Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Andreas Ladurner og Frank Schnorrer for generøs støtte. Vi takker Sandra esser for fremragende teknisk assistance og Akanksha Roy for at generere massespektrometri data. Vi anerkender Bloomington og Vienna Stock Centers for at levere fluer. Vi takker Core Facility bioimaging for hjælp med konfokale Imaging og zentrallabor für proteinanalytik til analyse af massespektrometriske prøver, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, de). Vores arbejde blev støttet af Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated protein Science Munich (CIPSM) på Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS), og den internationale Max Planck Research School (EN).

1. iscenesættelse af Pupae
<ol><li>Løft fluer af den ønskede genotype i flasker (figur 1E). Enten lave en frisk flip af dissektion bestand eller sætte et kryds med mindst 20 kvindelige jomfru fluer. Vedligehold flasker, indtil fluerne begynder at dukke op.</li>
	<li>Saml pre-pupae med en furet pensel og Overfør til befuvet filtrerpapir i en 60 mm Petri skål (figur 1F).</li>
	<li>Køn pupae, indsamle passende køn for forsøget (figur 1G). Hannerne identificeres ved tilstedeværelsen af testiklerne, som vises som gennemsigtige bolde i den ellers uigennemsigtige Pupa.</li>
	<li>Etiketten Petri skålen med tidspunkt, dato og genotype, og derefter alder pupper til den ønskede fase (figur 1H). Bemærk: Vedligehold krydser/bestande og alder pupper i en temperaturkontrolleret inkubator (dvs., 25 °c eller 27 °c for RNAi krydser, som øget Gal4 aktivitet ved højere temperaturer øger knock-down effektivitet40). Sørg for, at fugtigheden er tilstrækkelig høj, så pupper ikke tørrer ud, når du ælder flere dage.</li>
</ol>2. IFM dissektion før 48 h APF
<ol><li>Saml det nødvendige udstyr, herunder to #5 biologi kvalitet pincet, en pipette, pipettespidser, tøris, og (for RNA-prøver) isolations reagens (Se tabel over materialer). Desuden chill Black dissekere retter (Se tabel over materialer), 1x fosfat-Buffered saltvand (PBS) buffer, og 1,5 ml mikrocentrifuge rør på is.</li>
	<li>Ved hjælp af en furet pensel, overførsel iscenesat pupper til en sort dissekere parabol fyldt omkring to tredjedele med kold 1x PBS (figur 2a, B). Flytte til et fluorescerende dissekere mikroskop. Bemærk: Brug så mange pupper som kan dissekeret inden for en 30 min tid vindue. Afhængig af erfaring, dette spænder fra 3 – 15 pupae. Se supplerende metoder til diskussion af alternativer til sort dissekere retter.</li>
	<li>Brug #5 pincet, skubbe en af pupper til bunden af en sort dissekere parabol og justere mikroskopet zoom og fokus til klart at se Pupa (figur 2C).</li>
	<li>Tag fat i den forreste af Pupa med en pincet (figur 2D), og prik derefter pupper med en enkelt spids af de andre pincet lidt off-center i maven, lige bag brystkassen. Dette holder Pupa på plads og forhindrer IFMs i at bevæge sig ind i maven (figur 2E). Bemærk: Begynd timing længden af dissektion fra dette punkt, så snart før integritet er forstyrret. Brug en defineret længde af dissektion (for eksempel 20 – 30 min) for at minimere muskeldød og tilhørende transkriptomic og proteomiske forandringer. Dissekere så mange fluer som muligt i denne periode.</li>
	<li>Brug de første pincet til at fjerne den forreste halvdel af før-etuiet (figur 2F).</li>
	<li>Brug de samme pincet til at knibe den eksponerede pupper lige bag brystkassen, og Adskil maven fra brystkassen (figur 2G).</li>
	<li>Brug pincet, klem forsigtigt den forreste del af thorax (for < 35 h APF) eller rip åbne thorax at udsætte fluorescently mærket IFMs (figur 2h). IFMs vil nemt løsne sig fra epidermis, som sene vedhæftede filer på tidlige tidspunkter er skrøbelige. Kassér den resterende slagtekrop ved hjælp af pincet for at skubbe den til den modsatte side af skålen.</li>
	<li>Gentagelse af trin 2.3 – 2.7, dissekere yderligere pupae.</li>
	<li>Saml ifm fibre med pincet og organisere dem i en bunke i bunden af den sorte dissekere parabol (figur 2I, J). Fjern snavs ved at skubbe det ud af synsfeltet ved hjælp af pincet. Bemærk: Med øvelse kan pincet spidser bringes i umiddelbar nærhed uden at røre hinanden. Denne teknik kan bruges til løst grab IFMs uden at ødelægge dem. Alternative metoder omfatter forsigtigt skubbe eller løfte IFMs med en enkelt spids eller helt lukket pincet, eller tage nogle fedt eller andet væv med IFM og fjerne fedt som beskrevet i trin 2,10.</li>
