Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

We zijn Andreas Ladurner en Frank Schnorrer dankbaar voor hun ruime steun. We danken Sandra Esser voor de uitstekende technische assistentie en Akanksha Roy voor het genereren van de Mass spectrometrie data. We erkennen de voorraad centra van Bloomington en Vienna voor het leveren van vliegen. We danken de kern faciliteit Bioimaging voor hulp bij confocale beeldvorming en de Zentrallabor für Proteinanalytik voor analyse van massaspectrometrie monsters, zowel in het LMU Biomedical Center (Martinsried, DE). Ons werk werd gesteund door de Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), het centrum voor geïntegreerde proteïne Science Munich (CIPSM) aan de Ludwig-Maximilians-Universiteit München (MLS), de Frederich-Bauer Stiftung (MLS), en de internationale Max Planck Research School (EN).

1. het faseren van de Pupae
<ol><li>Til de vliegen van het gewenste genotype op in flessen (Figuur 1E). Ofwel Maak een frisse Flip van de dissectie voorraad of stel een kruis met ten minste 20 vrouwelijke Maagd vliegen. Handhaaf flessen totdat de vliegen beginnen te puperen.</li>
	<li>Verzamel pre-pupae met een bevoafd penseel en breng het over naar bevoafd filtreerpapier in een 60 mm Petri schaaltje (Figuur 1F).</li>
	<li>Geslacht de pupae, het verzamelen van het juiste geslacht voor het experiment (Figuur 1G). Mannetjes worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van teelballen, die verschijnen als doorschijnende ballen in de verder ondoorzichtige PUPA.</li>
	<li>Label de Petri schaal met de tijd, datum en genotype, en vervolgens de poppen naar de gewenste fase (Figuur 1H). Opmerking: Houd de kruisingen/voorraden en de leeftijd van de poppen in een met temperatuur gecontroleerde incubator (d.w.z. 25 °c of 27 °c voor RNAi-kruisen, aangezien verhoogde Gal4-activiteit bij hogere temperaturen de terugslag-efficiëntie verhoogt40). Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid voldoende hoog is, zodat de poppen niet uitdrogen bij het ouder worden van meerdere dagen.</li>
</ol>2. IFM dissectie vóór 48 h APF
<ol><li>Monteer de benodigde apparatuur, waaronder twee #5 biologie grade Tang, een pipet, pipetpunten, droogijs, en (voor RNA-monsters) isolatie reagens (Zie tabel met materialen). Bovendien chill-out zwarte ontleed gerechten (Zie tabel van de materialen), 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer, en 1,5 ml micro centrifugebuizen op ijs.</li>
	<li>Met behulp van een bevoafd penseel, overdracht geënsceneerde poppen naar een zwarte ontleden gerecht gevuld ongeveer tweederde met koud 1x PBS (Figuur 2a, B). Ga naar een fluorescerende ontsnij Microscoop. Opmerking: Gebruik zo veel poppen als kan worden ontleed binnen een 30 min tijdvenster. Afhankelijk van de ervaring varieert dit van 3 tot 15 pupae. Zie aanvullende methoden voor de bespreking van alternatieven voor zwarte ontleden gerechten.</li>
	<li>Gebruik #5 Tang, duw een van de poppen naar de onderkant van een zwarte ontleden Dish en stel de zoom van de Microscoop in en focus om de PUPA duidelijk te zien (Figuur 2C).</li>
	<li>Pak de voorste van de PUPA met een tang (Figuur 2D), en POKE de poppen met een enkele punt van de andere Tang iets buiten het midden in de buik, net achter de thorax. Dit houdt de PUPA op zijn plaats en voorkomt dat de IFMs in de buik bewegen (Figuur 2E). Opmerking: Begin de timing van de lengte van dissectie vanaf dit punt, zodra de exuviae-integriteit wordt verstoord. Gebruik een gedefinieerde lengte van dissectie (bijvoorbeeld 20 – 30 min) om de spier dood te minimaliseren en bijbehorende transcriptomische en proteomische veranderingen. Ontleden zo veel mogelijk vliegen in deze periode.</li>
	<li>Verwijder met behulp van de eerste Tang de voorste helft van de exuviae-kast (Figuur 2F).</li>
	<li>Gebruik dezelfde pincet om de blootgestelde poppen vlak achter de thorax te knijpen en scheid de buik van de thorax (Figuur 2G).</li>
	<li>Gebruik de Tang en Knijp zachtjes in het voorste deel van de thorax (voor < 35 h APF) of open de thorax om de fluorescently gelabelde IFMs bloot te leggen (Figuur 2h). IFMs zal gemakkelijk loskoppelen van de epidermis, als pees bijlagen op vroege tijdpunten zijn kwetsbaar. Gooi het overgebleven karkas weg met de tang om het naar de andere kant van de schaal te duwen.</li>
	<li>Herhaal stappen 2.3 – 2.7, ontleden extra pupae.</li>
	<li>Verzamel de IFM-vezels met een tang en organiseer ze in een stapel aan de onderkant van de zwarte ontleden Dish (Figuur 2I, J). Verwijder het vuil door het uit het gezichtsveld te duwen met behulp van een tang. Opmerking: Met de praktijk kunnen de Tang tips in de buurt worden gebracht zonder elkaar aan te raken. Deze techniek kan worden gebruikt om losjes te grijpen IFMs zonder ze te vernietigen. Alternatieve methoden omvatten het zachtjes duwen of tillen van de IFMs met een enkele tip of volledig gesloten tang, of het nemen van sommige vet of ander weefsel met de IFM en het verwijderen van het vet zoals beschreven in stap 2,10.</li>
