Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Wir danken Andreas Ladurner und Frank Schnorrer für die großzügige Unterstützung. Wir danken Sandra Esser für die hervorragende technische Unterstützung und Akanksha Roy für die Generierung der Massenspektrometriedaten. Wir erkennen die Bloomington und Vienna Stock Center für die Bereitstellung von Fliegen an. Wir danken der Core Facility Bioimaging für die Hilfe bei der konfokalen Bildgebung und dem Zentrallabor für Proteinanalytik für die Analyse von Massenspektrometrieproben, beide im LMU Biomedical Center (Martinsried, DE). Unterstützt wurden unsere Arbeiten von der Deutschen Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), dem Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) an der Ludwig-Maximilians-Universität München (MLS), der Frederich-Bauer Stiftung (MLS) und dem International Max Planck Research School (EN).

1. Inszenierung der Pupae
<ol><li>Heben Sie Fliegen des gewünschten Genotyps in Flaschen an (Abbildung 1E). Entweder machen Sie einen frischen Flip des Sezierens oder setzen Sie ein Kreuz mit mindestens 20 weiblichen Jungfraufliegen. Halten Sie Flaschen, bis die Fliegen beginnen zu verpupieren.</li>
	<li>Vorpupae mit einem benetzten Pinsel sammeln und in einer 60 mm Petrischale auf benetztes Filterpapier übertragen (Abbildung 1F).</li>
	<li>Sex die Pupae, sammeln das entsprechende Geschlecht für das Experiment (Abbildung 1G). Männchen werden durch das Vorhandensein von Hoden identifiziert, die als durchscheinende Kugeln in der ansonsten undurchsichtigen Pupa erscheinen.</li>
	<li>Beschriften Sie die Petrischale mit der Uhrzeit, dem Datum und dem Genotyp, und altern Sie dann die Welpen auf das gewünschte Stadium(Abbildung 1H). HINWEIS: Bewahren Sie Kreuze/Bestände und Alterspupas in einem temperaturgeregelten Inkubator (d. h. 25 °C oder 27 °C für RNAi-Kreuze), da erhöhte Gal4-Aktivität bei höheren Temperaturen die Knock-down-Effizienz erhöht40). Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit ausreichend hoch ist, damit die Welpen nicht austrocknen, wenn sie mehrere Tage altern.</li>
</ol>2. IFM-Sektion vor 48 h APF
<ol><li>Montieren Sie die notwendige Ausrüstung, darunter zwei #5 Biologie-Grade-Zangen, eine Pipette, Pipettenspitzen, Trockeneis und (für RNA-Proben) Isolationsreagenz (siehe Tabelle der Materialien). Darüber hinaus sind kalte schwarze Sezierende (siehe Tabelle der Materialien), 1x Phosphat-gepufferter Saline-Puffer (PBS) und 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre auf Eis.</li>
	<li>Mit einem benetzten Pinsel, übertragen inszenierte Pupae auf eine schwarze Sesektierungschale gefüllt etwa zwei Drittel mit kalten 1x PBS (Abbildung 2A,B). Wechseln Sie zu einem fluoreszierenden Sezierendes Mikroskop. HINWEIS: Verwenden Sie so viele Pupae, wie innerhalb eines 30-min-Zeitfensters seziert werden können. Je nach Erfahrung reicht dies von 3-15 Welpen. Siehe Ergänzende Methoden zur Diskussion über Alternativen zu schwarzen Sezieren von Gerichten.</li>
	<li>Mit #5 Zange, drücken Sie einen der Pupas auf den Boden einer schwarzen Sezieren schale und passen Sie den Mikroskop-Zoom und Fokus, um deutlich zu sehen, die Pupa (Abbildung 2C).</li>