	<li>Kvalitetskontrol IFM muskel prøve, ved hjælp af pincet til at fjerne ikke-IFM muskler, fedt, neglebånd, etc. fra prøven (figur 2K, L). Bemærk: Med Mef2-Gal4, IFM er mærket mere stærkt end andre muskel typer på tidlige tidspunkter (figur 2k, k '), tillader fjernelse af hoppe muskler og larve muskler baseret på fluorescens intensitet og muskel form. Fedtvæv og neglebånd ser anderledes ud og er ikke mærket med et muskel specifikt fluorescens mærke (figur 2k, k '). Se diskussionsafsnittet for andre Gal4 linjer, der har etiketten IFM.</li>
	<li>Ved hjælp af en klippede pipettespids overføres bunken af IFMs til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas fyldt med 250 μL kølet 1x PBS (figur 2M-O). Fortsæt straks til afsnit 4. Bemærk: IFM-prøverne kan gå tabt ved blot at holde sig til siden af pipettespidsen. Pipette Rings buffer op og ned flere gange, før du samler IFMS kan gøre standard tips mindre klæbrig, og Silikoniseret eller perflumalkoxy (PFA) tips (Se tabel over materialer) med lavere overflade spændinger kan hjælpe med at forhindre prøve tab.</li>
</ol>3. IFM Dissection efter 48 h APF
<ol><li>Saml nødvendigt udstyr, herunder to #5 biologi kvalitet pincet, fin saks, standard glas mikroskop slides, dobbelt-stick tape, pipette, pipettespidser, tøris, og (for RNA-applikationer) isolations reagens (Se tabel over materialer). Chill 1x PBS og mikrocentrifuge rørene på is.</li>
	<li>Brug en let fugtet pensel til at overføre den iscenesat pupper til en stribe dobbeltklæbende tape, der er monteret på et mikroskopdias (figur 3a). Placer pupper i en linjeorienteret i samme retning (ventral ned og forreste mod bunden af diaset). Bemærk: Pas på ikke at bruge for meget vand på pensel eller filter, eller pupper vil ikke holde sig godt. Hvis pupper ikke klæber, skal du tørre dem ved først at overføre til et tørt filter eller silkepapir. Monter så mange pupper som kan dissekeret inden for en 30 min tid vindue, ideelt ~ 10 pupper.</li>
	<li>Tag pupaen ud af før-etuiet. Brug pincet til at drille fra hinanden og Åbn før-etuiet over de forreste Spirakler (figur 3B).</li>
	<li>Skub forsigtigt et par pincet dorsalt mod den bageste, skære før sagen som pincet flytte (figur 3B '). Vær omhyggelig med ikke at ruptur den underliggende Pupa. Frigør Pupa fra den åbnede sag og overfør det straks til en dråbe 1x PBS på en anden mikroskop slide (figur 3B ", C).</li>
	<li>Gentag trin 3,3 og 3,4 for alle pupper i linjen, og indstil derefter dobbelt-stick-tape sliden til side.</li>
	<li>Brug den fine saks, skær maven af Pupa væk fra brystkassen og skubbe den i en separat bunke (figur 3d, d '). Gentag for de resterende pupae. Bemærk: Begynd at timing længden af dissektion med trin 3,6, så snart før integritet er forstyrret. Dissekere så mange fluer som muligt i 20 – 30 minutter for at forhindre celledød og tilhørende transkriptomic og proteomiske forandringer. Når dissekere 1 d voksne eller > 90 h pupae, er det ofte bekvemt for senere trin til yderligere at fjerne hovedet med den fine saks.</li>
	<li>Ved hjælp af et silkepapir, fjerne størstedelen af 1x PBS (generelt overskyet med suspenderet fedt) samt bunken af mave (figur 3E). Tilsæt en dråbe frisk, kølet 1x PBS til de resterende thorakser.</li>
	<li>Brug saks til at skære thorax i halve (figur 3f, f ') ved at skære fra hovedet ned i længderetningen krop akse i en enkelt bevægelse. Alternativt, hvis hovedet er blevet fjernet, skal du først indsætte saksen, hvor hovedet var fastgjort og skåret den øverste halvdel af brystkassen langs mellem IFMs. Skær derefter den ventrale side af brystkassen med en anden udskæring i samme retning.</li>
	<li>Gentag trin 3,7 og 3,8 for alle pupper, der skal dissekteres, genererer en bunke thorax hemisections nær midten af diaset. Sørg for, at der er nok kølet 1x PBS på diaset, så hemisections ikke tørrer ud. Bemærk: Efter 48 h APF, IFMS er store nok til at være synlige under en standard dissekere mikroskop til det uddannede øje. På dette tidspunkt i protokollen, kan muskler med en fluorescerende etiket flyttes til en fluorescerende dissekere anvendelsesområde til støtte i ifm identifikation eller til uddannelsesformål, men dette er ikke nødvendigt.</li>