	<li>Kwaliteitscontrole van het IFM-spier monster, met behulp van de tang om niet-IFM-spieren, vet, cuticula, etc. uit het monster te verwijderen (Figuur 2K, L). Opmerking: Met Mef2-Gal4, IFM is gelabeld krachtiger dan andere spier typen op vroege tijdpunten (Figuur 2k, k '), waardoor verwijdering van sprong spier en larvale spieren op basis van fluorescentie intensiteit en spier vorm. Vet en cuticula weefsel zien er anders uit en worden niet aangeduid met een spierspecifiek fluorescentie label (Figuur 2k, k '). Zie de sectie discussie voor andere Gal4 regels die het label IFM.</li>
	<li>Breng met een geknipte pipetpunt de stapel IFMs over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL gevuld met 250 μL gekoeld 1x PBS (Figuur 2M-O). Ga onmiddellijk naar rubriek 4. Opmerking: IFM-samples kunnen verloren gaan door simpelweg aan de zijkant van de pipetpunt te kleven. Pipetteer buffer meerdere malen op en neer voordat het verzamelen van Ifm's kan maken standaard tips minder kleverig, en Gesiliconiseerde of perfluoroalkoxy (PFA) tips (Zie tabel van materialen) met lagere oppervlaktespanningen kunnen helpen voorkomen dat monsterverlies.</li>
</ol>3. IFM dissectie na 48 h APF
<ol><li>Monteer de benodigde apparatuur, waaronder twee #5 biologie grade Tang, fijne schaar, standaard glazen Microscoop dia's, dubbele kleefband, Pipet, pipetpunten, droogijs, en (voor RNA-toepassingen) isolatie reagens (Zie tabel met materialen). Chill de 1x PBS en micro centrifugebuizen op ijs.</li>
	<li>Breng met een licht bevoste kwast de Klaargezette poppen over naar een strook dubbelzijdige plakband die op een Microscoop-dia is gemonteerd (Figuur 3a). Plaats de poppen in een lijn die gericht is op dezelfde oriëntatie (ventrale naar beneden en voorste naar de onderkant van de glijbaan). Opmerking: Zorg ervoor dat u niet te veel water op het penseel of filter gebruikt, of dat de poppen niet goed blijft plakken. Als de poppen niet vasthouden, droog ze dan eerst naar een droog filter of tissuepapier. Monteer zo veel poppen als kan worden ontleed binnen een 30 min tijdvenster, idealiter ~ 10 poppen.</li>
	<li>Verwijder de PUPA uit de exuviae-behuizing. Gebruik de tang om uit elkaar te plagen en open het exuviae-hoesje boven de voorste spiracles (Figuur 3B).</li>
	<li>Schuif een paar Tang dorsaal zachtjes naar het achterste, en snijd de exuviae als de Tang beweegt (Figuur 3B '). Let op dat u de onderliggende PUPA niet scheuring. Bevrijd de PUPA van de geopende behuizing en breng deze onmiddellijk over naar een druppel van 1x PBS op een tweede Microscoop glijbaan (Figuur 3B ", C).</li>
	<li>Herhaal de stappen 3,3 en 3,4 voor alle poppen in de lijn en stel vervolgens de plakband van de dubbele stick opzij.</li>
	<li>Snijd met behulp van de fijne schaar de buik van de PUPA weg van de thorax en duw deze in een aparte stapel (Figuur 3d, d '). Herhaal dit voor de resterende pupae. Opmerking: Begin timing de lengte van dissectie met stap 3,6, zodra exuviae integriteit wordt verstoord. Ontleden zo veel mogelijk vliegen in 20 – 30 minuten om celdood en bijbehorende transcriptomische en proteomische veranderingen te voorkomen. Bij het ontleden van 1 d volwassenen of > 90 h pupae, is het vaak handig voor latere stappen om het hoofd bovendien met de fijne schaar te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder met behulp van een tissuepapier de meerderheid van de 1x PBS (over het algemeen bewolkt met gesuspendeerd vet) en de stapel buikjes (Figuur 3E). Voeg een druppel vers, gekoeld 1x PBS toe aan de overgebleven thoraxes.</li>
	<li>Gebruik de schaar om de thorax in tweeën te knippen (Figuur 3f, f ') door in één beweging van het hoofd naar beneden over de lengteas te snijden. Afwisselend, als de kop is verwijderd, plaats eerst de schaar waar de kop is bevestigd en snijd de bovenste helft van de thorax longitudinaal tussen de IFMs. Snijd vervolgens de ventrale kant van de thorax met een tweede snede in dezelfde richting.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3,7 en 3,8 zodat alle poppen worden ontleed, waardoor een stapel thorax hemisecties in de buurt van het midden van de dia wordt gegenereerd. Zorg ervoor dat er voldoende gekoelde 1x PBS op de glijbaan is, zodat de hemisecties niet uitdrogen. Opmerking: Na 48 h APF zijn de IFMs groot genoeg om zichtbaar te zijn onder een standaard ontsnij Microscoop aan het getrainde oog. Op dit punt in het protocol kunnen spieren met een fluorescerende label worden verplaatst naar een fluorescerende ontsnij ding om te helpen bij IFM-identificatie of voor trainingsdoeleinden, maar dit is niet nodig.</li>
