Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à Andreas Ladurner et Frank Schnorrer pour leur généreux soutien. Nous remercions Sandra Esser pour son excellente assistance technique et Akanksha Roy d'avoir généré les données de spectrométrie de masse. Nous reconnaissons les centres boursiers Bloomington et Vienne pour la fourniture de mouches. Nous remercions le Core Facility Bioimaging pour son aide en imagerie confocale et le Zentrallabor f'r Proteinanalytik pour l'analyse d'échantillons de spectrométrie de masse, tous deux au Centre biomédical LMU (Martinsried, DE). Notre travail a été soutenu par le Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), le Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) de l'Université Ludwig-Maximilians de Munich (MLS), le Frederich-Bauer Stiftung (MLS) et l'International Max École de recherche Planck (EN).

1. Mise en scène des Pupae
<ol><li>Élever les mouches du génotype désiré en bouteilles (Figure 1E). Soit faire un nouveau flip du stock de dissection ou définir une croix avec au moins 20 mouches vierges femelles. Maintenir les bouteilles jusqu'à ce que les mouches commencent à se pupair.</li>
	<li>Recueillir les pré-pupae à l'aide d'un pinceau mouillé et le transférer dans du papier filtre mouillé dans un plat Petri de 60 mm (Figure 1F).</li>
	<li>Sexe des chiots, la collecte du sexe approprié pour l'expérience (Figure 1G). Les mâles sont identifiés par la présence de testicules, qui apparaissent comme des boules translucides dans la pua autrement opaque.</li>
	<li>Étiquetez le plat Petri avec l'heure, la date et le génotype, puis vieillissez les pulétes à l'étape désirée (Figure 1H). REMARQUE: Maintenir les croisements/stocks et les pupae d'âge dans un incubateur à température contrôlée (c.-à-d. 25 ou 27 oC pour les croisements d'ARNi, car l'augmentation de l'activité de Gal4 à des températures plus élevées augmente l'efficacité de knock-down40). Assurez-vous que l'humidité est suffisamment élevée pour que les chiots ne se dessèchent pas lorsqu'ils vieillissent plusieurs jours.</li>
</ol>2. Dissection IFM Avant 48 h APF
<ol><li>Assembler l'équipement nécessaire, y compris deux #5 des forceps de qualité biologique, une pipette, des pointes de pipette, de la glace sèche et (pour les échantillons d'ARN) un réactif d'isolement (voir Tableau des matériaux). De plus, refroidissez les plats de dissection noir (voir Tableau des matériaux),1x tampon salin tampon tampon tampon tampon tampon tampon de phosphate (PBS) et 1,5 mL tubes microcentrifuge sur la glace.</li>
	<li>À l'aide d'un pinceau mouillé, transférer les puques mises en scène dans un plat de dissection noir rempli d'environ deux tiers de PBS froid 1x(figure 2A,B). Passez à un microscope fluorescent disséquant. REMARQUE: Utilisez autant de pupas que peut être disséqué dans une fenêtre de 30 minutes. Selon l'expérience, cela va de 3 à 15 pupae. Voir Méthodes supplémentaires pour discuter des alternatives aux plats de dissection noir.</li>
	<li>À l'aide de #5 forceps, poussez l'une des pupes au fond d'un plat noir de dissection et ajustez le zoom du microscope et concentrez-vous pour voir clairement la pupe(figure 2C).</li>
	<li>Saisissez l'antérieur de la pupa avec un forceps (Figure 2D), puis piquer les pupae avec une seule pointe des autres forceps légèrement décalédans dans l'abdomen, juste derrière le thorax. Cela maintient la pupa en place et empêche les IFM de se déplacer dans l'abdomen (Figure 2E). REMARQUE: Commencez à chronométrer la durée de la dissection à partir de ce point, dès que l'intégrité du pupal est perturbée. Utilisez une longueur définie de dissection (par exemple 20 à 30 min) pour minimiser la mort musculaire et les changements transcriptomiques et protéomiques associés. Disséquer autant de mouches que possible dans cette période de temps.</li>
	<li>À l'aide des premiers forceps, retirez la moitié antérieure du boîtier pupal (Figure 2F).</li>
	<li>Utilisez les mêmes forceps pour pincer les pupae exposées juste derrière le thorax, et séparer l'abdomen du thorax (Figure 2G).</li>
	<li>À l'aide des forceps, presser doucement la partie antérieure du thorax (pour le FPA de 35 h) ou ouvrir le thorax pour exposer les IFM étiquetés fluorescents (figure 2H). Les IFM se détachent facilement de l'épiderme, car les attaches tendineuses aux premiers moments sont fragiles. Jeter la carcasse restante à l'aide de forceps pour la pousser de l'autre côté du plat.</li>
	<li>Les étapes répétitives 2.3-2.7, disséquent les chiots supplémentaires.</li>
	<li>Recueillir les fibres IFM avec des forceps et les organiser en un tas au fond du plat noir disséquant(Figure 2I,J). Enlevez les débris en les poussant hors du champ de vision à l'aide de forceps. REMARQUE: Avec la pratique, les pointes de forceps peuvent être mises à proximité sans se toucher. Cette technique peut être utilisée pour saisir lâchement les IFM sans les détruire. Les autres méthodes incluent pousser ou soulever doucement les IFM avec une seule pointe ou des forceps complètement fermés, ou prendre de la graisse ou d'autres tissus avec l'IFM et enlever la graisse telle que décrite à l'étape 2.10.</li>