	<li>Greifen Sie das Vorderteil der Pupa mit einer Zange (Abbildung 2D), dann schlagen Sie die Pupae mit einer einzigen Spitze der anderen Zange leicht aus der Mitte in den Bauch, direkt hinter dem Thorax. Dadurch wird die Pupa an Ort und Stelle und verhindert, dass die IFMs in den Bauch bewegen (Abbildung 2E). HINWEIS: Beginnen Sie, die Länge der Sezierung von diesem Punkt zu timing, sobald die Pupalintegrität gestört ist. Verwenden Sie eine definierte Sezierender Länge (z. B. 20–30 min), um den Muskeltod und die damit verbundenen transkriptomischen und proteomischen Veränderungen zu minimieren. Sezieren Sie so viele Fliegen wie möglich in dieser Zeit.</li>
	<li>Entfernen Sie mit den ersten Zangen die vordere Hälfte des Pupalgehäuses (Abbildung 2F).</li>
	<li>Verwenden Sie die gleichen Zangen, um die exponierten Pupas direkt hinter dem Thorax zu kneifen, und trennen Sie den Bauch vom Thorax (Abbildung 2G).</li>
	<li>Mit den Zangen den vorderen Teil des Thorax (für <35 h APF) vorsichtig drücken oder den Thorax öffnen, um die fluoreszierend beschrifteten IFMs(Abbildung 2H)freizulegen. IFMs lösen sich leicht von der Epidermis, da Sehnenbefestigungen zu frühen Zeitpunkten zerbrechlich sind. Entsorgen Sie den verbleibenden Kadaver mit Zangen, um ihn auf die gegenüberliegende Seite der Schale zu schieben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.7, sezieren Sie zusätzliche Welpen.</li>
	<li>Sammeln Sie die IFM-Fasern mit Zangen und organisieren Sie sie in einem Stapel am Boden der schwarzen SezierenSchale (Abbildung 2I,J). Entfernen Sie alle Trümmer, indem Sie sie mit Zangen aus dem Sichtfeld schieben. HINWEIS: Mit der Praxis können Zangenspitzen in die Nähe gebracht werden, ohne sich gegenseitig zu berühren. Diese Technik kann verwendet werden, um IFMs lose zu packen, ohne sie zu zerstören. Alternative Methoden umfassen das sanfte Drücken oder Heben der IFMs mit einer einzigen Spitze oder vollständig geschlossenen Zange oder die Einnahme von Fett oder anderem Gewebe mit dem IFM und das Entfernen des Fettes, wie in Schritt 2.10 beschrieben.</li>
	<li>Qualitätskontrolle der IFM-Muskelprobe, mit den Zangen, um Nicht-IFM-Muskeln, Fett, Nagelhaut, etc. aus der Probe zu entfernen (Abbildung 2K,L). HINWEIS: Mit Mef2-Gal4 ist IFM zu frühen Zeitpunkten stärker als andere Muskeltypen gekennzeichnet(Abbildung 2K,K'),was die Entfernung von Sprungmuskel- und Larvenmuskeln auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität und Muskelform ermöglicht. Fett und Nagelhautgewebe sehen anders aus und sind nicht durch ein muskelspezifisches Fluoreszenzetikett gekennzeichnet (Abbildung 2K,K'). Weitere Gal4-Zeilen mit der Bezeichnung IFM finden Sie im Diskussionsabschnitt.</li>
	<li>Übertragen Sie den IFMs-Stapel mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das mit 250 l gekühlten 1x PBS gefüllt ist (Abbildung 2M-O). Fahren Sie sofort mit Abschnitt 4 fort. HINWEIS: IFM-Proben können einfach durch Kleben an der Seite der Pipettenspitze verloren gehen. Pipettierpuffer nach oben und unten mehrmals vor dem Sammeln von IFMs können Standardspitzen weniger klebrig machen, und silikonisierte oder Perfluoralkoxy (PFA) Spitzen (siehe Tabelle der Materialien) mit niedrigeren Oberflächenspannungen können helfen, Probenverlust zu verhindern.</li>
</ol>3. IFM-Sektion nach 48 h APF
