Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

ونحن ممتنون لاندرياس لادورنر وفرانك شونورير للدعم السخي. نشكر ساندرا يسر علي المساعدة التقنية الممتازة و Akanksha Roy لتوليد بيانات الطيف الكتلي. نحن نعترف بمراكز الأسهم في بلومنقتون وفيينا لتوفير الذباب. ونشكر المركز الأساسي للتصوير الإحيائي للمساعدة في التصوير البؤري المركزي والتحليل التحليلي لعينات قياس الطيف الكتلي ، سواء في المجمع الطبي الحيوي LMU (Martinsried, DE). وقد دعمت عملنا من قبل المانيه Forschungs Gemeinschaft (MLS ، SP 1662/3-1) ، ومركز للعلوم البروتين المتكاملة ميونيخ (سيبسم) في جامعه لودفيغ-ماكسيميليان ميونيخ (MLS) ، وفريدريتش باور ستيفتونغ (MLS) ، والدولية ماكس مدرسه بلانك للبحوث (EN).

1. تجهيز العرائس
<ol><li>رفع الذباب من النمط الجيني المطلوب في زجاجات (الشكل 1ه). اما جعل الوجه الطازجة من المخزون تشريح أو تعيين الصليب مع ما لا يقل عن 20 الذباب العذراء الإناث. الحفاظ علي الزجاجات حتى تبدا الذباب إلى الدمى.</li>
	<li>جمع ما قبل pupae مع فرشاه الطلاء المبللة ونقل إلى ورقه فلتر مبلله في صحن بيتري مم 60 (الشكل 1و).</li>
	<li>الجنس والعرائس ، وجمع الجنس المناسب للتجربة (الشكل 1ز). يتم تحديد الذكور من قبل وجود الخصيتين ، والتي تظهر ككرات شفافة في pupa مبهمه خلاف ذلك.</li>
	<li>تسميه طبق بيتري مع الوقت والتاريخ ، والنمط الجيني ، ثم سن عذارى إلى المرحلة المطلوبة (الشكل 1ح). ملاحظه: الحفاظ علي الصلبان/الأسهم والدمى العمرية في حاضنه التي تسيطر عليها درجه الحرارة (اي ، 25 درجه مئوية أو 27 درجه مئوية لصلبان RNAi ، وزيادة النشاط Gal4 في درجات حرارة اعلي يزيد من ضربه إلى أسفل كفاءه40). تاكد من ان الرطوبة عاليه بما فيه الكفاية حتى العرائس لا تجف عند الشيخوخة عده أيام.</li>
</ol>2. تشريح IFM قبل 48 h منتدى الدعوة الاتحادية
<ol><li>تجميع المعدات اللازمة بما في ذلك اثنين من ال#5 البيولوجيا الصف ملقط ، ماصه ، ونصائح ماصه ، والجليد الجاف ، و (لعينات RNA) كاشف العزلة (انظر جدول المواد). الاضافه إلى ذلك ، البرد الأسود تشريح الاطباق (انظر جدول المواد) ، 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) العازلة ، و 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغرى علي الجليد.</li>
	<li>باستخدام فرشاه الطلاء المبللة ، نقل العرائس المقسمة إلى صحن التشريح الأسود شغل حوالي الثلثين مع الباردة 1x تلفزيوني (الشكل 2ا ، ب). الانتقال إلى المجهر تشريح الفلورسنت. ملاحظه: استخدام العديد من عذارى كما يمكن تشريحها في غضون 30 دقيقه نافذه الوقت. اعتمادا علي الخبرة ، وهذا يتراوح بين 3 و 15 pupae. انظر الأساليب التكميلية لمناقشه بدائل الاطباق السوداء التشريح.</li>
	<li>باستخدام ملقط #5 ، دفع واحده من العرائس إلى الجزء السفلي من طبق تشريح السوداء وضبط التكبير المجهر والتركيز علي رؤية بوضوح pupa (الشكل 2ج).</li>
	<li>فهم الامامي من pupa مع ملقط واحد (الشكل 2د) ، ثم كزه العرائس مع طرف واحد من ملقط الأخرى قليلا خارج المركز في البطن ، خلف الصدر مباشره. هذا يحمل pupa في مكان ويمنع IFMs من الانتقال إلى البطن (الشكل 2ه). ملاحظه: بدء توقيت طول تشريح من هذه النقطة ، حالما يتم تعطيل سلامه الخوادر. استخدام طول محدد من تشريح (علي سبيل المثال 20-30 دقيقه) للحد من وفاه العضلات والتغييرات المصاحبة الناسخة والبروتينية. تشريح أكبر عدد ممكن من الذباب في هذه الفترة من الزمن.</li>
	<li>باستخدام الملقط الأول ، قم بازاله النصف الامامي من الحالة الخوادر (الشكل 2و).</li>
	<li>استخدم نفس الملقط لقرصه الدمى المكشوفة خلف الصدر مباشره ، وافصل البطن عن الصدر (الشكل 2ز).</li>
	<li>باستخدام ملقط ، ضغط برفق الجزء الامامي من الصدر (ل < 35 ح المنتدى) أو مزق فتح الصدر لفضح فلوريسسينتلي المسمي IFMs (الشكل 2ح). سيتم فصل IFMs بسهوله من البشرة ، حيث ان مرفقات الأوتار في النقاط الزمنيه المبكرة هشه. تجاهل الذبيحة المتبقية باستخدام ملقط لدفعها إلى الجانب الآخر من الطبق.</li>
	<li>الخطوات المكررة 2.3 – 2.7 ، تشريح العرائس الاضافيه.</li>