	<li>Contrôle de la qualité de l'échantillon musculaire IFM, en utilisant les forceps pour enlever les muscles non-IFM, graisse, cuticule, etc de l'échantillon (Figure 2K,L). REMARQUE: Avec Mef2-Gal4, IFM est étiqueté plus fortement que les autres types de muscles aux premiers moments (Figure 2K,K'), permettant l'élimination des muscles de saut et des muscles larvaires en fonction de l'intensité de la fluorescence et de la forme musculaire. Les tissus gras et cuticules sont différents et ne sont pas étiquetés par une étiquette de fluorescence spécifique aux muscles (Figure 2K,K'). Voir la section de discussion pour les autres lignes Gal4 qui étiquette IFM.</li>
	<li>À l'aide d'une pointe de pipette coupée, transférer la pile d'IFM dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml rempli de 250 l de 1x PBS réfrigéré(figure 2M-O). Passez immédiatement à l'article 4. REMARQUE: Les échantillons d'IFM peuvent être perdus simplement en s'accrochant au côté de la pointe de la pipette. Pipetting tampon de haut en bas plusieurs fois avant de recueillir IFMs peut rendre les conseils standard moins collant, et siliconé ou perfluoroalkoxy (PFA) conseils (voir tableau des matériaux) avec des tensions de surface plus faibles peuvent aider à prévenir la perte de l'échantillon.</li>
</ol>3. Dissection IFM Après 48 h APF
<ol><li>Assembler l'équipement nécessaire, y compris deux puniteurs de qualité biologique #5, des ciseaux fins, des lames standard de microscope en verre, du ruban adhésif double, une pipette, des pointes de pipette, de la glace sèche et (pour les applications d'ARN) un réactif d'isolement (voir Tableau des matériaux). Refroidir les tubes 1x PBS et microcentrifuge sur la glace.</li>
	<li>À l'aide d'un pinceau légèrement mouillé, transférer les pupae mises en scène sur une bande de ruban adhésif recto-verso monté sur une lame de microscope(figure 3A). Placer les chiots dans une ligne orientée dans la même orientation (ventrale vers le bas et antérieure vers le bas de la glissière). REMARQUE: Veillez à ne pas utiliser trop d'eau sur le pinceau ou le filtre, ou les chiots ne colleront pas bien. Si les chiots ne collent pas, séchez-les en les transférant d'abord sur un filtre sec ou du papier de soie. Montez autant de pupae que l'on peut disséquer dans une fenêtre de 30 minutes, idéalement 10 pupae.</li>
	<li>Retirer la pua du pupal. Utilisez des forceps pour taquiner et ouvrir le boîtier pupal au-dessus des spiracles antérieurs (Figure 3B).</li>
	<li>Faites glisser doucement une paire de forceps dorsally vers le postérieur, coupant le boîtier pupal au fur et à mesure que les forceps se déplacent(figure 3B'). Veillez à ne pas rompre la pua sous-jacente. Libérez la pua de l'étui ouvert et transférez-la immédiatement à une goutte de 1x PBS sur une deuxième lame de microscope(Figure 3B), C).</li>
	<li>Répétez les étapes 3.3 et 3.4 pour toutes les pupae dans la ligne, puis mettez la glissière de ruban à double bâton de côté.</li>
	<li>À l'aide de ciseaux fins, couper l'abdomen de la pupa loin du thorax et le pousser dans une pile séparée(Figure 3D,D'). Répéter l'opération pour les pupae restantes. REMARQUE: Commencez à chronométrer la durée de la dissection avec l'étape 3.6, dès que l'intégrité du pupal est perturbée. Disséquez autant de mouches que possible dans 20-30 min pour empêcher la mort cellulaire et les changements transcriptomiques et protéomiques associés. Lors de la dissection de 1 d adultes ou de pupae de 90 h, il est souvent pratique pour les étapes ultérieures d'enlever en outre la tête avec les ciseaux fins.</li>
	<li>À l'aide d'un papier de soie, retirer la majorité du 1x PBS (généralement nuageux avec graisse en suspension) ainsi que la pile d'abdomens (figure 3E). Ajouter une goutte de PBS 1x frais et réfrigéré aux thoraxes restants.</li>
	<li>Utilisez les ciseaux pour couper le thorax en deux (Figure 3F,F') en coupant de la tête vers le bas de l'axe longitudinal du corps en un seul mouvement. Alternativement, si la tête a été enlevée, insérez d'abord les ciseaux où la tête était attachée et coupez la moitié supérieure du thorax longitudinalement entre les IFM. Ensuite, couper le côté ventral du thorax avec une deuxième coupe dans la même orientation.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.7 et 3.8 pour que toutes les pupae soient disséquées, générant un tas d'hémisections thorax près du centre de la diapositive. Assurez-vous qu'il y a suffisamment de PBS 1x réfrigéré sur la glissière afin que les hémisections ne se dessèchent pas. REMARQUE: Après 48 h APF, les IFM sont assez grandes pour être visibles sous un microscope de dissection standard à l'œil formé. À ce stade du protocole, les muscles munis d'une étiquette fluorescente peuvent être déplacés vers une portée de dissection fluorescente pour faciliter l'identification de l'IFM ou à des fins d'entraînement, mais ce n'est pas nécessaire.</li>