	<li>Dissekere IFMs ud af thorax. Isoler en af hemisections ved hjælp af #5 pincet (figur 3G, H). Sæt forsigtigt spidsen af en tang over og under midten af IFMs (figur 3G ', H '). Mens du holder den første pincet stadig, bruge fine saks til at skære den ene ende af IFM væk fra neglebånd og sener. Derefter skæres den anden ende af IFM fri fra neglebånd (figur 3G ' ', H ' '). Bemærk: Afhængigt af orienteringen af thorax efter den første IFM cut, er det nyttigt at rotere thorax 180 °, så den anden IFM cut er lettere at udføre.</li>
	<li>Fjern IFM-bundtet fra thorax med pincet (figur 3G ' ', H ' ''), og overfør det til kanten af PBS-boblen for at bruge vand spændingen til at holde den på plads (figur 3i). Skub slagtekroppen til den modsatte side af sliden. Gentag for de resterende thorax hemisections, genererer en samling af dissekeret IFMS. Bemærk: Hvis IFMs ikke bo i en pæn bunke, fjerne nogle af 1x PBS med et væv. Vær omhyggelig med ikke at lade alle PBS fordampe og sikre, at de dissekerede IFMs og hemithorakser forbliver dækket af buffer.</li>
	<li>Efter dissekere alle IFMS, hurtigt udføre en kvalitetskontrol på dissekeret muskel. Brug #5 pincet til at fjerne eventuelle hoppe muskler eller kutikelfragmenter, der kan have fundet vej ind i prøven (figur 3J-K ' '). Bemærk: Hoppe muskel vises anderledes end IFM. Hvis dissekting Mef2-Gal4 mærket muskel under fluorescens, hoppe muskel har en svagere fluorescens og en anden form og tekstur. Under normalt lys, ser det næsten gennemsigtigt, mens IFMs er en uigennemsigtig, mælkeagtig gul (figur 3j-j ' ', K).</li>
	<li>Brug vand spænding, Capture (men ikke squish) de dissekeret IFMS mellem et par tang (figur 3L). IFMs overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas fyldt med 250 μL kølet 1x PBS (figur 3M). Fortsæt straks med afsnit 4. Bemærk: Når pincet spidser bringes i nærheden af hinanden og løftes ud af en buffer løsning, vand spænding forårsager en boble af buffer, der skal fanges mellem pincet tips. Hvis IFMs også er til stede i denne boble, kan de løftes ud af opløsningen og let overføres til en anden buffer fyldt beholder. Det er vigtigt at klemme pincet til at bringe spidserne i nærheden af hinanden uden at røre hinanden, for at undgå Udpresningen væv fanget i buffer boble.</li>
</ol>4. pellet og Bevar IFM-prøven
<ol><li>De IFMs-piller ved centrifugering af 1,5 mL-mikrocentrifuge røret i 3 – 5 minutter ved 2.000 x g i en tabel-top centrifuge (figur 4a, B).</li>
	<li>Fjern bufferen ved hjælp af en pipettespids (figur 4C).
</li>
	<li>For RNA-applikationer, resuspension af IFM-pellet i 50 – 100 μL af den ønskede RNA-isolations buffer (Se tabel over materialer, figur 4D). Ellers skal du fortsætte til trin 4,4. Bemærk: IFMs kan være tørt-frosset efter trin 4,2 for massespektrometri præparater eller isolering af RNA med kommercielle kits (Se repræsentative resultater). For RNA-applikationer opnås bedre resultater ved straks at opsuspendere og fryse IFM-pellet i isolations buffer.</li>
	<li>Fryse prøven på tøris eller snap fryse i flydende nitrogen (figur 4E). Opbevares ved-80 °C, indtil de er klar til efterfølgende trin i prøveforberedelsen til downstream-analyse. Bemærk: Efter Kryopreservation kan prøverne opbevares i flere måneder, inden de behandles med henblik på efterfølgende undersøgelser.</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

I denne protokol præsenterer vi den grundlæggende teknik til dissekere Drosophila IFMS fra tidlig og sene pupper til nedstrøms isolering af protein, DNA, RNA eller andre makromolekyler. Protokollen kan let tilpasses til dissekere IFM fra voksne fluer. Vi demonstrerer nytten af vores dissektion-protokol for mRNA-SEQ-, proteomics-og RT-PCR-applikationer. Med den kontinuerlige forbedring af omik teknologier for at muliggøre analyse af prøver med mindre udgangsmateriale og lavere input koncentrationer, vil disse dissektioner sandsynligvis blive værdifulde for mange ekstra applikationer. Da IFMS er en etableret model for human myopatier4,24 og muskel-type specifik udvikling9,12, vi forestiller, for eksempel, ifm-beriget metabolomics, undersøgelser af kromatin konstellation via 3c eller 4c, splejsning netværk evaluering via CLiP interaktioner eller phospho-proteomics af myofibrillogenesis.