	<li>جمع ألياف IFM مع ملقط وتنظيمها في كومه في الجزء السفلي من الطبق الأسود تشريح (الشكل 2I, J). أزاله اي الحطام عن طريق دفعها للخروج من مجال الرؤية باستخدام ملقط. ملاحظه: مع الممارسة ، يمكن جلب نصائح ملقط إلى قرب وثيق دون لمس بعضها البعض. ويمكن استخدام هذه التقنية لانتزاع بشكل فضفاض IFMs دون تدميرها. وتشمل الأساليب البديلة بلطف دفع أو رفع IFMs مع طرف واحد أو ملقط مغلقه تماما ، أو أخذ بعض الدهون أو غيرها من الانسجه مع IFMS وأزاله الدهون كما هو موضح في الخطوة 2.10.</li>
	<li>مراقبه الجودة عينه العضلات IFM ، وذلك باستخدام ملقط لأزاله العضلات غير IFM ، والدهون ، واهاب ، وما إلى ذلك من العينة (الشكل 2K ، L). ملاحظه: مع Mef2-Gal4, IFM هو المسمي أكثر قوه من أنواع العضلات الأخرى في وقت مبكر (الشكل 2k, k '), السماح بازاله العضلات القفزة وعضلات اليرقات علي أساس كثافة الفلورية وشكل العضلات. الدهون وبشره الانسجه تبدو مختلفه وليست المسمية بواسطة التسمية الفلورية الخاصة بالعضلات (الشكل 2k, k '). راجع قسم المناقشة للخطوط Gal4 الأخرى التي تسمي IFM.</li>
	<li>باستخدام طرف ماصه قص ، نقل كومه من IFMs إلى 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير مليئه 250 μL من المبردة 1x تلفزيوني (الشكل 2م-O). انتقل فورا إلى القسم 4. ملاحظه: قد تضيع عينات IFM ببساطه عن طريق التصاق بجانب طرف الماصة. يمكن ان يجعل العازل المؤقت لاعلي ولأسفل عده مرات قبل جمع IFMs نصائح قياسيه اقل التصاقا ، ويمكن ان تساعد نصائح بيرفلوروالكوكسي (PFA) (انظر جدول المواد) ذات التوترات السطحية المنخفضة في منع فقدان العينة.</li>
</ol>3. تشريح IFM بعد 48 h منتدى الدعوة الاتحادية
<ol><li>تجميع المعدات اللازمة بما في ذلك اثنين من ال#5 البيولوجيا الصف ملقط ، مقص غرامه ، والشرائح المجهر الزجاج القياسية ، مزدوجة عصا الشريط ، ماصه ، ونصائح ماصه ، والجليد الجاف ، و (للتطبيقات RNA) العزل كاشف (انظر جدول المواد). البرد 1x تلفزيوني وأنابيب الطرد المركزي الصغير علي الجليد.</li>
	<li>باستخدام فرشاه الطلاء المبللة بخفه ، نقل الدمى المقسمة إلى شريط من الشريط اللاصق المزدوج علي الوجه المثبت علي شريحة المجهر (الشكل 3ا). وضع عذارى في خط المنحى في نفس الاتجاه (بطني أسفل والامامي نحو الجزء السفلي من الشريحة). ملاحظه: يجب الحرص علي عدم استخدام الكثير من الماء علي فرشاه الطلاء أو فلتر ، أو العرائس لن عصا جيدا. إذا لم تلتصق العرائس ، جففيها بواسطة النقل الاولي إلى فلتر جاف أو مناديل ورقيه. جبل كما العديد من العرائس كما يمكن تشريحها في غضون 30 دقيقه نافذه الوقت ، من الناحية المثالية ~ 10 عذارى.</li>
	<li>أزاله العانة من القضية pupa. استخدام ملقط لندف بعيدا وفتح القضية الخوادر فوق الحلزونيات الاماميه (الشكل 3ب).</li>
	<li>حرك برفق زوجا من الملقط الناتئ نحو الخلف ، وقطع الحالة بالاصبع كالملقط الحركة (الشكل 3ب '). يجب الحرص علي عدم تمزق pupa الكامنة. تحرير pupa من القضية فتح ونقلها علي الفور إلى قطره من 1x تلفزيوني علي شريحة المجهر الثاني (الشكل 3ب "، ج).</li>
	<li>كرر الخطوات 3.3 و 3.4 لكل عذارى في السطر ، ثم قم بتعيين شريحة الشريط المزدوج جانبا.</li>
	<li>باستخدام مقص غرامه ، وقطع البطن من pupa بعيدا عن الصدر ودفعها إلى كومه منفصلة (الشكل 3d ، d '). كرر لما تبقي من pupae. ملاحظه: بدء توقيت طول تشريح مع الخطوة 3.6 ، بمجرد ان يتم تعطيل سلامه الخوادر. تشريح أكبر عدد ممكن من الذباب في 20 – 30 دقيقه لمنع موت الخلايا والتغييرات المرتبطة بالناسخ والبروتيني. عند تشريح 1 د البالغين أو > 90 ح pupae ، فانه غالبا ما تكون مريحه للخطوات في وقت لاحق لأزاله الراس بالاضافه إلى ذلك مع مقص غرامه.</li>
	<li>باستخدام ورقه المناديل الورقية ، وأزاله غالبيه 1x تلفزيوني (غائم عموما مع الدهون المعلقة) ، فضلا عن كومه من بطون (الشكل 3ه). أضافه قطره من الطازجة ، والمبردة 1x تلفزيوني إلى الthoraxes المتبقية.</li>
	<li>استخدام مقص لقطع الصدر في نصف (الشكل 3f ، f ') عن طريق قطع من الراس إلى أسفل محور الجسم الطولي في حركه واحده. بالتناوب ، إذا تمت أزاله الراس ، أولا ادراج المقص حيث تم إرفاق الراس وقطع النصف العلوي من الصدر طوليا بين IFMs. ثم ، قطع الجانب البطني من الصدر مع خفض الثاني في نفس الاتجاه.</li>