	<li>Disséquer les IFM du thorax. Isoler l'une des hémisections à l'aide des #5 forceps (Figure 3G,H). Insérez délicatement les extrémités d'un forceps au-dessus et au-dessous du milieu des IFM(figure 3G',H'). Tout en maintenant les premiers forceps encore, utilisez des ciseaux fins pour couper une extrémité de l'IFM loin de la cuticule et des tendons. Ensuite, coupez l'autre extrémité de l'IFM à l'abri de la cuticule(figure 3G',H''). REMARQUE: Selon l'orientation du thorax après la première coupe IFM, il est utile de faire pivoter le thorax à 180 degrés afin que la deuxième coupe IFM soit plus facile à effectuer.</li>
	<li>Retirez le faisceau IFM du thorax avec des forceps (Figure 3G'',H''''), le transférant au bord de la bulle PBS pour utiliser la tension de l'eau pour le maintenir en place (Figure 3I). Poussez la carcasse de l'autre côté de la glissière. Répétez l'opération pour les hémisections thorax restantes, générant une collection d'IFM disséqués. REMARQUE: Si les IFM ne restent pas dans un tas soigné, retirez une partie du 1x PBS avec un tissu. Veillez à ne pas laisser tous les PBS s'évaporer, et assurez-vous que les IFM et les hemithoraxes disséqués restent couverts par un tampon.</li>
	<li>Après avoir disséqué toutes les IFM, effectuez rapidement un contrôle de qualité sur le muscle disséqué. À l'aide de #5 forceps, enlever tout muscle de saut ou fragments de cuticule qui ont pu se trouver dans l'échantillon(figure 3J-K''). REMARQUE: Le muscle de saut semble différent de l'IFM. Si disséquer le muscle étiqueté Mef2-Gal4 sous fluorescence, le muscle de saut a une fluorescence plus faible et une forme et une texture différentes. Sous une lumière normale, il apparaît presque translucide alors que les IFM sont d'un jaune opaque et laiteux(figure 3J-J',K).</li>
	<li>À l'aide de la tension de l'eau, capturez (mais ne squishpas) les IFM disséqués entre une paire de forceps (figure 3L). Transférer les IFM dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml prérempli de 250 l de 1x PBS réfrigéré(figure 3M). Procédez immédiatement à l'article 4. REMARQUE: Lorsque les pointes de forceps sont apportées à proximité les unes des autres et soulevées d'une solution tampon, la tension de l'eau provoque une bulle de tampon à capturer entre les pointes de forceps. Si les IFM sont également présents dans cette bulle, ils peuvent être sortis de la solution et facilement transférés dans un autre réceptacle rempli de mémoire tampon. Il est important de presser les forceps pour amener les pointes les uns près de l'autre sans se toucher, pour éviter de macérer le tissu capturé dans la bulle tampon.</li>
</ol>4. Pelleter et préserver l'échantillon IFM
<ol><li>Pelleter les IFM en centrifugeant le tube microcentrifuge de 1,5 ml pendant 3 à 5 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse de table (Figure 4A,B).</li>
	<li>Retirez le tampon à l'aide d'une pointe de pipette (Figure 4C).
</li>
	<li>Pour les applications d'ARN, resuspendre le granule IFM dans 50 à 100 l du tampon d'isolement de l'ARN souhaité (voir Tableau des matériaux, Figure 4D). Dans le cas contraire, passez à l'étape 4.4. REMARQUE: Les IFM peuvent être congelés à sec après l'étape 4.2 pour les préparations de spectrométrie de masse ou l'isolement de l'ARN avec des kits commerciaux (voir les résultats représentatifs). Pour les applications d'ARN, de meilleurs résultats sont obtenus en reconpendant et en gelant immédiatement la pastille IFM dans un tampon d'isolement.</li>
	<li>Congeler l'échantillon sur la glace sèche ou le gel de rupture dans l'azote liquide (Figure 4E). Conserver à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour les étapes suivantes dans la préparation de l'échantillon pour l'analyse en aval. REMARQUE: Après la cryoconservation, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois avant d'être traités pour une étude en aval.</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans ce protocole, nous présentons la technique de base pour disséquer les IFM de Drosophila des chiots précoces et tardifs pour l'isolement en aval des protéines, de l'ADN, de l'ARN ou d'autres macromolécules. Le protocole peut être facilement adapté pour disséquer l'IFM des mouches adultes. Nous démontrons l'utilité de notre protocole de dissection pour les applications d'ARNm, de protéomique et de RT-PCR. Avec l'amélioration continue des technologies d'omique pour permettre l'analyse des échantillons avec moins de matériel de départ et des concentrations d'entrée plus faibles, ces dissections deviendront probablement valables pour de nombreuses applications supplémentaires. Comme les IFM sont un modèle établi pour les myopathies humaines4,24 et le développement spécifique de type musculaire9,12, nous envisageons, par exemple, des métabolomiques enrichis en IFM, des enquêtes sur la conformation de chromatine via 3C ou 4C, épissage de l'évaluation du réseau via les interactions CLiP ou phospho-protéomique de la myofibrillogénèse.