Det er vigtigt at overveje, at dissektionerne fremstiller en prøve beriget til IFM i stedet for en ren IFM-prøve. Dette er uundgåeligt på grund af motorisk neuron innervation, sene vedhæftede filer og trakeal invasion af muskelfibre. Bioinformatik analyse kan bruges til at identificere IFM-berigede gener eller proteiner, men der kræves yderligere eksperimenter for at påvise, at de faktisk er IFM-specifikke. Prøvens renhed kan prøves ved hjælp af publicerede vævsspecifikke markører såsom Stripe45 (Tendon), Act79B4,44 (tubulær muskel), Act88F15 (ifm) eller Syb46 (neuronal specifik). Det kan være muligt at bruge sådanne markører til at normalisere datasæt til IFM-specifikke indhold, men brugere er advaret om, at tidsmæssige ændringer i ekspression af gener, der anvendes til normalisering, for eksempel af IFM-specifikke gener eller Tubulin, kan bias en sådan tilgang.
Genetisk kodede vævsspecifikke mærkningsmetoder, for eksempel EC-tagging47,48 eller pabp-mærkning49,50 for isolerende RNA er blevet udviklet i de seneste år, hvilket kan bidrage til at opnå en virkelig vævs specifik RNA-prøve. Men EF-mærkning kræver konstant fodring af fluer47 og dermed ikke anvendes under før etaper. De PABP-mærkede transkriptomes følsomhed og fuldstændighed kan have begrænsninger51. FACS tilgange til at isolere individuelle muskelfibre er kompliceret af den store størrelse og syncytial karakter af IFMs. Intakt52,53 stil tilgange kan anvendes til at isolere specifikke subcellulære-rum fra IFMS, hvilket kan vise sig nyttigt til isolering af rene populationer af ifm kerner eller mitochondrier. Manuelle dissektioner er stadig den nuværende standard for at opnå intakt IFM-væv for de fleste downstream-applikationer.
Prøve kvaliteten afhænger af flere kritiske trin i dissektions processen. Dissektionerne er teknisk krævende, med dissektion hastighed og prøve renhed stigende med erfaring. Dissekting i korte perioder (20 – 30 min) i kølet buffer uden rengøringsmiddel og straks frysning hjælper med at bevare prøvens integritet, som tidligere er observeret for mus sene isolation54. IFMs kan med held tørre-frosne efter fjernelse af alle buffer fra pellet, men specielt for RNA isolation, frysning prøver i isolation buffer tendens til at producere bedre resultater. IFMS fra op til 20 separate dissektioner kombineres før RNA eller protein isolation, tillader opskalering og indsamling nok materiale, selv fra tidlige tidspunkter eller mutanter16,32, til downstream-analyse.
For RNA-applikationer kan det mest kritiske trin være isoleringen af selve RNA. Guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform isolation (metode 1 ovenfor) overgår de fleste kommercielle kits testet og, som tidligere bemærket, er betydeligt billigere55. Variabiliteten observeret i RNA-isolations udbyttet med kommercielle kits er i forståelse med tidligere observationer56,57. Vi tilføjer yderligere glykogen under isopropanol nedbør for at hjælpe genvinde alle RNA. Ud over RNA-udbyttet er det vigtigt at verificere RNA-integriteten for at sikre, at prøven ikke er blevet fragmenteret eller forringet under dissektions-og isolations processerne. Det er også vigtigt at arbejde RNase-fri. Endelig kan valget af RT-kit påvirke følsomheden af den omvendte transskription proces. Selv om de ikke ofte drøftes i detaljer, påvirker alle disse punkter kvaliteten af IFM-prøven og de data, som er indhentet fra downstream-ansøgningerne.
Flere vigtige ændringer sætter protokollen ud over eksisterende ifm dissektion-protokoller. Selv om en detaljeret dissektion protokol for ifm immunofluorescenstest findes19, denne protokol præsenterer en anden tilgang til før dissektioner, der giver mulighed for hurtigere isolering af ifm væv. Dette gør det muligt at indsamle store mængder ifm-væv (relativt set) med begrænsede dissektions tider for at forhindre, at proteom eller transkriptomer ændres. Andre protokoller beskriver dissektion af voksen ifm til visualisering af gfp-farvning i individuelle myofibrils39 eller til farvning af larve legeme-vægmuskler58, men de løser ikke dissektion i før stadier eller isolering af RNA eller protein. Denne fremgangsmåde adskiller sig også fra den eksisterende protokol for microdissection af før IFMS fra cryosektioner38, som kan generere en renere ifm prøve, men er mere arbejdskraftintensiv og producerer mindre materiale. Sammenlignet med andre hurtige voksne ifm dissektion-protokoller38,39, er IFMS isoleret i PBS-buffer uden rengøringsmiddel for at begrænse stress induktion og andre større udtryks ændringer.