	<li>كرر الخطوات 3.7 و 3.8 لجميع عذارى ليتم تشريحها ، وتوليد كومه من الصدر هيميسيكتيونس بالقرب من وسط الشريحة. تاكد من ان هناك ما يكفي 1x المبردة تلفزيوني علي الشريحة بحيث هيميسيكتيونس لا تجف. ملاحظه: بعد 48 h منتدى الدعوة الاتحادية ، IFMs كبيره بما يكفي لتكون مرئية تحت المجهر تشريح القياسية للعين المدربة. عند هذه النقطة في البروتوكول ، يمكن نقل العضلات مع تسميه الفلورسنت إلى نطاق تشريح الفلورسنت للمساعدة في تحديد IFM أو لأغراض التدريب ، ولكن هذا ليس ضروريا.</li>
	<li>تشريح ال IFMs خارج الصدر. عزل أحد هيميسيكتيونس باستخدام ملقط ال#5 (الشكل 3G ، H). ادخل برفق النصائح الخاصة بملقط واحد فوق وتحت منتصف IFMs (الشكل 3G ' ، H '). في حين عقد ملقط الاولي لا يزال ، واستخدام مقص غرامه لقطع واحده من نهاية IFM بعيدا عن اهاب والأوتار. ثم ، قطع الطرف الآخر من IFM خاليه من اهاب (الشكل 3G '' ، H ''). ملاحظه: اعتمادا علي اتجاه الصدر بعد قطع IFM الاولي ، فمن المفيد لتدوير الصدر 180 درجه بحيث قطع IFM الثاني هو أسهل لأداء.</li>
	<li>أزاله حزمه IFM من الصدر مع ملقط (الشكل 3ز '' ، H '''') ، نقله إلى حافه فقاعه تلفزيوني لاستخدام التوتر المياه لعقد في مكان (الشكل 3ط)... دفع الذبيحة إلى الجانب الآخر من الشريحة. كرر لهيميسيكشنز الصدرية المتبقية ، وتوليد مجموعه من الifms تشريح. ملاحظه: إذا كان IFMs لا تبقي في كومه أنيق ، وأزاله بعض من 1x تلفزيوني مع الانسجه. يجب الحرص علي عدم السماح لجميع الإذاعات التلفزيونية تتبخر ، والتاكد من ان IFMs تشريح و hemithoraxes تبقي مغطاه العازلة.</li>
	<li>بعد تشريح جميع IFMs ، بسرعة تنفيذ مراقبه الجودة علي العضلات تشريحها. باستخدام ملقط #5 ، وأزاله اي العضلات القفز أو الشظايا اهاب التي قد وجدت طريقها إلى العينة (الشكل 3J-K ''''). ملاحظه: تظهر العضلات القفز مختلفه من IFM. إذا تشريح Mef2-Gal4 المسمي العضلات تحت الفلوري, القفز العضلات لديه فلوري أضعف وشكل مختلف والملمس. تحت الضوء العادي ، فانه يبدو شبه شفافة في حين IFMs هي مبهمه ، حليبي الأصفر (الشكل 3j-j '''' ، K).</li>
	<li>باستخدام التوتر المياه ، والتقاط (ولكن لا squish) IFMs تشريح بين زوج من الملقط (الشكل 3L). نقل IFMs إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL معباه مسبقا مع 250 μL من المبردة 1x تلفزيوني (الشكل 3م). المضي قدما فورا مع القسم 4. ملاحظه: عندما يتم إحضارها نصائح ملقط في القرب من بعضها البعض ورفعها من حل العازلة ، يسبب التوتر المياه فقاعه من العازلة ليتم القبض بين النصائح ملقط. إذا كانت IFMs موجودة أيضا في هذه الفقاعة ، فانه يمكن رفعها من الحل ونقلها بسهوله إلى وعاء آخر مملوء بالمخزن المؤقت. من المهم ان تضغط علي ملقط لجلب النصائح بالقرب من بعضها البعض دون لمس بعضها البعض ، لتجنب ماشيتينغ الانسجه الملتقطة في فقاعه العازلة.</li>
</ol>4. بيليه والحفاظ علي عينه IFM
<ol><li>بيليه IFMs بواسطة يطرد 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي لمده 3-5 دقيقه في 2,000 x g في جهاز الطرد المركزي الجدول الأعلى (الشكل 4ا ، ب).</li>
	<li>قم بازاله المخزن المؤقت باستخدام طرف ماصه (الشكل 4ج).
</li>
	<li>للتطبيقات RNA ، أعاده تعليق بيليه IFM في 50-100 μL من المخزن المؤقت المطلوب العزل RNA (انظر جدول المواد، الشكل 4د). والا ، انتقل إلى الخطوة 4.4. ملاحظه: IFMs يمكن ان تكون جافه-المجمدة بعد الخطوة 4.2 للتحضيرات قياس الطيف الكتلي أو عزل الحمض الريبي النيبالي مع مجموعات تجاريه (انظر النتائج التمثيلية). للتطبيقات RNA ، يتم الحصول علي نتائج أفضل عن طريق أعاده تعليق فورا وتجميد بيليه IFM في العازلة العزلة.</li>
	<li>تجميد العينة علي الجليد الجاف أو تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل (الشكل 4ه). يخزن عند-80 درجه مئوية حتى يصبح جاهزا للخطوات اللاحقة في اعداد العينة للتحليل النهائي. ملاحظه: بعد الحجز بالتبريد ، يمكن تخزين العينات لعده أشهر قبل المعالجة للتحقيق النهائي.</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