Il est important de considérer que ces dissections produisent un échantillon enrichi pour l'IFM au lieu d'un échantillon IFM pur. Ceci est inévitable en raison de l'innervation de neurone moteur, des attachements de tendon et de l'invasion trachéale des fibres de muscle. L'analyse bioinformatique peut être utilisée pour identifier les gènes ou les protéines enrichis en IFM, mais d'autres expériences sont nécessaires pour démontrer qu'ils sont en fait spécifiques à l'IFM. La pureté de l'échantillon peut être astopique à l'aide de marqueurs publiés spécifiques aux tissus tels que Stripe45 (tendon), Act79B4,44 (muscle tubulaire), Act88F15 (IFM), ou syb46 (spécifique neuronal). Il est peut-être possible d'utiliser de tels marqueurs pour normaliser les ensembles de données au contenu spécifique à l'IFM, mais les utilisateurs sont avertis que les changements temporels dans l'expression des gènes utilisés pour la normalisation, par exemple des gènes spécifiques à l'IFM ou de la tubuline, peuvent biaiser une telle approche.
Des méthodes d'étiquetage spécifiques aux tissus génétiquement codés, par exemple le marquage EC47,48 ou l'étiquetage PABP49,50 pour l'isolage de l'ARN ont été développés ces dernières années, ce qui peut aider à obtenir un échantillon d'ARN spécifique aux tissus. Cependant, le marquage EC nécessite une alimentation constante des mouches47 et n'est donc pas applicable pendant les stades pupal. La sensibilité et l'exhaustivité des transcriptomes étiquetés PABP peuvent avoir des limites51. Les approches FACS pour isoler les fibres musculaires individuelles sont compliquées par la grande taille et la nature syncytiale des IFM. INTACT52,53 approches de style peuvent être appliquées pour isoler des compartiments sous-cellulaires spécifiques des IFM, ce qui peut s'avérer utile pour isoler les populations pures de noyaux OU mitochondries IFM. Les dissections manuelles sont toujours la norme actuelle pour obtenir le tissu IFM intact pour la plupart des applications en aval.
La qualité de l'échantillon dépend de plusieurs étapes critiques du processus de dissection. Les dissections sont techniquement exigeantes, avec la vitesse de dissection et la pureté de l'échantillon augmentant avec l'expérience. La disséchation pendant de courtes périodes (20 à 30 min) dans un tampon réfrigéré sans détergent et le gel immédiat aide à préserver l'intégrité de l'échantillon, comme cela a été observé précédemment pour l'isolement du tendon de souris54. Les IFM peuvent être congelés à sec avec succès après avoir retiré tout tampon de la pastille, mais plus précisément pour l'isolement de l'ARN, les échantillons de congélation dans le tampon d'isolement ont tendance à produire de meilleurs résultats. Les IFM de jusqu'à 20 dissections distinctes sont combinées avant l'isolement de l'ARN ou des protéines, ce qui permet d'intensifier et de recueillir suffisamment de matériel, même à partir de premiers moments ou mutants16,32, pour l'analyse en aval.
Pour les applications d'ARN, l'étape la plus critique peut être l'isolement de l'ARN lui-même. L'isolement de guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (méthode 1 ci-dessus) surpasse la plupart des kits commerciaux examinés et, comme mentionné précédemment, est considérablement moins cher55. La variabilité observée dans les rendements d'isolement de l'ARN avec les kits commerciaux est en accord avec les observations précédentes56,57. Nous ajoutons en outre du glycogène pendant les précipitations d'isopropanol pour aider à récupérer tout l'ARN. Au-delà du rendement de l'ARN, il est important de vérifier l'intégrité de l'ARN pour s'assurer que l'échantillon n'a pas été fragmenté ou dégradé au cours des processus de dissection et d'isolement. Il est également essentiel de travailler sans RNase. Enfin, le choix de RT-kit peut avoir un impact sur la sensibilité du processus de transcription inversée. Bien qu'ils ne soient pas souvent discutés en détail, tous ces points influent sur la qualité de l'échantillon DE l'IFM et sur les données obtenues à partir des demandes en aval.
Plusieurs modifications importantes distinguent le protocole des protocoles de dissection IFM existants. Bien qu'un protocole détaillé de dissection pour l'immunofluorescence d'IFM existe19,ce protocole présente une approche différente aux dissections pupal qui permet l'isolement plus rapide du tissu d'IFM. Cela permet la collecte de grandes quantités de tissu IFM (relativement parlant) avec des temps de dissection limités pour prévenir les changements de protéome ou de transcriptome. D'autres protocoles décrivent la dissection de l'IFM adulte pour visualiser la coloration gFP dans les myofibrils individuels39 ou pour la coloration des muscles larvaires de corps-mur58,mais ils n'abordent pas la dissection aux stades pupal ou pour l'isolement de l'ARN ou de la protéine. Cette approche est également distincte du protocole existant pour la microdissection des IFM pupal à partir de cryosections38, qui peut générer un échantillon plus pur IFM, mais est plus laborieux et produit moins de matériel. Par rapport à d'autres protocoles de dissection IFM adultes rapides38,39, IFMs sont isolés dans la mémoire tampon PBS sans détergent pour limiter l'induction du stress et d'autres changements majeurs d'expression.