Det vigtigste frem trin i denne protokol er medtagelsen af en levende, fluorescerende reporter, tillader isolering af IFMS på tidlige før etaper. Vi bruger indføre Mef2-GAL459 kørsel enten UAS-CD8:: gfp eller UAS-gfp:: GMA60. Dette tillader differentiel mærkning af ifm (Flight muskler er mere stærkt mærket og forskelligt formet end andre før muskler) samt ydeevne af GAL4-UAS-baserede manipulationer, for eksempel redning eller RNAi eksperimenter. Det er også muligt at kombinere Mef2-GAL4 med tub-GAL80TS for at undgå RNAi-associeret tidlig dødelighed eller med UAS-Dcr2 for at øge RNAi Efficiency40.
Der er yderligere GAL4 drivere eller gfp-linjer til rådighed, der varierer i muskel-type specificitet, temporale udtryk mønster, og føreren styrke19,61 der kan anvendes i stedet for Mef2-GAL4. For eksempel, Act88F-GAL4 er først udtrykt omkring 24 h APF, så det kan ikke bruges til tidligere tidspunkter; Men, det kraftigt mærker IFM og kan være nyttigt at undgå RNAi-associeret tidlig dødelighed. Ham-gfp eller Act88F-GFP label ifm, igen med tidsmæssige begrænsninger, men de undgår GAL4 afhængighed af markør udtryk og kan være nyttige i kombination med en mutant baggrund af interesse. Lister over andre mulige markør linjer er tilgængelige19. Det skal også bemærkes, at brugen af transgener og GAL4/UAS systemet kan forårsage genekspression artefakter, så det er vigtigt at bruge passende Kontroller, for eksempel føreren linje krydset til Wild-type baggrunds stamme, således at sådanne artefakter er formentlig det samme i alle prøver.
Med den medfølgende video, denne detaljerede protokol har til formål at gøre før ifm dissektion mere tilgængelig og fremme brugen af omik tilgange til at studere muskel udvikling. Kobling af kraften i Drosophila genetik og cellebiologi med biokemi og omik assays tilgængelige gennem dissekeret ifm har potentiale til at fremme mekanistisk forståelse af myogenesis og muskelfunktion. Fremtidige undersøgelser, der forbinder system-niveau observationer af transkriptomer og proteom regulering til metaboliske og funktionelle udgange vil give en dybere forståelse af muskel-type specifik udvikling og patogenesen af muskellidelser.

Moderne omik teknologier giver vigtig indsigt i muskel udvikling og de mekanismer, underliggende menneskelige muskellidelser. For eksempel har analysen af transkriptomics-data kombineret med genetisk og biokemisk verifikation i dyremodeller afsløret, at tabet af splejsning-faktoren RBM20 forårsager forstørret kardiomyopati på grund af dets regulering af et målnetværk på mere end 30 sarcomere gener, der tidligere har været forbundet med hjertesygdomme, herunder tidligere1,2,3.
I et andet eksempel har undersøgelser fra cellekultur, dyremodeller og humane patienter vist, at myotonisk dystrofi skyldes en forstyrrelse i RNA-reguleringen som følge af binding af muscleblind (mbnl) og docetaxels opregulering af CELF14,5. Den tvær regulerende og tidsmæssige dynamik mellem mbnl og CELF1 (også kaldet CUGBP1 eller Bruno-lignende 2) bidrager til at forklare de vedvarende embryonale splejsning mønstre i myotoniske dystrofi patienter. Desuden, det store netværk af fejl regulerede mål hjælper med at forklare den komplekse karakter af sygdommen4,6,7,8. Et flertal af sådanne undersøgelser udnytter omik tilgange i genetiske model organismer til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for menneskets muskelsygdom. Desuden fremhæver de vigtigheden af første forståelse af tidsmæssig og vævstype specifikt genekspression, protein modifikation og metaboliske mønstre i raske muskler for at forstå ændringer i syge eller aldrende muskler.
Drosophila melanogaster er en anden veletableret genetisk model organisme. Strukturen af sarcomere samt individuelle sarcomere komponenter er meget bevaret fra fluer til hvirveldyr4,9,10, og indirekte Flight muskler (IFMS) er blevet en kraftfuld model til at studere flere aspekter af muskel udvikling11,12. Første, fibrillar Flight muskler er funktionelt og Morfologisk adskiller sig fra rørformede krops muskler11,13, tillader undersøgelse af muskel-typespecifikke udviklingsmekanismer. Transkriptionsfaktorer, herunder spalt Major (Salm)14, extradlole (Exd), og Homothorax (HTH)15 er blevet identificeret som fibrillar skæbne regulatorer. Desuden, nedstrøms for Salm, den CELF1 ligner Bruno1 (Bru1, aret) dirigerer en fibrillar-specifikke splejsning program16,17.