في هذا البروتوكول ، نقدم التقنية الاساسيه لتشريح دروفيا ifms من الدمى المبكرة والمتاخره المرحلة لعزل البروتين ، الحمض النووي ، RNA أو الجزيئات الأخرى. ويمكن تكييف البروتوكول بسهوله لتشريح IFM من الذباب الكبار. ونحن نظهر فائده من بروتوكول لدينا تشريح لل mRNA-Seq ، البروتينية والتطبيقات RT-PCR. مع التحسين المستمر للتكنولوجيات اوميكس للسماح بتحليل العينات مع مواد البداية اقل وتركيزات المدخلات اقل ، وهذه الأجزاء من المرجح ان تصبح قيمه للعديد من التطبيقات الاضافيه. كما ifms هي نموذج الثابتة لاعتلال العضلات البشرية4,24 والعضلية من نوع التنمية المحددة9,12, ونحن نتصور, علي سبيل المثال, ifms التخصيب الأيض, التحقيقات من التشكيل الكروماتين عبر 3C أو 4C ، والربط تقييم الشبكة عن طريق التفاعلات كليب أو فوسفوس-بروتينيه من ميوفيبريلوجينيسيس.
من المهم ان نعتبر ان هذه الأجزاء تنتج عينه المخصب ل IFM بدلا من عينه IFM نقيه. وهذا أمر لا مفر منه بسبب الحركية العصبية ، المرفقات وتر والاجتياح الرغامي من ألياف العضلات. ويمكن استخدام تحليل المعلوماتية الحيوية لتحديد الجينات المخصبة IFM أو البروتينات ، ولكن هناك حاجه إلى مزيد من التجارب لإثبات انها في الواقع IFM الخاصة. ويمكن النظر إلى نقاء العينة باستخدام علامات الانسجه المحددة المنشورة مثل45 شريطيه (وتر) ، Act79B4،44 (العضلات الانبوبيه) ، Act88F15 (ifm) ، أو syb46 (الخلايا العصبية المحددة). وقد يكون من الممكن استخدام هذه العلامات لتطبيع مجموعات البيانات مع المحتوي الخاص بالاتحاد ، ولكن المستخدمين يحذرون من ان التغيرات الزمنيه في التعبير عن الجينات المستخدمة في التطبيع ، مثل الجينات أو الأنابيب الخاصة بالاتحاد ، قد تنحاز إلى مثل هذا النهج.
وراثيا المشفرة الانسجه المحددة طرق الوسم ، علي سبيل المثال EC-وضع العلامات47،48 أو باب وسم49،50 لعزل الجيش النيبالي الريبي وقد تم تطويرها في السنوات الاخيره ، والتي قد تساعد في الحصول علي حقا عينه [رنا] خاصه بالانسجه. ومع ذلك ، الجماعة الاوروبيه-وضع العلامات يتطلب تغذيه مستمرة من الذباب47 التالي لا ينطبق خلال مراحل الخوادر. قد يكون حساسية واكتمال المدونات المسمية بابف القيود51. وتعقد نهج FACS لعزل ألياف العضلات الفردية بالحجم الكبير والطبيعة المتزامنة IFMs. 52سليمه ،يمكن تطبيق نهج نمط53 لعزل المقصورات فرعيه معينه من ifms ، والتي قد تكون مفيده لعزل السكان النقي من نوى ifms أو الميتوكوندريا. لا تزال المقاطع اليدوية هي المعيار الحالي للحصول علي انسجه IFM السليمة لمعظم التطبيقات المتلقية للمعلومات.
نوعيه العينة يعتمد علي عده خطوات حاسمه في عمليه التشريح. الأقسام هي المطالبة من الناحية الفنية ، مع سرعه التشريح ونقاء العينة زيادة مع الخبرة. تشريح لفترات قصيرة من الزمن (20-30 دقيقه) في العازلة المبردة دون المنظفات وتجميد فورا يساعد علي الحفاظ علي سلامه العينة ، كما لوحظ سابقا لعزل وتر الماوس54. IFMs يمكن ان تكون بنجاح الجافة المجمدة بعد أزاله جميع العازلة من بيليه ، ولكن علي وجه التحديد لعزل الجيش النيبالي الريبي ، وتجميد عينات في العازلة العزلة يميل إلى إنتاج نتائج أفضل. يتم الجمع بين ifms من ما يصل إلى 20 فصل منفصلة قبل الحمض الريبي النيبالي أو عزل البروتين ، مما يسمح التوسع وجمع ما يكفي من المواد ، حتى من الوقت المبكر أو المسوخ16،32، للتحليل المصب.