	<li>Ontleden de IFMs uit de thorax. Isoleer een van de hemisecties met behulp van de #5 Tang (Figuur 3G, H). Voeg voorzichtig de uiteinden van een tang boven en onder het midden van de IFMs in (Figuur 3G ', H '). Terwijl je de eerste Tang stil houdt, gebruik je een fijne schaar om het ene uiteinde van de IFM weg te knippen van de cuticula en pezen. Snijd vervolgens het andere uiteinde van de IFM vrij van de cuticula (Figuur 3G ' ', H ' '). Opmerking: Afhankelijk van de oriëntatie van de thorax na de eerste IFM-Cut, is het handig om de thorax 180 ° te roteren, zodat de tweede IFM-cut gemakkelijker uit te voeren is.</li>
	<li>Verwijder de IFM-bundel van de thorax met pincet (Figuur 3G ' ', H ' ' ') en zet deze over naar de rand van de PBS-ballon om de water spanning te gebruiken om deze op zijn plaats te houden (Figuur 3I). Duw het karkas naar de andere kant van de glijbaan. Herhaal dit voor de overgebleven thorax hemisecties, waardoor een verzameling van ontleed IFMs wordt gegenereerd. Opmerking: Als de IFMs niet in een nette stapel blijven, verwijder dan een deel van de 1x PBS met een tissue. Let erop dat u niet alle PBS verdampt en ervoor zorgt dat de ontleed IFMs en hemithoraxes blijven bedekt door buffer.</li>
	<li>Na het ontleden van alle IFMs, snel een kwaliteitscontrole op de ontleed spier uit te voeren. Gebruik #5 Tang, Verwijder eventuele sprong spieren of cuticula fragmenten die hun weg in het monster hebben kunnen vinden (Figuur 3J-K ' '). Opmerking: Sprong spier lijkt verschillend van IFM. Als ontleed Mef2-Gal4 gelabeld spier onder fluorescentie, sprong spier heeft een zwakkere fluorescentie en een andere vorm en textuur. Onder normale licht, het lijkt bijna doorschijnend terwijl de IFMs zijn een ondoorzichtige, melkachtig geel (Figuur 3j-j ' ', K).</li>
	<li>Met behulp van water spanning, vangen (maar niet squish) de ontleed IFMs tussen een paar van de Tang (Figuur 3L). Breng de IFMs over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL, voorgevuld met 250 μL gekoeld 1x PBS (Figuur 3M). Ga onmiddellijk verder met rubriek 4. Opmerking: Wanneer de Tang-uiteinden in de nabijheid van elkaar worden gebracht en uit een bufferoplossing worden getild, zorgt de water spanning ervoor dat er tussen de Tang-tips een bubbel van buffer wordt gevangen. Als IFMs ook aanwezig zijn in deze bubbel, kunnen ze uit de oplossing worden getild en gemakkelijk worden overgebracht naar een andere met buffer gevulde recipiënt. Het is belangrijk om de Tang te persen om de uiteinden bij elkaar te brengen zonder elkaar aan te raken, om te voorkomen dat het weefsel dat in de buffer ballon wordt gevangen, wordt gemacereert.</li>
</ol>4. pellet en conservering van het IFM-monster
<ol><li>Pellet de IFMs door de 1,5 mL micro centrifugebuis gedurende 3 – 5 minuten te centrifugeren bij 2.000 x g in een tafel-top centrifuge (Figuur 4a, B).</li>
	<li>Verwijder de buffer met een pipetpunt (Figuur 4C).
</li>
	<li>Voor RNA-toepassingen, respendeer de IFM-pellet in 50 – 100 μL van de gewenste RNA-isolatie buffer (Zie tabel met materialen, Figuur 4D). Ga anders verder met stap 4,4. Opmerking: IFMs kunnen na stap 4,2 voor massaspectrometrie preparaten of isolatie van RNA met commerciële kits droog worden bevroren (Zie representatieve resultaten). Voor RNA-toepassingen worden betere resultaten verkregen door de IFM-pellet in isolatie buffer onmiddellijk opnieuw op te schorten en te bevriezen.</li>
	<li>Vries monster op droogijs of klik bevriezen in vloeibare stikstof (Figuur 4E). Bewaren bij-80 °C tot de volgende stappen in de monstervoorbereiding voor downstream-analyse gereed zijn. Opmerking: Na cryopreservation, kunnen monsters worden opgeslagen voor enkele maanden voor de verwerking voor downstream onderzoek.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol presenteren we de basistechniek om Drosophila IFMS te ontleden van vroeg-en laat stadium-poppen voor downstream isolatie van eiwitten, DNA, RNA of andere macromoleculen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan ontleden IFM van volwassen vliegen. We demonstreren het nut van ons dissectie-protocol voor mRNA-seq-, proteomica-en RT-PCR-toepassingen. Met de voortdurende verbetering van Omics-technologieën om analyses van monsters met minder startmateriaal en lagere ingangs concentraties mogelijk te maken, zullen deze dissecties waarschijnlijk waardevol zijn voor veel extra toepassingen. Aangezien ifm's een vastgesteld model zijn voor humane myopathieën4,24 en specifieke ontwikkeling van het spier type9,12, zijn we voorbeeld, bijvoorbeeld IFM-verrijkte metabolomics, onderzoeken naar chromatine-conformatie via 3C of 4C, splicing netwerk evaluatie via CLiP interacties of fosho-Proteomics van myofibrillogenesis.