L'avancée clé de ce protocole est l'inclusion d'un journaliste fluorescent en direct, permettant l'isolement des IFM au début du pupal. Nous utilisons normalement Mef2-GAL459 conduite soit UAS-CD8::GFP ou UAS-GFP::Gma60. Cela permet l'étiquetage différentiel de l'IFM (les muscles de vol sont plus fortement étiquetés et de forme différente que les autres muscles pupal) ainsi que la performance des manipulations basées sur GAL4-UAS, par exemple des expériences de sauvetage ou d'ARNi. Il est également possible de combiner Mef2-GAL4 avec baignoire-GAL80ts pour éviter la létalité précoce associée à l'ARNi ou avec UAS-Dcr2 pour augmenter l'efficacité de l'ARNi40.
Il ya d'autres pilotes GAL4 ou GFP-lignes disponibles qui varient dans la spécificité de type musculaire, le modèle d'expression temporelle, et la force du conducteur19,61 qui peuvent être utilisés au lieu de Mef2-GAL4. Par exemple, Act88F-GAL4 est d'abord exprimé autour de 24 h APF, de sorte qu'il ne peut pas être utilisé pour des délais plus tôt; cependant, il étiquette fortement IFM et peut être utile pour éviter la létalité précoce RNAi-associée. Lui-GFP ou Act88F-GFP étiquette IFM, encore une fois avec des restrictions temporelles, mais ils évitent la dépendance GAL4 de l'expression des marqueurs et peuvent être utiles en combinaison avec un fond mutant d'intérêt. Des listes d'autres lignes de marqueurs possibles sont disponibles19. Il convient également de noter que l'utilisation de transgènes et le système GAL4/UAS peut causer des artefacts d'expression génique, il est donc important d'utiliser des contrôles appropriés, par exemple la ligne de conducteur franchie à la souche de fond de type sauvage, de sorte que ces artefacts sont vraisemblablement la même chose dans tous les échantillons.
Avec la vidéo d'accompagnement, ce protocole détaillé vise à rendre la dissection pupal IFM plus accessible et de promouvoir l'utilisation d'approches omics pour étudier le développement musculaire. Le couplage de la puissance de la génétique de Drosophila et de la biologie cellulaire avec la biochimie et les essais d'omics accessibles par l'IFM disséqué a le potentiel de faire progresser la compréhension mécaniste de la myogenèse et de la fonction musculaire. De futures études liant les observations au niveau des systèmes de la régulation du transcriptome et du protéome aux extrants métaboliques et fonctionnels fourniront une meilleure compréhension du développement spécifique de type musculaire et de la pathogénie des troubles musculaires.

Les technologies modernes d'omique fournissent des perspicacités importantes dans le développement de muscle et les mécanismes sous-jacents aux désordres humains de muscle. Par exemple, l'analyse des données transcriptomiques combinée à la vérification génétique et biochimique dans les modèles animaux a révélé que la perte du facteur dépissage RBM20 provoque une cardiomyopathie dilatée due à la régulation d'un réseau cible de plus de 30 sarcomères gènes précédemment associés à une maladie cardiaque, y compris la titine1,2,3.
Dans un deuxième exemple, des études de la culture cellulaire, des modèles animaux, et les patients humains ont montré que la dystrophie myotonique est causée par une perturbation de la régulation de l'ARN due à la séquestration de Muscleblind (MBNL) et l'upregulation de CELF14,5. La dynamique inter-réglementaire et temporelle entre MBNL et CELF1 (également appelé CUGBP1 ou Bruno-Like 2) aide à expliquer les modèles d'épissage embryonnaire persistants dans les patients myotoniques de dystrophie. En outre, le vaste réseau de cibles mal réglementées aide à expliquer la nature complexe de la maladie4,6,7,8. La majorité de ces études utilisent des approches omics dans les organismes modèles génétiques pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la maladie musculaire humaine. En outre, ils soulignent l'importance de comprendre d'abord l'expression génétique spécifique temporelle et tissulaire, la modification des protéines et les modèles métaboliques dans les muscles sains pour comprendre les altérations des muscles malades ou vieillissants.
Drosophila melanogaster est un autre organisme modèle génétique bien établi. La structure du sarcoque ainsi que les composants individuels de sarcore sont fortement conservés des mouches aux vertébrés4,9,10, et les muscles de vol indirects (IFM) sont devenus un modèle puissant à étudier multiples aspects du développement musculaire11,12. Tout d'abord, les muscles de vol fibrillaire sont fonctionnellement et morphologiquement distincts des muscles tubulaires du corps11,13, permettant l'étude des mécanismes de développement spécifiques de type musculaire. Des facteurs de transcription, y compris Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd), et Homothorax (Hth)15 ont été identifiés comme régulateurs du destin fibrillaire. En outre, en aval de Salm, l'homolog CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programme d'épissage spécifique au fibrillaire16,17.