<ol><li>Montieren Sie die notwendigen Geräte, darunter zwei #5 Biologie-Grade-Zangen, feine Schere, Standard-Glasmikroskop-Dias, Doppel-Stick-Band, Pipette, Pipettenspitzen, Trockeneis und (für RNA-Anwendungen) Isolationsreagenz (siehe Tabelle der Materialien). Die 1x PBS und Mikrozentrifugenrohre auf Eis abkühlen.</li>
	<li>Übertragen Sie die inszenierten Welpen mit einem leicht benetzten Pinsel auf einen Streifen doppelseitiger Klebebande, die auf einem Mikroskopschlitten montiert sind (Abbildung 3A). Platzieren Sie die Pupae in einer Linie, die in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet ist (ventral nach unten und vordernach zum unteren Rand der Folie). HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel Wasser auf dem Pinsel oder Filter zu verwenden, oder die Pupae wird nicht gut kleben. Wenn Die Welpen nicht kleben, trocknen Sie sie, indem Sie sie zuerst in einen Trockenenoder oder Gewebepapier überführen. Montieren Sie so viele Pupae, wie innerhalb eines 30 min Zeitfensters seziert werden können, idealerweise 10 Pupae.</li>
	<li>Entfernen Sie die Pupa aus dem Pupal-Gehäuse. Verwenden Sie Zangen, um auseinander zu necken und öffnen Sie das Pupalgehäuse über den vorderen Spiracles (Abbildung 3B).</li>
	<li>Schieben Sie vorsichtig ein Paar Zangen dorsal in Richtung des Hinterteils, schneiden Sie das Pupal-Gehäuse, wenn sich die Zangen bewegen (Abbildung 3B'). Achten Sie darauf, die zugrunde liegende Pupa nicht zu brechen. Befreien Sie den Pupa aus dem geöffneten Gehäuse und übertragen Sie ihn sofort auf einen Tropfen von 1x PBS auf einem zweiten Mikroskopschlitten (Abbildung 3B",C).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4 für alle Welpen in der Linie, und stellen Sie dann das Doppelknüppel-Dia beiseite.</li>
	<li>Mit der feinen Schere den Bauch der Pupa vom Thorax wegschneiden und in einen separaten Haufen schieben (Abbildung 3D,D'). Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Welpen. HINWEIS: Beginnen Sie mit dem Timing der Sezieren mit Schritt 3.6, sobald die Pupalintegrität gestört ist. Sezieren Sie so viele Fliegen wie möglich in 20-30 min, um den Zelltod und die damit verbundenen transkriptomischen und proteomischen Veränderungen zu verhindern. Bei der Sezieren 1 d Erwachsene oder >90 h Pupae, ist es oft bequem für spätere Schritte, um zusätzlich den Kopf mit der feinen Schere zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem Tissuepapier den Großteil der 1x PBS (in der Regel trüb mit hängendem Fett) sowie den Bauchstapel(Abbildung 3E). Fügen Sie einen Tropfen frische, gekühlte 1x PBS zu den verbleibenden Thoraxen hinzu.</li>
	<li>Verwenden Sie die Schere, um den Thorax in die Hälfte zu schneiden (Abbildung 3F,F'),indem Sie vom Kopf die Längskörperachse in einer einzigen Bewegung herunterschneiden. Wenn der Kopf entfernt wurde, legen Sie zunächst die Schere ein, an der der Kopf befestigt war, und schneiden Sie die obere Hälfte des Thorax längs zwischen den IFMs. Schneiden Sie dann die ventrale Seite des Thorax mit einem zweiten Schnitt in der gleichen Ausrichtung.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8, damit alle Welpen seziert werden, wodurch ein Haufen Thoraxhalbsektionen in der Nähe der Mitte der Rutsche erzeugt wird. Stellen Sie sicher, dass genügend gekühlte 1x PBS auf der Rutsche vorhanden sind, damit die Hemisections nicht austrocknen. HINWEIS: Nach 48 h APF sind IFMs groß genug, um unter einem Standard-Sezierendes Mikroskop für das geschulte Auge sichtbar zu sein. An dieser Stelle des Protokolls können Muskeln mit einem fluoreszierenden Etikett in einen fluoreszierenden Sezierenden Bereich verschoben werden, um bei der IFM-Identifikation oder zu Trainingszwecken zu helfen, aber dies ist nicht notwendig.</li>