Het is belangrijk te bedenken dat deze dissecties een voorbeeld verrijkt voor IFM produceren in plaats van een puur IFM-monster. Dit is onvermijdelijk als gevolg van motorische neuron innervation, pees bijlagen en tracheale invasie van spiervezels. Bioinformatica analyse kan worden gebruikt om IFM-verrijkte genen of eiwitten te identificeren, maar verdere experimenten zijn nodig om aan te tonen dat ze in feite IFM-specifiek zijn. De zuiverheid van het monster kan worden getest met gepubliceerde Weefselspecifieke markers zoals Stripe45 (pees), Act79B4,44 (tubulaire spier), Act88F15 (IFM) of Syb46 (neuronale specifieke). Het kan mogelijk zijn om dergelijke markers te gebruiken om gegevenssets te normaliseren naar de IFM-specifieke inhoud, maar gebruikers worden gewaarschuwd dat temporele veranderingen in de uitdrukking van genen die worden gebruikt voor normalisatie, bijvoorbeeld van IFM-specifieke genen of tubulin, een dergelijke benadering kunnen bias.
Genetisch gecodeerde Weefselspecifieke etiketterings methoden, zoals EC-tagging47,48 of pabp-labeling49,50 voor het isoleren van RNA zijn de afgelopen jaren ontwikkeld, wat kan helpen om een echt weefsel-specifieke RNA monster. Echter, EC-tagging vereist constante voeding van vliegen47 en is dus niet toepasbaar tijdens exuviae stadia. De gevoeligheid en volledigheid van PABP-gelabelde transcriptomes kan beperkingen51hebben. FACS benaderingen om individuele spiervezels te isoleren worden gecompliceerd door de grote omvang en syncytiële aard van IFMs. INTACT52,53 stijl benaderingen kunnen worden toegepast om specifieke subcellulaire compartimenten van IFMS te isoleren, wat nuttig kan blijken voor het isoleren van zuivere populaties van IFM-kernen of mitochondriën. Handmatige dissecties zijn nog steeds de huidige standaard om intact IFM-weefsel te verkrijgen voor de meeste downstreamtoepassingen.
De kwaliteit van het monster is afhankelijk van een aantal kritieke stappen in het dissectie proces. De dissecties zijn technisch veeleisend, met dissectie snelheid en monster zuiverheid verhogen met ervaring. Ontleden voor korte perioden (20 – 30 min) in gekoelde buffer zonder afwasmiddel en onmiddellijk invriezen helpt om de integriteit van het monster te behouden, zoals eerder is waargenomen voor muis pees isolatie54. IFMs kunnen met succes droog worden bevroren na het verwijderen van alle buffer uit de pellet, maar specifiek voor RNA-isolatie, de bevriezing van monsters in isolatie buffer neigt tot betere resultaten te produceren. IFMS van maximaal 20 afzonderlijke dissecties worden voorafgaand aan RNA-of eiwit-isolatie gecombineerd, waardoor opschalen en voldoende materiaal kan worden verzameld, zelfs vanaf vroege tijdpunten of mutanten16,32, voor downstream-analyse.
Voor RNA-toepassingen kan de meest kritieke stap de isolatie van het RNA zelf zijn. Guanidinium thiocyanate-fenol-chloroform isolatie (methode 1 hierboven) overtreft de meeste commerciële kits getest en, zoals eerder opgemerkt, is aanzienlijk minder duur55. De variabiliteit waargenomen in RNA-isolatie opbrengsten met commerciële kits is in overeenstemming met eerdere observaties56,57. We voegen verder glycogeen toe tijdens de precipitatie van isopropanol om alle RNA te helpen herstellen. Naast RNA-opbrengst is het belangrijk om de RNA-integriteit te controleren om ervoor te zorgen dat het monster niet gefragmenteerd of afgebroken is tijdens de dissectie-en isolatie processen. Het is ook essentieel om RNase-vrij te werken. Ten slotte kan de keuze van de RT-Kit invloed hebben op de gevoeligheid van het omgekeerde transcriptie proces. Hoewel ze niet vaak gedetailleerd worden besproken, hebben al deze punten invloed op de kwaliteit van het IFM-monster en de gegevens die worden verkregen uit downstreamtoepassingen.
Verschillende belangrijke wijzigingen stellen het protocol naast bestaande IFM-dissectie protocollen. Hoewel een gedetailleerd dissectie protocol voor IFM immunofluorescentie bestaat19, presenteert dit protocol een andere benadering van exuviae dissecties die een snellere isolatie van IFM-weefsel mogelijk maakt. Dit maakt het verzamelen van grote hoeveelheden IFM weefsel (relatief gesproken) met beperkte dissectie tijden om te voorkomen dat Proteoom of transcriptome veranderingen. Andere protocollen beschrijven dissectie van volwassen IFM voor het visualiseren van GFP-kleuring in individuele myofibrillen39 of voor het kleuring van larvale Body-Wall-spieren58, maar ze hebben geen betrekking op dissectie op exuviae-stadia of op isolatie van RNA of eiwitten. Deze aanpak verschilt ook van het bestaande protocol voor micro dissectie van exuviae IFMS van cryosecties38, die een zuiverder IFM-monster kan genereren, maar meer arbeidsintensief is en minder materiaal produceert. In vergelijking met andere Rapid Adult IFM dissectie protocollen38,39, zijn IFMS geïsoleerd in PBS-buffer zonder reinigingsmiddel om stress inductie en andere belangrijke veranderingen in de expressie te beperken.