For det andet, IFMS er en vigtig model for at forstå processen med myogenesis selv, fra fremmer fusion og myotube vedhæftet fil til myofibrillogenesis og sarcomere modning9,18,19. For det tredje, Drosophila genetik tillader undersøgelse af bidrag af individuelle proteiner, protein domæner, og protein isoformer til sarcomere dannelse, funktion, og biofysiske egenskaber20,21,22 ,23. Endelig, ifm modeller er blevet udviklet til studiet af flere menneskelige muskellidelser, såsom myotonisk dystrofi, myofibrillar myopatier, muskel degenerative lidelser, aktinopatier, etc.24,25,26 ,27, og har givet vigtig indsigt i sygdomsmekanismer og potentielle terapier28,29,30. Således, Drosophila er en nyttig model til at løse mange åbne spørgsmål i myogenesis felt, herunder mekanismer af muskel-type specifik transskription, splejing, og kromatin forordning, samt til rollen af metabolisme i muskel udvikling. Anvendelsen af moderne omik-teknologier, især i kombination med de mange forskellige genetiske, biokemiske og celle biologiske analyser, der findes i Drosophila, har potentialet til dramatisk at fremme forståelsen af muskel udvikling, aldring og sygdom.
IFMS er de største muskler i flue, spænder næsten 1 mm over hele længden af thorax i voksne31,32. Men denne lille størrelse genererer udfordringen med at få nok prøve til at anvende omik teknologier i Drosophila i en vævstype specifik måde. Desuden er IFMS en del af den voksne muskulatur, der dannes under før etaper. Myoblasts Fuse til dannelse af myotubes, som Fastgør til sener omkring 24 h efter puparium dannelse (APF) og gennemgå et komprimerings trin nødvendigt at initiere myofibrillogenesis omkring 30 h APF (figur 1a-D)18,33, 34.
Den myofibers derefter vokse til at spænde hele længden af thorax, med myofibrils undergår en indledende vækstfase fokuseret på sarcomere tilsætning indtil omkring 48 h APF, og derefter overgår til en modning fase, hvor sarcomeres vokse i længde og bredde og er ombygget til at etablere stretch-aktivering af 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Fremkomsten af fiber modning er i det mindste delvist kontrolleret af Salm og E2F32,36,37, og flere ifm-specifikke sarcomere protein isoformer, hvis splejsning styres af Bru1 er indarbejdet i denne fase16,17. Modne fluer eclose fra 90 – 100 h APF. Det betyder, at for at studere muskel udvikling, ifm skal isoleres med tilstrækkelig mængde, kvalitet og renhed fra flere før tidspunkter for at lette analyse ved hjælp af omik tilgange.
Flere protokoller for ifm dissektion er blevet offentliggjort. Mens disse protokoller fungerer godt for deres tilsigtede applikationer, ingen er ideelle til omik tilgange. Protokoller, der bevarer ifm morfologi for immunofluorescens af før og voksne IFMS19, isolere ifm fibre til mekanisk evaluering31, eller udnytte microdissection af før ifm fra cryosektioner38 er for specialiseret og tid og arbejdskraftintensiv til rimeligt at opnå tilstrækkelige mængder af ifm væv for omik applikationer. Andre protokoller er blevet udviklet til hurtig dissektion af specifikt voksne ifm38,39, således ikke gælder for før etaper, og bruge buffere, der ikke er ideelle eller kan være uforenelig med, for eksempel, RNA isolation. Der er således behov for at udvikle nye tilgange til at isolere før ifm til biokemiske eller omik applikationer.
Her præsenterer vi en protokol for dissektion af ifm under før etaper, der er blevet anvendt med succes til mRNA-SEQ analyse fra 16 h APF gennem voksne etaper16,32. Protokollen anvender en grøn fluorescerende protein (gfp) etiket til at identificere IFMS i alle stadier af før og voksen udvikling, så levende dissektion under et fluorescerende dissekere mikroskop. Tilgangen er mindre arbejdskraftintensiv, med et højere gennemløb end eksisterende ifm dissektion-protokoller. Dette giver mulighed for hurtig isolation og Kryopreservation af prøver, genererer nok materiale efter flere runder af dissektion for omik tilgange samt for standard reverse transkriptionen polymerase kædereaktion (RT-PCR) eller Western blotting.