	<li>Sezieren Sie die IFMs aus dem Thorax. Isolieren Sie einen der Hemisektionen mit den #5 Zangen (Abbildung 3G,H). Legen Sie vorsichtig die Spitzen einer Zange über und unter der Mitte der IFMs ein (Abbildung 3G',H'). Während Sie die ersten Zangen still halten, verwenden Sie eine feine Schere, um ein Ende des IFM von der Nagelhaut und den Sehnen wegzuschneiden. Dann schneiden Sie das andere Ende des IFM frei von der Nagelhaut (Abbildung 3G'',H''). HINWEIS: Abhängig von der Ausrichtung des Thorax nach dem ersten IFM-Schnitt ist es sinnvoll, den Thorax um 180° zu drehen, damit der zweite IFM-Schnitt einfacher durchzuführen ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das IFM-Bundle mit Zangen aus dem Thorax (Abbildung 3G''',H'''), und übertragen Sie es an den Rand der PBS-Blase, um es mit Wasserspannung an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 3I). Schieben Sie den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Rutsche. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Thorax-Hemisektionen, wodurch eine Sammlung von sezierten IFMs generiert wird. HINWEIS: Wenn die IFMs nicht in einem ordentlichen Stapel bleiben, entfernen Sie einige der 1x PBS mit einem Gewebe. Achten Sie darauf, dass nicht alle PBS verdampfen, und stellen Sie sicher, dass die sezierten IFMs und Hemithoraxes durch Puffer abgedeckt bleiben.</li>
	<li>Nach der Sezieren aller IFMs führen Sie schnell eine Qualitätskontrolle für den sezierten Muskel durch. Entfernen Sie mit #5 Zangen alle Sprungmuskel- oder Nagelfragmente, die ihren Weg in die Probe gefunden haben könnten (Abbildung 3J-K''). HINWEIS: Sprungmuskel erscheint anders als IFM. Wenn Mef2-Gal4 beschriftet Muskel unter Fluoreszenz, Sprungmuskel hat eine schwächere Fluoreszenz und eine andere Form und Textur. Bei normalem Licht erscheint es fast durchscheinend, während die IFMs ein undurchsichtiges, milchiges Gelb sind (Abbildung 3J-J'',K).</li>
	<li>Mit Wasserspannung, erfassen (aber nicht squish) die sezierten IFMs zwischen einem Paar Zangen (Abbildung 3L). Übertragen Sie die IFMs in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das mit 250 l gekühlten 1x PBS vorgefüllt ist (Abbildung 3M). Fahren Sie sofort mit Abschnitt 4 fort. HINWEIS: Wenn Zangenspitzen in einander in die Nähe gebracht und aus einer Pufferlösung gehoben werden, führt die Wasserspannung dazu, dass eine Pufferblase zwischen den Zangenspitzen eingefangen wird. Wenn IFMs auch in dieser Blase vorhanden sind, können sie aus der Lösung gehoben und einfach in eine andere puffergefüllte Buchse übertragen werden. Es ist wichtig, die Zange zu drücken, um die Spitzen in die Nähe zu bringen, ohne sich gegenseitig zu berühren, um zu vermeiden, dass das in der Pufferblase gefangene Gewebe mazeriert wird.</li>
</ol>4. Pellet und Konservieren der IFM-Probe
<ol><li>Pellet die IFMs durch Zentrifugieren des 1,5 ml Mikrozentrifugenrohres für 3–5 min bei 2.000 x g in einer Tischzentrifuge (Abbildung 4A,B).</li>
	<li>Entfernen Sie den Puffer mit einer Pipettenspitze (Abbildung 4C).