De belangrijkste voorschot in dit protocol is de opname van een live, fluorescerende Reporter, waardoor isolatie van de IFMS in vroege exuviae stadia. We gebruiken standaard Mef2-GAL459 rijden ofwel UAS-CD8:: GFP of UAS-GFP:: GMA60. Dit maakt differentiële etikettering van IFM mogelijk (vlucht spieren zijn krachtiger gelabeld en verschillend gevormd dan andere exuviae-spieren), evenals prestaties van GAL4-UAS-gebaseerde manipulaties, bijvoorbeeld reddingsoperaties of RNAi-experimenten. Het is ook mogelijk om Mef2-GAL4 te combineren met tub-GAL80TS om RNAi-geassocieerde vroege letaliteit of met UAS-Dcr2 te vermijden om RNAi-efficiëntie40te verhogen.
Er zijn extra GAL4 drivers of GFP-lijnen beschikbaar die variëren in spier-type specificiteit, temporale expressie patroon, en de sterkte van de bestuurder19,61 die kunnen worden gebruikt in plaats van Mef2-GAL4. Bijvoorbeeld, Act88F-GAL4 wordt voor het eerst uitgedrukt rond 24 h APF, dus het kan niet worden gebruikt voor eerdere tijdpunten; echter, het sterk Etiquette IFM en kan nuttig zijn om te voorkomen dat RNAi-geassocieerde vroege letaliteit. Hem-GFP of Act88F-GFP label IFM, opnieuw met tijdelijke beperkingen, maar ze vermijden GAL4 afhankelijkheid van marker expressie en kunnen nuttig zijn in combinatie met een mutant achtergrond van belang. Lijsten van andere mogelijke markeringslijnen zijn beschikbaar19. Er moet ook worden opgemerkt dat het gebruik van transgenen en het GAL4/UAS-systeem genexpressie artefacten kan veroorzaken, dus het is belangrijk om geschikte controles te gebruiken, bijvoorbeeld de driver lijn die wordt doorkruist naar de wild-type achtergrond stam, zodat dergelijke artefacten vermoedelijk hetzelfde in alle samples.
Met de begeleidende video, dit gedetailleerde protocol is bedoeld om exuviae IFM dissectie toegankelijker te maken en te bevorderen het gebruik van omics benaderingen om spierontwikkeling te bestuderen. Het koppelen van de kracht van Drosophila genetica en celbiologie met de biochemie en omics assays toegankelijk via ONTLEED IFM heeft het potentieel om het mechanistische begrip van myogenese en spierfunctie te verbeteren. Toekomstige studies die systemen-niveau observaties van transcriptome en Proteoom regulatie koppelen aan metabole en functionele outputs zullen een dieper inzicht geven in spier-type specifieke ontwikkeling en de pathogenese van spieraandoeningen.

Moderne Omics-technologieën bieden belangrijke inzichten in de spierontwikkeling en de onderliggende mechanismen van menselijke spieraandoeningen. Bijvoorbeeld, analyse van transcriptomics gegevens in combinatie met genetische en biochemische controle in diermodellen is gebleken dat verlies van de splicing factor RBM20 veroorzaakt verwijde cardiomyopathie als gevolg van de regulering van een doelnetwerk van meer dan 30 sarcomere genen die eerder geassocieerd werden met hart-en vaatziekten, waaronder titin1,2,3.
In een tweede voorbeeld hebben studies van celkweek, diermodellen en humane patiënten aangetoond dat myotonische dystrofie wordt veroorzaakt door een verstoring van de RNA-regulatie als gevolg van de sekwestratie van muscleblind (mbnl) en opregulatie van CELF14,5. De cross-regelgevende en temporele dynamiek tussen MBNL en CELF1 (ook wel CUGBP1 of Bruno-like 2 genoemd) helpen om de aanhoudende embryonale splicing patronen uit te leggen bij patiënten met myotonische dystrofie. Bovendien helpt het grote netwerk van niet-gereguleerde doelen om de complexe aard van de ziekte4,6,7,8uit te leggen. Een meerderheid van dergelijke studies gebruiken omics benaderingen in genetische model organismen om te begrijpen van de mechanismen die onderliggende menselijke spierziekte. Bovendien benadrukken ze het belang van het eerste begrip van temporele en weefsel-type specifieke genexpressie, eiwit modificatie, en metabole patronen in gezonde spieren om veranderingen in zieke of verouderende spieren te begrijpen.
Drosophila melanogaster is een ander, goed opgezet genetisch modelorganisme. De structuur van de sarcomere en individuele sarcomere componenten worden sterk bewaard van vliegen naar gewervelde dieren4,9,10, en de indirecte vlucht spieren (IFMS) zijn uitgegroeid tot een krachtig model om te studeren meerdere aspecten van de spierontwikkeling11,12. Eerste, de fibrillar vlucht spieren zijn functioneel en morfologisch onderscheiden van buisvormige lichaamsspieren11,13, waardoor onderzoek van spier-type specifieke ontwikkelingsmechanismen. Transcriptiefactoren, waaronder Spalt Major (Salm)14, extradenticle (Exd), en Homothorax (HTH)15 zijn geïdentificeerd als fibrillar Fate regulators. Bovendien stuurt de CELF1 homo Bruno1 (Bru1, Aret), stroomafwaarts van Salm, een fibrillar-specifiek splicing programma16,17.