ل [رنا] تطبيقات, الخطوة حاسمه أكثر يمكن كنت العزلة من ال [رنا]. غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم العزلة (الطريقة 1 أعلاه) يتفوق معظم مجموعات التجارية اختبارها ، وكما لوحظ سابقا ، هو اقل تكلفه بكثير55. التغير يلاحظ في [رنا] عزل غله مع مجموعه تجاريه اتفاق مع ملاحظات سابقه56,57. نضيف أيضا الجليكوجين خلال الايزوبروبانول هطول الامطار للمساعدة في استرداد جميع RNA. إلى ما بعد [رنا] غله, هو مهمة ان يتحقق [رنا] نزاهة ان يضمن ان العينة يتلقى لم يكن مجزاه أو تدهور اثناء التشريح وعزل عمليات. ومن الضروري أيضا العمل خاليه من RNase. وأخيرا ، فان اختيار RT-كيت يمكن ان تؤثر علي حساسية عمليه النسخ العكسي. وفي حين ان هذه النقاط لا تناقش بالتفصيل في كثير من الأحيان ، فانها تؤثر علي نوعيه عينه الاتحاد والبيانات التي يتم الحصول عليها من التطبيقات النهائية.
العديد من التعديلات الهامه تعيين البروتوكول باستثناء بروتوكولات تشريح IFM الموجودة. علي الرغم من وجود بروتوكول تشريح مفصل ل ifm المناعية موجود19، ويقدم هذا البروتوكول نهجا مختلفا لتفكيك الخوادر التي تسمح العزلة الأسرع من الانسجه ifm. وهذا يسمح بجمع كميات كبيره من انسجه IFM (التحدث نسبيا) مع فترات تشريح محدوده لمنع التغيرات البروتينية أو الناسخة. البروتوكولات الأخرى تصف تشريح ifm الكبار لتصور تلطيخ gfp في الفردية myoالفايليلز39 أو لتلطيخ العضلات الجسم الجدار58، ولكنها لا تعالج تشريح في مراحل الخوادر أو لعزل الحمض الريبي النيبالي أو البروتين. هذا النهج هو أيضا متميزة عن البروتوكول الحالي لتشريح المجهرية من الخوادر ifms من الحلوى38، والتي قد تولد عينه الأنقى ifms ولكن هو أكثر كثافة العمالة وتنتج مواد اقل. بالمقارنة مع غيرها من السريع الكبار ifm البروتوكولات تشريح38،39، يتم عزل ifm في المخزن المؤقت بدون المنظفات للحد من الإجهاد التعريفي وغيرها من التغييرات الرئيسية التعبير.
التقدم الرئيسي في هذا البروتوكول هو ادراج مراسل الفلورية الحية ، مما يسمح بعزل ifms في مراحل الخوادر في وقت مبكر. نحن الخسيس استخدام Mef2-GAL459 القيادة اما UAS-CD8:: gfp أو Uas-gfp:: Gma60. وهذا يسمح الوسم التفاضلية ifm (عضلات الطيران هي أكثر بقوة المسمي وشكل مختلف من العضلات الخوادر الأخرى) ، فضلا عن أداء GAL4-uas-التلاعب القائم ، علي سبيل المثال الإنقاذ أو التجارب rnai. من الممكن أيضا الجمع بين Mef2-GAL4 مع الحوض-GAL80ts لتجنب rnai المرتبطة الفتك المبكر أو مع uas-Dcr2 لزيادة الكفاءة rnai40.
هناك اضافيه GAL4 السائقين أو gfp-خطوط المتاحة التي تختلف في خصوصية نوع العضلات, نمط التعبير الزمني, وقوه السائق19,61 التي يمكن استخدامها بدلا من Mef2-GAL4. علي سبيل المثال ، يتم التعبير عن Act88F-GAL4 لأول مره حول 24 ح منتدى المحيط الهادي ، لذلك لا يمكن استخدامها للنقاط الزمنيه السابقة. ومع ذلك ، فانه بشده تسمي IFM وقد تكون مفيده لتجنب الفتك المبكر المرتبطة RNAi. له-gfp أو Act88F-GFP التسمية ifm ، مره أخرى مع القيود الزمنيه ، لكنها تجنب الاعتماد GAL4 من علامة التعبير وقد تكون مفيده في تركيبه مع خلفيه متحولة من الاهتمام. تتوفر قوائم بخطوط العلامات المحتملة الأخرى19. وتجدر الاشاره أيضا إلى ان استخدام الجينات المتحولة ونظام GAL4/UAS قد يسبب الآثار الجينية التعبير ، لذلك فمن المهم استخدام الضوابط المناسبة ، علي سبيل المثال خط السائق عبرت إلى سلاله الخلفية من نوع البرية ، بحيث يفترض ان هذه التحف نفسه في جميع العينات.
مع الفيديو المصاحبة, هذا البروتوكول المفصل يهدف إلى جعل الخوادر ifm تشريح أكثر سهوله وتعزيز استخدام النهج اوميكس لدراسة تنميه العضلات. اقتران قوه الوراثة دروفيا والبيولوجيا الخلية مع الكيمياء الحيوية واختبارات اوميكس يمكن الوصول اليها من خلال تشريح ifm لديه القدرة علي تعزيز الفهم الألى لتولد ووظيفة العضلات. ستوفر الدراسات المستقبلية التي تربط بين الملاحظات علي مستوي الانظمه الخاصة بالتدوين والتنظيم البروتيني للنواتج الايضيه والوظيفية فهم أعمق للتطور النوعي للعضلات والتسبب في اضطرابات العضلات.

