımını göz ardı eden Gaussian dağılımını takip etmez.Standart bir yaklaşım olarak, bir U Mann-Whitney, iki kuyruklu, parametrik olmayan test hem kontrol ve enfeksiyon eğrileri karşılaştırmak için kullanılır. Bu analize göre, her iki eğrinin ortancaları arasındaki fark önemsiz gibi görüner. Ayrıca hastalık ilerleme eğrisi altında alan ölçmek mümkündür, hangi tek bir değer de hastalık ilerleme birden fazla gözlem birleştirerek sağlar.Hastalık ilerleme eğrisi altında alan, enfeksiyon sürecinin sonunda domates CESA6 RNAi bitkilere göre kontrol tesisleri için daha yüksek bir değer gösterir, domates CESA6 susturulan bitkiler kontrol tesisleri daha Ralstonia enfeksiyonuna karşı daha dayanıklı olduğunu gösteren. Güven aralıkları, yüksek olasılıkla, belirli bir değişkenin popülasyon değerinin bulunduğu bir değer aralığını tahmin etmenin bir yolunu sunar. Burada görüldüğü gibi, kontrol ve enfeksiyon eğrileri için%95 güven aralığının alanı, CESA6 susturulduğunda daha yüksek bir direnç şansı tahmin eder.Hastalık indeksi değerleri, sıfıra karşılık gelen ikiden daha düşük bir hastalık indeksi ve bire karşılık gelen ikiden daha yüksek bir hastalık indeksi göz önüne alındığında ikili veriye dönüştürülebilir. Bu Ralstonia aşısı sonrası bir sağkalım eğrisi temsilsağlar. Gehan-Breslow-Wilcoxon istatistiksel testine göre kontrol ve enfekte bitkiler arasındaki sağkalım oranı arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildir.CESA6'nın ekspresyonu, aşılama adımından önce rastgele seçilmiş iki kökte analiz edilir ve Ralstonia'ya karşı gelişmiş direncin CESA6'nın azaltılmış ifadesi ile ilişkili olduğunu gösterir. İki seçim turundan sonra ,%35-40 arasında bir dönüşüm oranı elde edilebilir ve bu değer ek seçim turları gerçekleştirilerek artırılabilir. Bu işlemi gerçekleştirirken, fidelerin yüksek nemi korumak için bir filtre kağıdı parçasıyla kaplı tutulması ve gaz değişimini sağlamak için plakaların Mikropore ile mühürlemesi önemlidir.Kök dönüşümünden sonra, tedavilerin çoğu kök fizyolojisi gözlem veya moleküler biyoloji, hücre biyolojisi veya biyokimya kullanarak bitki yanıtı çalışma için uygulanabilir. Esas olarak, bu teknik sınırlı kaynaklara sahip araştırmacılar domates kökleri bakteriyel enfeksiyon genetik analizi gerçekleştirmek için izin verecektir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...