</li>
	<li>Für RNA-Anwendungen können Sie das IFM-Pellet in 50–100 l des gewünschten RNA-Isolationspuffers aussetzen (siehe Materialtabelle, Abbildung 4D). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 4.4 fort. HINWEIS: IFMs können nach Schritt 4.2 für Massenspektrometriepräparate oder Isolierung von RNA mit kommerziellen Kits trockengefroren werden (siehe repräsentative Ergebnisse). Bei RNA-Anwendungen werden bessere Ergebnisse erzielt, indem das IFM-Pellet im Isolationspuffer sofort wieder ausgesetzt und eingefroren wird.</li>
	<li>Probe auf Trockeneis einfrieren oder in flüssigem Stickstoff einfrieren (Abbildung 4E). Bei -80 °C lagern, bis sie für nachfolgende Schritte in der Probenvorbereitung für die nachgelagerte Analyse bereit sind. HINWEIS: Nach der Kryokonservierung können Proben mehrere Monate gelagert werden, bevor sie für die nachgelagerte Untersuchung verarbeitet werden.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Protokoll stellen wir die grundlegende Technik zur Sezieren von Drosophila-IFMs aus früh- und spätstadiumischen Pupas zur nachgelagerten Isolierung von Protein, DNA, RNA oder anderen Makromolekülen vor. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um IFM von erwachsenen Fliegen zu sezieren. Wir demonstrieren den Nutzen unseres Sezierprotokolls für mRNA-Seq-, Proteomik- und RT-PCR-Anwendungen. Mit der kontinuierlichen Verbesserung der omics-Technologien, um die Analyse von Proben mit weniger Ausgangsmaterial und niedrigeren Eingangskonzentrationen zu ermöglichen, werden diese Sezierungen wahrscheinlich für viele zusätzliche Anwendungen wertvoll werden. Da IFMs ein etabliertes Modell für humane Myopathien4,24 und muskelspezifische entwicklung9,12, wir sehen, zum Beispiel, IFM-angereicherte Metabolomik, Untersuchungen der Chromatin-Konformation über 3C oder 4C, Spleißnetzauswertung über CLiP-Wechselwirkungen oder Phospho-Proteomik der Myofibrillogenese.
Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass diese Sezierungen eine Probe produzieren, die für IFM angereichert ist, anstatt eine reine IFM-Probe. Dies ist aufgrund der motorischen Neuroneninnervation, Sehnenanhaftungen und trachealen Invasion von Muskelfasern unvermeidbar. Die Bioinformatik-Analyse kann verwendet werden, um IFM-angereicherte Gene oder Proteine zu identifizieren, aber weitere Experimente sind erforderlich, um zu zeigen, dass sie tatsächlich IFM-spezifisch sind. Die Probenreinheit kann mit veröffentlichten gewebespezifischen Markern wie Stripe45 (Tendon), Act79B4,44 (Tubularmuskel), Act88F15 (IFM) oder syb46 (neuronal spezifisch) untersucht werden. Es kann möglich sein, solche Marker zu verwenden, um Datensätze auf den IFM-spezifischen Inhalt zu normalisieren, aber Benutzer werden darauf hingewiesen, dass zeitliche Veränderungen in der Expression von Genen, die für die Normalisierung verwendet werden, zum Beispiel von IFM-spezifischen Genen oder Tubulin, einen solchen Ansatz beeinflussen können.
Genetisch kodierte gewebespezifische Etikettierungsmethoden, z. B. EC-Tagging47,48 oder PABP-Kennzeichnung49,50 zur Isolierung von RNA wurden in den letzten Jahren entwickelt, was dazu beitragen kann, eine gewebespezifische RNA-Probe. EC-Tagging erfordert jedoch eine konstante Fütterung der Fliegen47 und ist daher in den Pupalstadien nicht anwendbar. Die Empfindlichkeit und Vollständigkeit von PABP-markierten Transkriptomen kann Einschränkungenhaben 51. FACS-Ansätze zur Isolierung einzelner Muskelfasern werden durch die große Größe und Synzytialität von IFMs erschwert. INTACT52,53 Stil Ansätze können angewendet werden, um bestimmte subzelluläre Kompartimente von IFMs zu isolieren, die sich als nützlich für die Isolierung reinen Populationen von IFM-Kernen oder Mitochondrien erweisen können. Manuelle Sezierungen sind nach wie vor der aktuelle Standard, um intaktes IFM-Gewebe für die meisten nachgelagerten Anwendungen zu erhalten.
Die Probenqualität hängt von mehreren kritischen Schritten im Sezierprozess ab. Die Sezierungen sind technisch anspruchsvoll, wobei die Seziergeschwindigkeit und die Probenreinheit mit der Erfahrung zunehmen. Das Sezieren für kurze Zeit (20–30 min) im gekühlten Puffer ohne Waschmittel und das sofortige Einfrieren trägt zur Erhaltung der Probenintegrität bei, wie zuvor bei der Isolierung der Maussehne beobachtet wurde54. IFMs können erfolgreich trockengefroren werden, nachdem sie alle Puffer aus dem Pellet entfernt haben, aber speziell für die RNA-Isolierung führt das Einfrieren von Proben im Isolationspuffer tendenziell zu besseren Ergebnissen. IFMs aus bis zu 20 separaten Sezieren werden vor der RNA- oder Proteinisolation kombiniert, so dass auch von frühen Zeitpunkten oder Mutanten16,32, für die nachgelagerte Analyse genügend Material skaliert und gesammelt werden kann.