Vi præsenterer protokollen i to dele, viser, hvordan man hurtigt dissekere IFMS både før 48 h APF (under tidlig Metamorphosis, når ifm vedhæftede filer er mere svag) og efter 48 h APF (når før krop plan og ifm vedhæftede filer er veldefinerede). Vi viser, at vi kan isolere høj kvalitet RNA fra dissekeret IFMS på alle tidspunkter og præsentere data om forskellige tilgange til RNA isolation og reverse transskription. Endelig viser vi anvendelsen af dissektion-protokollen til mRNA-SEQ, massespektrometri og RT-PCR ved hjælp af CELF1 ligner Bruno1 som et eksempel. Vi viser misexpression af sarcomere protein isoformer i proteomics data fra Bruno1 mutant IFM og undersøger Bruno1 regulering af C-Terminal Splice hændelse af myosin Heavy Chain (MHC). Disse resultater illustrerer, hvordan omik-data kan give en dybere forståelse af biologiske fænomener, der supplerer genetiske og biokemiske eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila Flight muskel er en kraftfuld model til at studere forskellige processer såsom transkriptional regulering, alternative splicing, metabolisme, og mechanobiology, som alle påvirker muskel udvikling og myofibrillogenesis. Omics-data, såsom dem, der genereres af massespektrometri eller dybe sekvensering, kan give vigtig mekanistisk indsigt i disse biologiske processer. For sådanne tilgange er det gavnligt at analysere vævsspecifikke prøver for at øge både selektiviteten og specificiteten af de omik-fingeraftryk. Her præsenterer vi en protokol for dissektion af fluorescerende-mærket flyve muskel fra levende pupper til at generere stærkt berigede muskel prøver for omik applikationer. Vi først beskrive, hvordan man dissekere Flight muskler i begyndelsen af før etaper (< 48 h efter puparium dannelse [APF]), når musklerne er mærkbar ved grøn fluorescerende protein (gfp) mærkning. Vi beskriver derefter, hvordan man dissekere muskler fra sent pupper (> 48 h APF) eller voksne, når musklerne kan skelnes under en dissekere mikroskop. Den medfølgende video protokol vil gøre disse teknisk krævende dissektioner mere bredt tilgængelige for musklen og Drosophila forskersamfund. For RNA-applikationer, vi assay mængden og kvaliteten af RNA, der kan isoleres på forskellige tidspunkter og med forskellige tilgange. Vi viser endvidere, at Bruno1 (Bru1) er nødvendig for en tidsmæssig forskydning i myosin Heavy Chain (MHC) splicing, hvilket viser, at dissekerede muskler kan anvendes til mRNA-SEQ, massespektrometri, og reverse transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR) Programmer. Denne dissektion-protokol vil bidrage til at fremme vævsspecifikke omik-analyser og kan generelt anvendes til at studere flere biologiske aspekter af myogenesis.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila Flight muskel er en kraftfuld model til at studere transkriptional regulering, alternative splicing, metabolisme, og mechanobiology. Vi præsenterer en protokol for dissektion af fluorescerende-mærket flyve muskel fra levende pupper til at generere meget berigede prøver ideel til proteomics og dybe sekvensering. Disse prøver kan tilbyde vigtig mekanistisk indsigt i forskellige aspekter af muskel udvikling.

Dissektion af Drosophila melanogaster Flight muskler for omics tilgange

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Protokollen letter dissektion af GFP-mærket indirekte flyvning muskel fra Drosophila på forskellige tidspunkter under pupae udvikling til at vurdere ændringer i gen-og proteinudtryk. Ved hjælp af disse teknikker kan der opnås en højberiget flyvemuskelprøve med minimal RNA-proteinnedbrydning, der er egnet til RT-PCR, western blot eller omic tilgange. Disse specialiserede dissektioner kræver praksis og dygtighed, men antallet af pupper, der kan dissekeres og kvaliteten af prøverne forbedres med erfaring.Visuel demonstration af denne dissektion er afgørende for at bestemme, hvordan man skelner flyvemuskler fra ikke-muskelvæv og letter hurtig isolering af flyvemuskler fra pupal prøver. At iscenesætte pupper, bruge en våd pensel til at indsamle og overføre pre-pupper i en 60 millimeter petriskål, og køn pupper under en kikkert mikroskop. Hanner er identificeret ved tilstedeværelsen af testikler, der vises som gennemskinnelige glober på den ellers uigennemsigtige pupper.Efter mærkning af skålen med den tid, dato, og genotype af fluerne, alder pupperen i en 25 til 27 grader Celsius inkubator indtil det relevante stadium. Ved IFM dissektion før 48 H APF skal du bruge en våd pensel til at overføre den passende iscenesatte puppe til en sort dissekerende skål ca. 2/3 fyldt med kølet PBS. Under fluorescerende dissekere mikroskop, bruge en 5 kraftaffængt til at skubbe en af pupper til bunden af den sorte dissekere fad.Juster mikroskopzoom og fokus, indtil puppen kan visualiseres tydeligt. Brug et par kraftæcessiver til at forstå den forreste af pupper, stikke pupperen med en enkelt spids af et andet par kraftvæceser, lidt off-center i maven, lige bag brystkassen. Brug det første par kraftæcesser til at fjerne den forreste halvdel af pupal sagen, og at klemme den eksponerede pupper lige bag brystkassen til at adskille maven fra brystkassen.Dernæst forsigtigt klemme den forreste del af brystkassen til at udsætte fluorescerende mærket IFMs. Brug derefter forrædlede til at kassere den resterende slagtekrop på den modsatte side af skålen, og dissekere den efterfølgende puppe på samme måde. Når alle pupper er blevet