توفر تقنيات اوميكس الحديثة رؤى هامه في تنميه العضلات واليات الكامنة وراء اضطرابات العضلات البشرية. علي سبيل المثال ، كشف تحليل بيانات النسخ المدمجة مع التحقق الوراثي والبيوكيميائي في النماذج الحيوانية ان فقدان عامل الربط RBM20 يسبب اعتلال عضله القلب المتوسعة بسبب تنظيمها لشبكه مستهدفه من أكثر من 30 ساركوميري الجينات المرتبطة سابقا بامراض القلب ، بما في ذلك التيتين1،2،3.
في المثال الثاني ، أظهرت الدراسات التي أجريت من ثقافة الخلية ، والنماذج الحيوانية ، والمرضي البشريين ان ضمور الخلايا العضلية يسببه اضطراب في تنظيم الجيش النيبالي الريبي بسبب تنحيه المسك الأعمى (mbnl) والحامل لCELF14،5. تساعد الديناميكيات المتعددة الانظمه والزمانيه بين MBNL و CELF1 (التي تسمي أيضا CUGBP1 أو برونو-Like 2) علي شرح أنماط الربط الجنينية المستمرة في مرضي الضمور العضلي. بالاضافه إلى ذلك ، فان الشبكة الكبيرة من الأهداف المقننة تساعد علي شرح الطبيعة المعقدة للمرض4،6،7،8. غالبيه هذه الدراسات تستخدم نهج اوميكس في الكائنات الحية النموذجية الوراثية لفهم أليات الكامنة وراء مرض العضلات البشرية. وعلاوة علي ذلك ، فانها تسلط الضوء علي اهميه أول فهم الزمنيه والانسجه من نوع التعبير الجيني محدده ، وتعديل البروتين ، وأنماط الأيض في العضلات السليمة لفهم التغييرات في العضلات المريضة أو الشيخوخة.
دروفيا ميلانوجاستر هو كائن آخر النموذج الجيني الراسخة. هيكل ساركوميري وكذلك مكونات ساركوميري الفردية يتم الحفاظ عليها بشكل كبير من الذباب إلى الفقاريات4،9،10، وعضلات الطيران غير المباشرة (ifms) أصبحت نموذجا قويا للدراسة جوانب متعددة من تنميه العضلات11,12. أولا, عضلات الطيران لييفي وظيفيا ومتميزة شكليا من عضلات الجسم أنبوبي11,13, السماح بالتحقيق في العضلات من نوع أليات التنموية المحددة. وقد تم تحديد عوامل النسخ بما في ذلك Spalt الرئيسية (سالم)14، اكسترادينتيكلي (exd) ، والصدرية (hth)15 والمنظمين مصير لييفي. بالاضافه إلى ذلك, المصب من سالم, CELF1 homolog Bruno1 (Bru1, أريت) يوجه برنامج الربط لييفي محدده16,17.
ثانيا ، ifms هي نموذج مهم لفهم عمليه التولد نفسها ، من الانصهار استدامه والتعلق myotube إلى ميوفيبريلوجينيسيس ونضوج ساركوميري9،18،19. ثالثا ، تسمح الوراثة الوراثية بالتحقيق في المساهمات التي تقدمها البروتينات الفردية ، ومجالات البروتين ، والبروتينات البروتينية إلى تشكيل ساركوميري ، والوظيفة ، والخصائص الفيزيائية الحيوية20،21،22 ،23. أخيرا, وقد وضعت نماذج ifm لدراسة اضطرابات العضلات البشرية متعددة, مثل ضمور عضلي, ميوفيبريلار ميات, اضطرابات العضلات التنكسية, الاكتيباثيس, الخ.24,25,26 ،27، وقدمت رؤى هامه في أليات المرض والعلاجات المحتملة28،29،30. وهكذا ، دروفيبيلا هو نموذج مفيد لمعالجه العديد من الاسئله المفتوحة في مجال التولد ، بما في ذلك أليات من نوع العضلات النسخ المحددة ، والربط ، وتنظيم الكروماتين ، فضلا عن دور الأيض في تنميه العضلات. تطبيق تقنيات الاوميكس الحديثة ، وخاصه بالاقتران مع مجموعه واسعه من الاختبارات البيولوجية الوراثية والبيوكيميائية والخلوية المتاحة في دروفيا، لديه القدرة علي تعزيز فهم العضلات بشكل كبير التنمية ، والشيخوخة ، والمرض.
Ifms هي أكبر العضلات في ذبابه, تمتد ما يقرب من 1 ملم عبر طول الصدر في البالغين31,32. ومع ذلك ، فان هذا الحجم الصغير يولد التحدي المتمثل في الحصول علي عينه كافيه لتطبيق تقنيات الاوميكس في دروفيا بطريقه محدده من نوع الانسجه. وعلاوة علي ذلك ، ifms هي جزء من العضلات الكبار التي تتشكل خلال مراحل الخوادر. الصمامات المنصهرة لتشكيل myotubes ، والتي تعلق علي الأوتار حوالي 24 ساعة بعد تشكيل puparium (منتدى المحيط الهادي) والخضوع لخطوه الضغط اللازمة لبدء ميوفيبريلوجينيسيس حول 30 ح المنتدى الاتحادي العام (الشكل 1ا-د)18،33، 34.
ألياف العضلية ثم تنمو لتمتد علي طول الصدر ، مع myoالفايلز تمر مرحله النمو الاوليه التي تركز علي ساركوميري بالاضافه إلى حوالي 48 h منتديات التنمية الاتحادية ، ومن ثم الانتقال إلى مرحله النضوج ، التي ساركوميري تنمو في الطول والعرض وهي تشكيلها لإنشاء امتداد التنشيط بواسطة 72 h المنتدى (الشكل 1ا-د)32،35. بداية نضوج ألياف يتم التحكم فيها جزئيا علي الأقل من قبل سالم و E2F32،36،37، ومتعددة ifm المحددة البروتين ساركومير التي يتم التحكم الربط من قبل Bru1 وأدرجت خلال هذا مرحله16،17. الذباب الناضجة eclose من 90-100 ح منتدى الدعوة. وهذا يعني ان لدراسة تنميه العضلات, ifm يجب ان تكون معزولة مع كميه كافيه, الجودة, والنقاء من النقاط الزمنيه الخوادر متعددة لتسهيل التحليل باستخدام نهج اوميكس.
وقد تم نشر العديد من البروتوكولات لتشريح IFM. في حين ان هذه البروتوكولات تعمل بشكل جيد للتطبيقات المقصودة ، لا شيء مثالي للنهج اوميكس. البروتوكولات التي تحافظ علي المورفولوجية ifm للمناعة من الخوادر والكبار ifm19، عزل ألياف ifm للتقييم الميكانيكي31، أو الاستفادة من التشريح المجهري لل ifm من الحلوى38 هي متخصصة جدا والوقت و العمالة المكثفة للحصول علي معقول كميات كافيه من الانسجه ifm للتطبيقات اوميكس. وقد وضعت بروتوكولات أخرى لتشريح السريعل38البالغ ifm علي وجه التحديد،39، التالي لا تنطبق علي مراحل الخوادر ، واستخدام المخازن المؤقتة التي ليست مثاليه أو قد تكون غير متوافقة مع ، علي سبيل المثال ، العزل RNA. التالي ، هناك حاجه لتطوير نهج جديده لعزل الخوادر ifm للتطبيقات الكيمياء الحيوية أو اوميكس.
هنا نقدم بروتوكولا لتشريح ifm خلال مراحل الخوادر التي تم استخدامها بنجاح للتحليل mrna-Seq من 16 ح المنتدى من خلال مراحل الكبار16,32. يستخدم البروتوكول تسميه البروتين الفلوري الأخضر (GFP) للتعرف علي IFMs في جميع مراحل النمو العفن والبالغ ، مما يسمح بالتشريح الحي تحت مجهر تشريح الفلورسنت. النهج هو اقل كثافة العمالة ، مع إنتاجيه اعلي من بروتوكولات تشريح IFM القائمة. وهذا يسمح العزلة السريعة والتبريد من العينات ، وتوليد ما يكفي من المواد بعد عده جولات من تشريح للنهج اوميكس ، فضلا عن النسخ العكسي القياسية تفاعل البلمره سلسله (RT-PCR) أو الغربية التنقيط.
نحن نقدم البروتوكول في جزاين ، مما يدل علي كيفيه تشريح بسرعة ifms قبل 48 h منتديات الدعوة (خلال التحول في وقت مبكر ، عندما ifms المرفقات هي أكثر هشاشة) وبعد 48 h منتديات الدعوة (عندما خطه الجسم الخوادر و ifms المرفقات محدده جيدا). ونحن نثبت اننا يمكن عزل الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة من تشريح IFMs في جميع النقاط الزمنيه وتقديم البيانات علي نهج مختلفه لعزل الجيش النيبالي الريبي والنسخ العكسي. وأخيرا ، فاننا نظهر تطبيق بروتوكول تشريح إلى mRNA-Seq ، الطيف الكتلي ، و RT-PCR باستخدام CELF1 homolog Bruno1 كمثال. نحن نظهر سوء التعبير عن البروتين ساركوميري في البيانات البروتينية من Bruno1 متحولة IFM ودراسة Bruno1 تنظيم الحدث C-الطرفية لصق من سلسله الثقيلة ميوزين (Mhc). وتوضح هذه النتائج كيف يمكن لبيانات الاوميكس ان توفر فهم أعمق للظواهر البيولوجية ، بما يكمل التجارب الوراثية والبيوكيميائية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