Deuxièmement, les IFM sont un modèle important pour comprendre le processus de myogenèse elle-même, de la fusion myoblast et l'attachement myotube à la myofibrillogénèse et la maturation sarcomere9,18,19. Troisièmement, la génétique de Drosophila permet l'étude des contributions par les protéines individuelles, les domaines de protéine, et les isoformes de protéine à la formation de sarcome, à la fonction, et aux propriétés biophysiques20,21,22 ,23. Enfin, des modèles IFM ont été développés pour l'étude de multiples troubles musculaires humains, tels que la dystrophie myotonique, myopathies myofibrillaires, troubles dégénératifs musculaires, actinopathies, etc.24,25,26 ,27, et ont fourni des informations importantes sur les mécanismes de la maladie et les thérapies potentielles28,29,30. Ainsi, Drosophila est un modèle utile pour répondre à de nombreuses questions ouvertes dans le domaine de la myogenèse, y compris les mécanismes de la transcription spécifique de type musculaire, l'épissage, et la régulation de la chromatine, ainsi que le rôle du métabolisme dans le développement musculaire. L'application des technologies modernes d'omique, en particulier en combinaison avec la grande variété d'essais génétiques, biochimiques et biologiques cellulaires disponibles dans Drosophila, a le potentiel de faire progresser considérablement la compréhension des muscles développement, le vieillissement et la maladie.
IfMs sont les plus grands muscles de la mouche, couvrant près de 1 mm sur toute la longueur du thorax chez les adultes31,32. Cependant, cette petite taille génère le défi d'obtenir suffisamment d'échantillons pour appliquer les technologies d'omique dans Drosophila d'une manière spécifique de type tissu. En outre, les IFM font partie de la musculature adulte qui se forme pendant les stades pupal. Les myoblastes fusionnent pour former des myotubes, qui se fixent aux tendons autour de 24 h après la formation de puparium (APF) et subissent une étape de compactage nécessaire pour initier la myofibrillogénèse autour de 30 h APF (Figure 1A-D)18,33, 34.
Les myofibres se développent alors pour s'étendre sur toute la longueur du thorax, avec des myofibrils subissant une phase initiale de croissance concentrée sur l'addition de sarcoque jusqu'à environ 48 h APF, puis la transition à une phase de maturation, dans laquelle les sarcoques se développent dans la longueur et la largeur et sont remodelé pour établir l'extensible-activation par 72 h APF (Figure 1A-D)32,35. L'arrivée de la maturation des fibres est au moins partiellement contrôlée par Salm et E2F32,36,37, et plusieurs isoformes de protéines sarques spécifiques à l'IFM dont l'épissage est contrôlé par Bru1 sont incorporés au cours de cette phase16,17. Les mouches matures s'éclosent de 90 à 100 h APF. Cela signifie que pour étudier le développement musculaire, IFM doit être isolé avec suffisamment de quantité, de qualité et de pureté à partir de plusieurs points de temps pupal pour faciliter l'analyse en utilisant des approches omics.
Plusieurs protocoles pour la dissection de l'IFM ont été publiés. Bien que ces protocoles fonctionnent bien pour leurs applications prévues, aucun n'est idéal pour les approches omics. Les protocoles qui préservent la morphologie d'IFM pour l'immunofluorescence des IFM pupal et adultes19,isolent les fibres IFM pour l'évaluation mécanique31,ou utilisent la microdissection de l'IFM pupal des cryosections38 sont trop spécialisés et le temps et main-d'œuvre pour obtenir raisonnablement des quantités suffisantes de tissu IFM pour les applications d'omics. D'autres protocoles ont été développés pour la dissection rapide de l'IFM38,39, ne s'appliquent donc pas aux stades pupal, et utilisent des tampons qui ne sont pas idéaux ou peuvent être incompatibles avec, par exemple, l'isolement de l'ARN. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles approches pour isoler les IFM pupal pour les applications de biochimie ou d'omique.
Ici, nous présentons un protocole pour la dissection de l'IFM pendant les stades pupal qui a été utilisé avec succès pour l'analyse de l'ARNm-Seq de 16 h APF jusqu'aux stades adultes16,32. Le protocole utilise une étiquette de protéine fluorescente verte (GFP) pour identifier les IFM à tous les stades du développement pupal et adulte, permettant la dissection vivante sous un microscope fluorescent de dissection. L'approche est moins laborieuse, avec un débit plus élevé que les protocoles de dissection IFM existants. Cela permet l'isolement rapide et la cryoconservation des échantillons, générant suffisamment de matériel après plusieurs tours de dissection pour les approches omics ainsi que pour la transcription inverse standard réaction en chaîne de polymérase (RT-PCR) ou de l'ouest de la perte.