Ten tweede zijn IFMS een belangrijk model voor het begrijpen van het proces van myogenese zelf, van Myoblast fusie en myotube gehechtheid aan myofibrillogenese en sarcomere rijping9,18,19. Ten derde, Drosophila genetica maakt onderzoek van bijdragen door individuele eiwitten, eiwit domeinen, en eiwit isovormen aan sarcomere vorming, functie, en biofysische eigenschappen20,21,22 ,23. Ten slotte zijn IFM-modellen ontwikkeld voor de studie van meerdere menselijke spieraandoeningen, zoals myotonische dystrofie, myofibrillaire myopathieën, spier degeneratieve aandoeningen, actinopathieën, enz.24,25,26 ,27, en hebben belangrijke inzichten gegeven in ziekte mechanismen en mogelijke therapieën28,29,30. Dus, Drosophila is een nuttig model om veel open vragen in de myogenese veld, met inbegrip van mechanismen van spier-type specifieke transcriptie, splicing, en chromatine regulering, evenals de rol van metabolisme in spierontwikkeling. De toepassing van moderne Omics-technologieën, in het bijzonder in combinatie met de grote verscheidenheid aan genetische, biochemische en celbiologische assays die beschikbaar zijn in Drosophila, heeft het potentieel om het begrip van spier massa drastisch te ontwikkeling, veroudering en ziekte.
IFMS zijn de grootste spieren in de vlieg, die bijna 1 mm over de gehele lengte van de thorax beslaan bij volwassenen31,32. Dit kleine formaat genereert echter de uitdaging om voldoende monster te verkrijgen om Omics-technologieën in Drosophila op een specifieke manier van het type weefsel toe te passen. Bovendien zijn ifm's onderdeel van de volwassen spier massa die tijdens de exuviae-stadia wordt gevormd. Myoblasten zekering te vormen myotubes, die hechten aan pezen rond 24 h na Puparium vorming (APF) en ondergaan een verdichtings stap nodig om te initiëren myofibrillogenese rond 30 h APF (Figuur 1a-D)18,33, 34.
De myofibers groeien dan tot de gehele lengte van de thorax, met myofibrillen ondergaat een initiële groeifase gericht op sarcomere optellen tot ongeveer 48 h APF, en vervolgens overstappen naar een rijpingsfase, waarin sarcomeres groeien in lengte en breedte en zijn gerenoveerd om stretch-activatie door 72 h APF vast te stellen (afbeelding 1A-D)32,35. Het begin van de rijping van vezels wordt op zijn minst gedeeltelijk beheerst door Salm en E2F32,36,37, en meerdere IFM-specifieke sarcomere eiwit isovormen waarvan de splicing wordt gecontroleerd door Bru1 zijn opgenomen tijdens deze fase16,17. Volwassen vliegen Eclose van 90 – 100 h APF. Dit betekent dat om spierontwikkeling te bestuderen, IFM moet worden geïsoleerd met voldoende hoeveelheid, kwaliteit en zuiverheid van meerdere exuviae-tijdpunten om de analyse met omics-benaderingen te vergemakkelijken.
Er zijn verschillende protocollen voor IFM-dissectie gepubliceerd. Hoewel deze protocollen goed werken voor de beoogde toepassingen, zijn geen van beide ideaal voor omics-benaderingen. Protocollen die de morfologie van IFM behouden voor immunofluorescentie van exuviae en volwassen IFMS19, isoleren van IFM-vezels voor mechanische evaluatie31, of gebruik maken van micro dissectie van exuviae IFM van cryosecties38 zijn te gespecialiseerd en tijd en arbeidsintensief voor het redelijkerwijs verkrijgen van voldoende hoeveelheden IFM-weefsel voor omics-toepassingen. Andere protocollen zijn ontwikkeld voor een snelle dissectie van specifiek volwassen IFM38,39, zijn dus niet van toepassing op exuviae stadia, en gebruiken buffers die niet ideaal zijn of onverenigbaar kunnen zijn met bijvoorbeeld RNA-isolatie. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe benaderingen om exuviae IFM te isoleren voor Biochemie of omics-toepassingen.
Hier presenteren we een protocol voor de dissectie van IFM tijdens exuviae stadia die met succes is gebruikt voor mRNA-SEQ analyse van 16 h APF door volwassen stadia16,32. Het protocol maakt gebruik van een groen fluorescerende proteïne (GFP) label om te identificeren IFMS in alle stadia van exuviae en volwassen ontwikkeling, waardoor Live dissectie onder een fluorescerende ontleed Microscoop. De aanpak is minder arbeidsintensieve, met een hogere doorvoer dan bestaande IFM dissectie-protocollen. Dit maakt een snelle isolatie en cryopreservering van monsters mogelijk, waardoor genoeg materiaal wordt gegenereerd na verschillende rondes van dissectie voor omics-benaderingen, evenals voor standaard reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (RT-PCR) of Western-blotting.