dissekeret, skal du bruge de virfængelige fibre, og organisere fibrene i en bunke i bunden af den sorte dissekere skål.Brug de vicesser til at skubbe snavs ud af synsfeltet, og fjerne eventuelle ikke-IFM muskler, fedt, neglebånd, eller andre uønskede væv fra prøverne. Brug derefter en klippet pipettespids til at overføre bunken af IFM'er til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør indeholdende 250 mikroliter kølet PBS. For IFM dissektion efter 48 H APF, bruge en let våd pensel til at overføre den iscenesatte puppe på en strimmel af dobbeltsidet tape monteret på et mikroskop dias.Orient pupperen i en linje, ventrale side ned, og forreste mod bunden af diaset. Når alle pupper er blevet placeret, skal du bruge vices til at drille fra hinanden og åbne den første pupal tilfælde over den forreste spiracles, og forsigtigt glide et par stænder dorsally, mod den bageste, skære pupal sagen som spånbånd flytte. Frigør pupperen fra den åbnede sag, og overfør straks puppen til en dråbe PBS på et andet mikroskopdias.Når alle pupper er befriet, bruge fine saks til at skære maven af pupper væk fra brystkassen, og skubbe maven ind i en separat bunke. Når alle brystkassen er fjernet, skal du bruge et stykke silkepapir til at fjerne størstedelen af PBS og bunken af maver. Tilsæt en dråbe frisk, kølet PBS til de resterende brystkasser, før du bruger saksen til at skære fra hovedet langs den langsgående kropsakse i en enkelt bevægelse for at opdele brystkassen i halve.Når alle pupper er blevet dissekeret, skal du bruge de 5 kraftbefæstet til at vælge en af de hemisections, og forsigtigt indsætte spidsen af en kraftbefæstet over og under midten af IFMs. Hold det første par kraftbecer stadig, bruge fine saks til at skære den ene ende af IFM væk fra neglebånd og sener, før du roterer pupper 180 grader, for at tillade den anden ende af IFM, der skal skæres fri fra neglebånd og sener. Brug vicess til at overføre IFM-bundtet fra brystkassen til kanten af PBS-boblen ved hjælp af vandspænding til at holde bundtet på plads.Skub derefter slagtekroppen til den modsatte side af diaset, og disseker resten af IFM'erne på samme måde. Når alle IFM'erne er indsamlet, skal du bruge de 5 vicesser til at fjerne eventuelle hoppemuskel- eller neglebåndsfragmenter, der kan have fundet vej ind i prøverne. Brug derefter vandspænding til forsigtigt at fange de dissekerede IFM'er mellem et par fortær, og placer IFM'erne i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør indeholdende 250 mikroliter af kølet PBS.mRNA-sekvenseringsdata fra BRUNO1 IR IFM'er viser ændringer i ekspression på genenhedsniveau sammenlignet med wildtype-sekventeringsdata. Ved hjælp af hele proteom massespektrometri på dissekeret IFMs, en lignende regulering er observeret på protein og protein isoform niveauer. Efter indsættelsen af en proteinfælde linje i den endelige intron af Mhc, indarbejdelsen af GFP-mærket protein kan observeres i IFM som to prikker på hver side af M-line på 90 H APF, mens i ben muskelvæv GFP signalet kan observeres ensartet på tværs af sarcomere M-line.Når du bruger RT-PCR på dissekeret IFM, en MHC isoform skifte fra GFP-mærket exon 34 til 37 begivenhed til den umærkede exon 34 til 35 begivenhed, kan påvises mellem 30 og 48 timer efter puparium dannelse ved 27 grader Celsius. Fra mRNA sekventering data, ben og hoppe muskelvæv udtrykke alle tre Mhc isoformer, opretholde udtryk for GFP-mærket isoform i modne muskler. Både Spalt major mutant og BRUNO1 IR-IFM, undlod at slukke udtryk for GFP-mærket Mhc isoform som de udvikler, hvilket resulterer i en isoform udtryk profil ligner ben og hoppe muskelvæv.Husk, at dissektionerne skal udføres på under 30 minutter for at forhindre RNA-nedbrydning. Og for at være forsigtig med at begrænse forureningen af andre celletyper. Denne metode genererer IFM-berigede prøver egnet til biokemiske tilgange som RT-PCR, eller vestlige blotting, samt omic stil tilgange, som massespektrometri, høj gennemløb sekventering, kromatin kropsbygning fange, og metabolomics.Disse dissektioner kan supplere de kraftfulde genetiske tilgange i Drosophila med systemdata til undersøgelse af de grundlæggende mekanismer for udvikling og genregulering.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantificering af abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høj fedt diæt fodring og High Throughput Triacylglyceride Assay i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation af Genome-wide kromatin kropsbygning Capture biblioteker fra stramt iscenesatte tidlige Drosophila embryoner

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Måling af motion niveauer i Drosophila melanogaster ved hjælp af den roterende motion kvantificering systemet (HENV)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

Trædemølle: Interval Træning protokol for forsigtigt induceret øvelse i Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion af Enhancer funktion ved hjælp af Multiplex CRISPR-baserede forstærker interferens i cellelinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo fremad genetisk skærm for at identificere nye neuroprotektive gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Brug af Drosophila S2-celler til levende billeddannelse af celle division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

En screeningmetode til identifikation af heterokratinfremmende stoffer ved hjælp af Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...