Nous présentons le protocole en deux parties, démontrant comment disséquer rapidement les IFM avant 48 h APF (pendant la métamorphose précoce, lorsque les attachements IFM sont plus ténus) et après 48 h APF (lorsque le plan du corps pupal et les pièces jointes IFM sont bien définis). Nous démontrons que nous pouvons isoler l'ARN de haute qualité des IFM disséqués à tout moment et présenter des données sur différentes approches de l'isolement de l'ARN et de la transcription inversée. Enfin, nous démontrons l'application du protocole de dissection à l'ARNm-Seq, à la spectrométrie de masse et à la RT-PCR en utilisant l'homologramme CELF1 Bruno1 à titre d'exemple. Nous montrons une mauvaise expression des isoformes de protéine de sarcoque dans les données protéomiques de Bruno1 mutant IFM et examinons la régulation de Bruno1 de l'événement d'épissage C-terminal de la chaîne lourde de Myosin (Mhc). Ces résultats illustrent comment les données d'omique peuvent fournir une compréhension plus profonde des phénomènes biologiques, complétant des expériences génétiques et biochimiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Le muscle de vol de Drosophila est un modèle puissant pour étudier divers processus tels que la régulation transcriptionnelle, l'épissage alternatif, le métabolisme, et la mécanobiologie, qui influencent tous le développement de muscle et la myofibrillogenesis. Les données d'Omics, telles que celles générées par la spectrométrie de masse ou le séquençage profond, peuvent fournir des aperçus mécanistes importants dans ces processus biologiques. Pour de telles approches, il est utile d'analyser des échantillons spécifiques aux tissus afin d'augmenter à la fois la sélectivité et la spécificité des empreintes digitales des mics. Ici nous présentons un protocole pour la dissection du muscle de vol fluorescent-étiqueté des chiots vivants pour produire des échantillons fortement enrichis de muscle pour des applications d'omics. Nous décrivons d'abord comment disséquer les muscles de vol aux premiers stades pupal (lt;48 h après la formation de puparium [APF]), lorsque les muscles sont discernables par l'étiquetage des protéines fluorescentes vertes (GFP). Nous décrivons ensuite comment disséquer les muscles des puupae tardives (aPF) ou des adultes, lorsque les muscles se distinguent sous un microscope disséquant. Le protocole vidéo d'accompagnement rendra ces dissections techniquement exigeantes plus accessibles aux communautés de recherche sur les muscles et la drosophile. Pour les applications d'ARN, nous éduquons la quantité et la qualité de l'ARN qui peut être isolé à différents moments et avec des approches différentes. Nous montrons en outre que Bruno1 (Bru1) est nécessaire pour un changement temporel dans la chaîne lourde de myosine (Mhc) épissage, démontrant que les muscles disséqués peuvent être utilisés pour l'ARNm-Seq, la spectrométrie de masse, et la transcription inverse polymérase réaction en chaîne (RT-PCR) Applications. Ce protocole de dissection aidera à promouvoir des analyses d'omics spécifiques aux tissus et peut être généralement appliqué pour étudier de multiples aspects biologiques de la myogenèse.

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Le muscle de vol de Drosophila est un modèle puissant pour étudier la régulation transcriptionnelle, l'épissage alternatif, le métabolisme, et la mécanobiologie. Nous présentons un protocole pour la dissection du muscle de vol fluorescent-étiqueté des chiots vivants pour produire des échantillons fortement enrichis idéaux pour la protéomique et le séquençage profond. Ces échantillons peuvent offrir des aperçus mécanistes importants dans divers aspects du développement musculaire.

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Le protocole facilite la dissection du muscle de vol indirect étiqueté GFP de Drosophila à divers moments pendant le développement de pupes pour évaluer des changements dans l’expression de gène et de protéine. En utilisant ces techniques, un échantillon élevé enrichi de muscle de vol avec la dégradation minimale de protéine d’ARN peut être réalisé qui convient à RT-PCR, tache occidentale, ou approches omiques. Ces dissections spécialisées nécessitent de la pratique et des compétences, mais le nombre de pupes qui peuvent être disséquées et la qualité des échantillons s’améliorent avec l’expérience.La démonstration visuelle de cette dissection est essentielle pour déterminer comment distinguer les muscles de vol des tissus non musculaires et faciliter l’isolement rapide des muscles de vol des spécimens pupals. Pour mettre en scène les pupes, utilisez un pinceau mouillé pour recueillir et transférer les préppes dans une boîte de Pétri de 60 millimètres, et faire le sexe des nymphes au microscope binoculaire. Les mâles sont identifiés par la présence de testicules, qui apparaissent comme des globes translucides sur les pupes par ailleurs opaques.Après avoir étiqueté le plat avec l’heure, la date et le génotype des mouches, vieillir les pupes dans un incubateur de 25 à 27 degrés Celsius jusqu’au stade approprié. Pour la dissection IFM avant 48 H APF, utilisez un pinceau mouillé pour transférer les nymphes correctement mises en scène dans un plat de dissection noir d’environ 2/3 rempli de PBS réfrigéré. Sous le microscope à disséquer fluorescent, utilisez un 5 forceps pour pousser l’une des nymphes au fond du plat de dissection noir.Ajustez le zoom et concentrez-vous au microscope jusqu’à ce que les pupes puissent être clairement visualisées. À l’aide d’une paire de forceps pour saisir l’antérieur des pupes, piquer les nymphes