We presenteren het protocol in twee delen, demonstreren hoe snel te ontleden IFMS zowel vóór 48 h APF (tijdens vroege metamorfose, wanneer IFM-bijlagen zijn meer zwak) en na 48 h APF (wanneer de exuviae lichaam plan en IFM-bijlagen zijn goed gedefinieerd). We laten zien dat we RNA van hoge kwaliteit kunnen isoleren van ontleed IFMs op alle tijdspunten en gegevens presenteren over verschillende benaderingen van RNA-isolatie en omgekeerde transcriptie. Tot slot tonen we de toepassing van het dissectie protocol op mRNA-seq, Mass spectrometrie en RT-PCR met behulp van de CELF1 homo Bruno1 als voorbeeld. We tonen misexpression van sarcomere eiwit isovormen in proteomica data van Bruno1 Mutant IFM en onderzoeken Bruno1 regulatie van de C-Terminal Splice Event van myosin Heavy Chain (MHC). Deze resultaten illustreren hoe omics-gegevens een dieper begrip van biologische fenomenen kunnen opleveren, waarbij genetische en biochemische experimenten worden aangevuld.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila Flight Muscle is een krachtig model om diverse processen te bestuderen, zoals transcriptionele regulering, alternatieve splicing, metabolisme en mechanobiologie, die allemaal van invloed zijn op de spierontwikkeling en myofibrillogenese. Omics-gegevens, zoals die worden gegenereerd door massaspectrometrie of diepe sequentiëring, kunnen belangrijke mechanistische inzichten in deze biologische processen bieden. Voor dergelijke benaderingen is het nuttig om weefsel-specifieke monsters te analyseren om zowel de selectiviteit als de specificiteit van de omics-vingerafdrukken te verhogen. Hier presenteren we een protocol voor dissectie van TL-gelabelde Flight muscle van Live poppen om sterk verrijkte spier monsters te genereren voor omics-toepassingen. We beschrijven eerst hoe vlieg spieren te ontleden in vroege exuviae stadia (< 48 h na Puparium vorming [APF]), wanneer de spieren kunnen worden onderscheiden door groen fluorescerende proteïne (GFP) labeling. Vervolgens beschrijven we hoe we de spieren kunnen ontleden van late poppen (> 48 h APF) of volwassenen, wanneer spieren te onderscheiden zijn onder een ontleed Microscoop. Het begeleidende video protocol zal deze technisch veeleisende dissecties breder toegankelijk maken voor de spier-en Drosophila onderzoeksgemeenschappen. Voor RNA-toepassingen, testen we de hoeveelheid en de kwaliteit van RNA die kunnen worden geïsoleerd op verschillende tijdstippen en met verschillende benaderingen. Verder tonen we aan dat Bruno1 (Bru1) noodzakelijk is voor een tijdelijke verschuiving in myosin zware keten (MHC) splicing, demonstreren dat ontleed spieren kunnen worden gebruikt voor mRNA-seq, massaspectrometrie, en omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) Toepassingen. Dit dissectie protocol zal helpen bij het bevorderen van Weefselspecifieke omics-analyses en kan over het algemeen worden toegepast om meerdere biologische aspecten van myogenese te bestuderen.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila Flight Muscle is een krachtig model om transcriptionele regulering, alternatieve splicing, metabolisme en mechanobiologie te bestuderen. We presenteren een protocol voor dissectie van TL-gelabelde Flight muscle van Live poppen voor het genereren van zeer verrijkte monsters ideaal voor proteomica en Deep-sequencing. Deze monsters kunnen belangrijke mechanistische inzichten bieden in diverse aspecten van spierontwikkeling.

Dissectie van vlucht spieren van Drosophila melanogaster voor omics-benaderingen

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Het protocol vergemakkelijkt de dissectie van GFP-gelabelde indirecte vluchtspier van Drosophila op verschillende tijdspunten tijdens de ontwikkeling van poppen om veranderingen in gen- en eiwitexpressie te beoordelen. Met behulp van deze technieken kan een hoog verrijkt vluchtspiermonster met minimale RNA-eiwitdegradatie worden bereikt dat geschikt is voor RT-PCR, westelijke vlek of omische benaderingen. Deze gespecialiseerde ontledingen vereisen oefening en vaardigheid, maar het aantal poppen dat kan worden ontleed en de kwaliteit van de monsters te verbeteren met ervaring.Visuele demonstratie van deze dissectie is van cruciaal belang voor het bepalen hoe vluchtspieren te onderscheiden van niet-spierweefsels en het vergemakkelijken van de snelle isolatie van vluchtspieren van popmonsters. Om de poppen in scène te zetten, gebruikt u een bevochtigde kwast om pre-poppen te verzamelen en over te brengen in een petrischaaltje van 60 millimeter en geslacht de poppen onder een verrekijkermicroscoop. Mannetjes worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van teelballen, die verschijnen als doorschijnende bollen op de anders ondoorzichtige pop.Na het labelen van de schotel met de tijd, datum en genotype van de vliegen, leeftijd van de pop in een 25 tot 27 graden Celsius incubator tot het juiste stadium. Voor IFM-dissectie vóór 48 H APF gebruikt u een bevochtigde kwast om de op de juiste plaats geënsceneerde poppen over te brengen op een zwarte ontleedschotel van ongeveer 2/3 gevuld met gekoelde PBS. Onder de fluorescerende ontleden microscoop, gebruik maken van een 5 tangen om een van de poppen te duwen naar de bodem van de zwarte ontleden schotel.Pas de microscoop zoom en focus totdat de pop duidelijk kan worden gevisualiseerd. Met behulp van een paar tangen om de voorste van de poppen te grijpen, por de pop met een enkele punt van een tweede paar tangen, iets off-center in de buik, net achter de thorax. Gebruik het eerste paar tangen om