تعتبر عضلات الرحلات الجوية نموذجا قويا لدراسة العمليات المتنوعة مثل التنظيم المتحول ، والربط البديل ، والأيض ، والبيولوجيا الميكانيكية ، والتي تؤثر جميعها علي تنميه العضلات والميوفيبريلوجينيسيس. ويمكن لبيانات الomics ، مثل تلك المتولدة عن قياس الطيف الكتلي أو التسلسل العميق ، ان توفر رؤى ميكانيكيه هامه في هذه العمليات البيولوجية. النسبة لمثل هذه النهج ، من المفيد تحليل العينات الخاصة بالانسجه لزيادة الانتقائية والخصوصية لبصمات الأصابع. هنا نقدم بروتوكول لتشريح الفلورسنت المسمي العضلات الطيران من عذارى الحية لتوليد عينات العضلات المخصب للغاية للتطبيقات اوميكس. نحن أولا وصف كيفيه تشريح عضلات الطيران في مراحل الخوادر في وقت مبكر (< 48 ح بعد تشكيل puparium [منتديات البيئة الاتحادية]) ، عندما تكون العضلات التي يمكن التعرف عليها من قبل البروتين الفلوري الأخضر (gfp) وضع العلامات. ثم نقوم بوصف كيفيه تشريح العضلات من الدمى المتاخره (> 48 ح المنتدى) أو البالغين ، عندما يتم تمييز العضلات تحت المجهر تشريح. سيجعل البروتوكول المصاحب للفيديو هذه الأجزاء الصعبة من الناحية الفنية متاحه علي نطاق أوسع لمجتمعات البحوث العضلية والبحثية. للتطبيقات RNA ، ونحن فحص كميه ونوعيه RNA التي يمكن ان تكون معزولة في نقاط زمنيه مختلفه ومع نهج مختلفه. ونعرض كذلك ان Bruno1 (Bru1) ضروري للتحول الزمني في ميوسين سلسله ثقيله (Mhc) الربط ، مما يدل علي ان العضلات تشريح يمكن استخدامها ل mrna-Seq ، الطيف الكتلي ، وعكس النسخ العكسي البلمره سلسله التفاعل (RT-PCR) التطبيقات. هذا البروتوكول تشريح سوف تساعد علي تعزيز التحليلات اوميكس الانسجه المحددة ويمكن تطبيقها عموما لدراسة الجوانب البيولوجية متعددة من التولد.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