avec une seule pointe d’une deuxième paire de forceps, légèrement hors-centre dans l’abdomen, juste derrière le thorax. Utilisez la première paire de forceps pour enlever la moitié antérieure du boîtier pupal, et pour pincer les pupes exposées juste derrière le thorax pour séparer l’abdomen du thorax.Ensuite, pressez doucement la partie antérieure du thorax pour exposer les MCI étiquetés fluorescents. Ensuite, utilisez les forceps pour jeter la carcasse restante de l’autre côté du plat, et disséquez les nymphes suivantes de la même manière. Lorsque toutes les pupes ont été disséquées, utilisez les forceps pour recueillir les fibres IFM, et d’organiser les fibres en un tas au fond du plat de dissecting noir.Utilisez les forceps pour pousser les débris hors du champ de vision, et enlever tous les muscles non-IFM, graisse, cuticules, ou d’autres tissus indésirables des échantillons. Ensuite, utilisez une pointe de pipette coupée pour transférer le tas d’IFMs dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS réfrigéré. Pour la dissection IFM après 48 H APF, utilisez un pinceau légèrement mouillé pour transférer les pupes mises en scène sur une bande de ruban adhésif à double face montée sur une lame de microscope.Orientez les pupes dans une ligne, côté ventral vers le bas, et antérieur vers le bas de la glissière. Lorsque toutes les nymphes ont été placées, utilisez des forceps pour taquiner et ouvrir le premier boîtier pupal au-dessus des spiracles antérieurs, et faites glisser doucement une paire de forceps dorsalement, vers le postérieur, coupant le boîtier pupal au fur et à mesure que les forceps se déplacent. Libérez les pupes du boîtier ouvert, et transférez immédiatement les pupes à une goutte de PBS sur une deuxième diapositive de microscope.Lorsque tous les pupes sont libérés, utilisez de fines ciseaux pour couper l’abdomen des pupes loin du thorax, et pousser les abdomens dans un tas séparé. Lorsque tous les thoraxes ont été enlevés, utilisez un morceau de papier de soie pour enlever la majorité du PBS et le tas d’abdomens. Ajouter une goutte de PBS frais et réfrigéré aux thorax restants, avant d’utiliser les ciseaux pour couper de la tête le long de l’axe longitudinal du corps en un seul mouvement pour diviser le thorax en deux.Lorsque toutes les nymphes ont été disséquées, utilisez les 5 forceps pour sélectionner l’une des hémisections, et insérez doucement les pointes d’un forceps au-dessus et au-dessous du milieu des MSI. En tenant la première paire de forceps immobiles, utilisez de fines ciseaux pour couper une extrémité de l’IFM loin de la cuticule et des tendons, avant de faire pivoter les pupes à 180 degrés, pour permettre à l’autre extrémité de l’IFM d’être coupée libre de la cuticule et des tendons. Utilisez des forceps pour transférer le faisceau IFM du thorax au bord de la bulle PBS, en utilisant la tension de l’eau pour maintenir le faisceau en place.Ensuite, poussez la carcasse de l’autre côté de la glissière et disséquez le reste des IFM de la même manière. Lorsque tous les MSI ont été prélevés, utilisez les 5 forceps pour enlever les fragments de muscle ou de cuticule qui pourraient avoir trouvé leur chemin dans les échantillons. Ensuite, utilisez la tension de l’eau pour capturer doucement les MFI disséqués entre une paire de forceps, et placez les IFM dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS réfrigérés.Les données de séquençage de l’ARNm provenant des IFM BRUNO1 IR montrent des changements d’expression au niveau de l’unité génétique par rapport aux données de séquençage des types sauvages. En utilisant la spectrométrie de masse protéome entière sur les MCI disséqués, une régulation similaire est observée aux niveaux des protéines et des isoformes protéiques. Après l’insertion d’une ligne de piège protéique dans l’intron final du Mhc, l’incorporation de la protéine étiquetée GFP peut être observée en IFM sous forme de deux points de chaque côté de la ligne M à 90 H APF, tandis que dans le tissu musculaire des jambes, le signal GFP peut être observé uniformément à travers la ligne M du sarcome.Lors de l’utilisation de RT-PCR sur l’IFM disséqué, un commutateur isoforme Mhc de l’événement exon 34 à 37 étiqueté GFP à l’événement exon non étiqueté 34 à 35, peut être détecté entre 30 et 48 heures après la formation de puparium à 27 degrés Celsius. À partir des données de séquençage de l’ARNm, les tissus musculaires des jambes et des sauts expriment les trois isoformes du Mhc, maintenant l’expression de l’isoforme étiqueté GFP dans le muscle mature. Le mutant majeur de Spalt et LE BRUNO1 IR-IFM, n’ont pas réussi à désactiver l’expression de l’isoforme de Mhc gfp-étiqueté pendant qu’ils se développent, ayant pour résultat un profil isoforme d’expression ressemblant à celui du tissu de muscle de jambe et de saut.N’oubliez pas que les dissections doivent être effectuées en moins de 30 minutes pour prévenir la dégradation de l’ARN. Et, pour prendre soin de limiter la contamination par d’autres types de cellules. Cette méthode génère des échantillons enrichis en IFM adaptés aux approches biochimiques comme la RT-PCR, ou ballonnement occidental, ainsi que des approches de style omic, comme la spectrométrie de masse, le séquençage à haut débit, la capture de conformation de la chromatine et la métabolomique.Ces dissections peuvent compléter les puissantes approches génétiques de Drosophila par des données au niveau des systèmes pour étudier les mécanismes fondamentaux du développement et de la régulation des gènes.

Research

JoVE Journal

Genetics

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