de voorste helft van het popgeval te verwijderen en de blootgestelde poppen net achter de thorax te knijpen om de buik van de thorax te scheiden.Vervolgens knijp je voorzichtig in het voorste deel van de thorax om de fluorescerende IFMs bloot te leggen. Gebruik vervolgens de tangen om het resterende karkas aan de andere kant van de schotel weg te gooien en de daaropvolgende poppen op dezelfde manier te ontleden. Wanneer alle poppen zijn ontleed, gebruik maken van de tangen om de IFM vezels te verzamelen, en organiseren van de vezels in een stapel aan de onderkant van de zwarte ontleden schotel.Gebruik de tangen om vuil uit het gezichtsveld te duwen en verwijder alle niet-IFM-spieren, vet, nagelriemen of ander ongewenst weefsel uit de monsters. Gebruik vervolgens een afgeknipte pipettip om de stapel IFM's over te zetten in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 250 microliters gekoelde PBS. Voor IFM dissectie na 48 H APF, gebruik een licht bevochtigde kwast om de geënsceneerde pop over te brengen op een strook van dubbelzijdige plakband gemonteerd op een microscoop dia.Oriënteer de poppen in een lijn, ventrale kant naar beneden, en voorste naar de onderkant van de dia. Wanneer alle poppen zijn geplaatst, gebruik tangen uit elkaar te plagen en open de eerste pupal geval boven de voorste spiracles, en zachtjes schuif een paar tang dorsaal, in de richting van het achterste, het snijden van de pupal geval als de tang bewegen. Bevrijd de poppen uit de geopende koffer en breng de poppen onmiddellijk over op een druppel PBS op een tweede microscoopdia.Wanneer alle poppen zijn bevrijd, gebruik fijne schaar om de buik van de poppen weg te snijden van de thorax, en duw de buiken in een aparte stapel. Wanneer alle thoraxen zijn verwijderd, gebruik dan een stuk tissuepapier om de meerderheid van de PBS en de stapel buiken te verwijderen. Voeg een druppel verse, gekoelde PBS toe aan de resterende thoraxen, voordat u de schaar gebruikt om van het hoofd langs de lengtelichaamsas in één beweging te snijden om de thorax in tweeën te delen.Wanneer alle poppen zijn ontleed, gebruik dan de 5 tangen om een van de hemisections te selecteren en steek voorzichtig de uiteinden van een tang boven en onder het midden van de IFMs. Houd het eerste paar tangen stil, gebruik fijne schaar om het ene uiteinde van de IFM weg te snijden van de schurfbeen en pezen, voordat u de poppen 180 graden draait, zodat het andere uiteinde van de IFM vrij kan worden gesneden uit de cuticula en pezen. Gebruik tangen om de IFM-bundel van de thorax naar de rand van PBS-bubbel over te brengen, met behulp van waterspanning om de bundel op zijn plaats te houden.Duw vervolgens het karkas naar de andere kant van de dia en ontleed de rest van de IFM's op dezelfde manier. Wanneer alle IFMs zijn verzameld, gebruik maken van de 5 tangen om een sprong spier of cuticula fragmenten die hun weg hebben gevonden in de monsters te verwijderen. Gebruik vervolgens waterspanning om de ontleede IFM's voorzichtig vast te leggen tussen een paar tangen en plaats de IFM's in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 250 microliter gekoelde PBS.mRNA-sequencinggegevens van BRUNO1 IR IFMs tonen veranderingen in expressie op het niveau van de gen-eenheid in vergelijking met wildtype sequencing gegevens. Met behulp van hele proteome massaspectrometrie op ontleede IFMs, wordt een soortgelijke regulatie waargenomen bij de eiwit- en eiwit-isoformniveaus. Na het inbrengen van een eiwitvallijn in het uiteindelijke intron van Mhc, kan de integratie van het GFP-gelabelde eiwit in IFM worden waargenomen als twee stippen aan weerszijden van de M-lijn bij 90 H APF, terwijl in beenspierweefsel het GFP-signaal gelijkmatig over de sarcomere M-lijn kan worden waargenomen.Bij het gebruik van RT-PCR op ontleed IFM kan tussen 30 en 48 uur na de vorming van puparium bij 27 graden Celsius een Mhc-isoform-schakelaar worden gedetecteerd van de exon met het GFP-label 34 tot 37-evenement naar de niet-gelabelde exon 34 tot 35-gebeurtenis. Van mRNA sequencing gegevens, been en sprong spierweefsels uitdrukken alle drie Mhc isoforms, behoud van expressie van de GFP-gelabelde isoform in volwassen spieren. Zowel Spalt major mutant en BRUNO1 IR-IFM, niet uit te schakelen expressie van de GFP-gelabelde Mhc isoform als ze ontwikkelen, wat resulteert in een isoform expressie profiel lijkt op dat van been en springen spierweefsel.Vergeet niet dat de dissecties moeten worden uitgevoerd in minder dan 30 minuten om RNA degradatie te voorkomen. En, om ervoor te zorgen om besmetting door andere celtypes te beperken. Deze methode genereert IFM-verrijkte monsters geschikt voor biochemische benaderingen zoals RT-PCR, of westerse blotting, evenals omische stijl benaderingen, zoals massaspectrometrie, hoge doorvoer sequencing, chromatine conformatie vastleggen, en metabolomics.Deze dissecties kunnen de krachtige genetische benaderingen in Drosophila aanvullen met gegevens op systeemniveau voor het onderzoeken van de fundamentele mechanismen van ontwikkeling en genregulatie.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Meten van oefening niveaus bij Drosophila melanogaster met behulp van de roterende oefening kwantificering (systeemvereisten)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

De tredmolen: Interval Training Protocol voor zachtjes geïnduceerde oefening bij Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Gebruik van Drosophila S2-cellen voor Live beeldvorming van celdeling

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...