تعتبر عضلات الرحلات الجوية نموذجا قويا لدراسة التنظيم العابر ، والربط البديل ، والأيض ، والبيولوجيا الميكانيكية. نقدم بروتوكولا لتشريح العضلات الطائرة الفلورية المسمية من العرائس الحية لتوليد عينات عاليه التخصيب مثاليه للبروميات والتسلسل العميق. هذه العينات يمكن ان تقدم رؤى ميكانيكيه هامه في جوانب مختلفه من تنميه العضلات.

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

يسهل البروتوكول تشريح عضلة الطيران غير المباشرة التي تحمل علامة GFP من دروسوفيليا في وقت مختلف أثناء تطور الجراء لتقييم التغيرات في التعبير الجيني والبروتيني. باستخدام هذه التقنيات، يمكن تحقيق عينة عالية من عضلات الطيران الغنية مع الحد الأدنى من تدهور البروتين الحمض النووي الريبي مناسبة لRT-PCR، لطخة الغربية، أو النهج omic. هذه التشريحات المتخصصة تتطلب الممارسة والمهارة ، ولكن عدد من pupae التي يمكن تشريحها ونوعية العينات تتحسن مع الخبرة.إن البرهان البصري على هذا التشريح أمر بالغ الأهمية لتحديد كيفية تمييز عضلات الطيران عن الأنسجة غير العضلية وتسهيل العزلة السريعة لعضلات الطيران عن عينات الجرو. لمرحلة pupae، واستخدام فرشاة الطلاء ترنيد لجمع ونقل ما قبل pupae في طبق بيتري 60 ملليمتر، والجنس من pupae تحت مجهر منظار. يتم تحديد الذكور من خلال وجود الخصيتين، والتي تظهر على أنها كرات شفافة على خوارة معتمة خلاف ذلك.بعد وضع علامة على الطبق مع الوقت والتاريخ والنمط الجيني للذباب ، سن pupae في حاضنة درجة 25 إلى 27 درجة مئوية حتى المرحلة المناسبة. لتشريح IFM قبل 48 H APF ، استخدم فرشاة طلاء متجمدة لنقل الجراء المُهدَّم بشكل مناسب إلى طبق أسود تشريحي حول 2 /3 مليء بـ PBS المبرد. تحت المجهر الفلورسنت تشريح، واستخدام 5 ملقط لدفع واحد من pupae إلى الجزء السفلي من طبق تشريح الأسود.ضبط المجهر التكبير والتركيز حتى يمكن تصور pupae بوضوح. باستخدام زوج واحد من ملقط لفهم الأمامي من pupae، كزة pupae مع طرف واحد من زوج ثان من ملقط، قليلا خارج المركز في البطن، خلف الصدر. استخدام أول زوج من ملقط لإزالة النصف الأمامي من حالة pupal، وقرص pupae المكشوفة وراء الصدر مباشرة لفصل البطن من الصدر.بعد ذلك ، اضغط بلطف على الجزء الأمامي من الصدر لفضح IFMs المسمى بالفلورسنت. ثم، استخدام ملقط لتجاهل الذبيحة المتبقية إلى الجانب الآخر من الطبق، وتشريح pupae اللاحقة بنفس الطريقة. عندما تم تشريح كل من pupae، واستخدام ملقط لجمع ألياف IFM، وتنظيم الألياف في كومة في الجزء السفلي من طبق تشريح الأسود.استخدام ملقط لدفع أي حطام من مجال الرؤية، وإزالة أي من العضلات IFM غير، والدهون، و بشرة، أو الأنسجة الأخرى غير المرغوب فيها من العينات. ثم، استخدم طرف ماصة مقطوعة لنقل كومة من IFMs إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر تحتوي على 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة. لتشريح IFM بعد 48 H APF ، استخدم فرشاة طلاء مُنهية طفيفة لنقل الجراء المُهدَّم على شريط من الشريط اللاصق على الوجهين المثبت على شريحة المجهر.توجيه pupae في خط، الجانب البطني إلى أسفل، والوجة نحو الجزء السفلي من الشريحة. عندما تم وضع كل من pupae، واستخدام ملقط لندف وبصرف النظر وفتح أول حالة pupal فوق spiracles الأمامية، وشريحة بلطف زوج من ملقط dorsally، نحو الخلفي، وقطع حالة pupal كما تتحرك ملقط. تحرير pupae من القضية المفتوحة ، ونقل على الفور pupae إلى قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر الثاني.عندما يتم تحرير جميع من pupae، واستخدام مقص غرامة لقطع البطن من pupae بعيدا عن الصدر، ودفع البطن في كومة منفصلة. عندما تم إزالة جميع الصدريات، استخدم قطعة من الورق الأنسجة لإزالة غالبية برنامج تلفزيوني وكومة البطن. إضافة قطرة من برنامج تلفزيوني الطازجة والمبردة إلى الصدر المتبقية، قبل استخدام مقص لقطع من الرأس على طول محور الجسم الطولي في حركة واحدة لتقسيم الصدر في النصف.عندما تم تشريح جميع pupae، استخدم 5 ملقط لتحديد واحد من hemisections، وبلطف إدراج نصائح من ملقط واحد فوق وتحت منتصف IFMs. عقد الزوج الأول من ملقط لا يزال, استخدام مقص غرامة لقطع نهاية واحدة من IFM بعيدا عن بشرة والأوتار, قبل تناوب pupae 180 درجة, للسماح الطرف الآخر من IFM أن تكون قطع خالية من بشرة والأوتار. استخدام ملقط لنقل حزمة IFM من الصدر إلى حافة فقاعة برنامج تلفزيوني، وذلك باستخدام التوتر المياه لعقد حزمة في مكان.ثم، دفع الذبيحة إلى الجانب الآخر من الشريحة، وتشريح بقية IFM بنفس الطريقة. عندما تم جمع كل من IFMs، واستخدام 5 ملقط لإزالة أي شظايا العضلات أو بشرة التي قد وجدت طريقها إلى العينات. ثم استخدام التوتر المياه لالتقاط بلطف IFMs تشريح بين زوج من ملقط، ووضع IFM في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر التي تحتوي على 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة.تُظهر بيانات تسلسل الـ mRNA من نظام الـ BRUNO1 IR IFMs التغيرات في التعبير على مستوى الوحدة الجينية مقارنة ببيانات تسلسل النمط البري. باستخدام كامل البروتيوم الطيفية الكتلة على تشريح IFMs، ويلاحظ تنظيم مماثل في مستويات isoform البروتين والبروتين. بعد إدخال خط فخ البروتين في intron النهائي من Mhc، ويمكن ملاحظة دمج البروتين المسمى GFP في IFM كنقاط اثنين على جانبي خط M-في 90 H APF، بينما في أنسجة عضلات الساق يمكن ملاحظة إشارة GFP بشكل موحد عبر ساركومير M-الخط.عند استخدام RT-PCR على IFM تشريح، يمكن الكشف عن التبديل isoform Mhc من الحدث exon 34 إلى 37 المسمى GFP إلى الحدث 34 إلى 35 غير المسمى، بين 30 و 48 ساعة بعد تشكيل الجراء في 27 درجة مئوية. من بيانات تسلسل مرنا، الساق والقفز الأنسجة العضلية التعبير عن جميع isoforms Mhc الثلاثة، والحفاظ على التعبير عن isoform المسمى GFP في العضلات الناضجة. فشل كل من Spalt متحولة الرئيسية وBRU1 IR-IFM، لإيقاف التعبير عن isoform Mhc المسمى GFP لأنها تتطور، مما أدى إلى ملف تعريف تعبير isoform تشبه أن من الساق والقفز الأنسجة العضلية.تذكر أن تشريح ينبغي أن يتم في أقل من 30 دقيقة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. و، للعناية للحد من التلوث بأنواع الخلايا الأخرى. هذه الطريقة تولد عينات من IFM المخصب مناسبة للنهج الكيميائية الحيوية مثل RT-PCR، أو النشاف الغربي، فضلا عن نهج نمط omic، مثل الطيف الشامل، تسلسل الإنتاجية العالية، ضبط التشكل الكروماتين، والمستقلولوميات.ويمكن أن تكمل هذه التشريحات الأساليب الجينية القوية في دروسوفيليا ببيانات على مستوى النظم من أجل التحقيق في الآليات الأساسية للتنمية وتنظيم الجينات.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

قياس التصبغ البطن في<em&gt; ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

قياس "مستويات ممارسة" في المورفولوجية melanogaster تدوير ممارسة القياس الكمي النظام (ريكس) باستخدام

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

تريدوهيل: "بروتوكول التدريب" الفاصل الزمني "ممارسة فعل بلطف" في melanogaster المورفولوجية

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

طريقة فحص لتحديد العقاقير المعززة للهيتروكروماتين باستخدام دروسوفيلا

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...