Für RNA-Anwendungen kann der kritischste Schritt die Isolierung der RNA selbst sein. Guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform isolation (Methode 1 oben) übertrifft die meisten kommerziellen Kits getestet und, wie bereits erwähnt, ist deutlich billiger55. Die variabilitätsbeobachtete RNA-Isolationsausbeute mit kommerziellen Kits stimmt mit früheren Beobachtungen56,57überein. Wir fügen auch Glykogen während der Isopropanol-Ausfällung hinzu, um die gesamte RNA wiederherzustellen. Über die RNA-Ausbeute hinaus ist es wichtig, die RNA-Integrität zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Probe während der Sezieren- und Isolationsprozesse nicht fragmentiert oder abgebaut wurde. Es ist auch wichtig, RNase-frei zu arbeiten. Schließlich kann die Wahl des RT-Kits die Empfindlichkeit des Reverse-Transkriptionsprozesses beeinflussen. Obwohl nicht oft ausführlich diskutiert, beeinflussen all diese Punkte die Qualität der IFM-Probe und die Daten aus nachgelagerten Anwendungen.
Mehrere wichtige Änderungen unterscheiden das Protokoll von bestehenden IFM-Dissektionsprotokollen. Obwohl ein detailliertes Dissektionsprotokoll für IFM-Immunfluoreszenz19existiert, stellt dieses Protokoll einen anderen Ansatz für Pupal-Sektionen dar, der eine schnellere Isolierung von IFM-Gewebe ermöglicht. Dies ermöglicht die Sammlung großer Mengen von IFM-Gewebe (relativ gesprochen) mit begrenzten Sezierenvon Zeiten, um Proteom- oder Transkriptomänderungen zu verhindern. Andere Protokolle beschreiben die Zerlegung des erwachsenen IFM zur Visualisierung der GFP-Färbung in einzelnen Myofibrils39 oder zur Färbung von Larvenkörper-Wand-Muskeln58, aber sie sprechen nicht die Sezieren in Pupalstadien oder zur Isolierung von RNA oder Protein an. Dieser Ansatz unterscheidet sich auch vom bestehenden Protokoll für die Mikrodissektion von Pupal-IFMs aus kryosections38, das eine reinere IFM-Probe erzeugen kann, aber arbeitsintensiver ist und weniger Material produziert. Im Vergleich zu anderen schnellen erwachsenen IFM-Sektionsprotokollen38,39werden IFMs im PBS-Puffer ohne Reinigungsmittel isoliert, um die Spannungsinduktion und andere wichtige Expressionsänderungen zu begrenzen.
Der wichtigste Fortschritt in diesem Protokoll ist die Aufnahme eines lebenden, fluoreszierenden Reporters, der die Isolierung der IFMs in frühen Pupalstadien ermöglicht. Wir verwenden standardmäßig Mef2-GAL459 fahren entweder UAS-CD8::GFP oder UAS-GFP::Gma60. Dies ermöglicht eine differenzielle Kennzeichnung von IFM (Flugmuskeln sind stärker gekennzeichnet und anders geformt als andere Pupalmuskeln) sowie die Durchführung von GAL4-UAS-basierten Manipulationen, z. B. Rettungs- oder RNAi-Experimenten. Es ist auch möglich, Mef2-GAL4 mit Wanne-GAL80ts zu kombinieren, um RNAi-assoziierte frühe Letalität zu vermeiden, oder mit UAS-Dcr2, um die RNAi-Effizienz zu erhöhen40.
Es stehen zusätzliche GAL4-Treiber oder GFP-Linien zur Verfügung, die in Muskeltyp-Spezifität, zeitlichem Ausdrucksmuster und Treiberstärke19,61 variieren, die anstelle von Mef2-GAL4 verwendet werden können. Beispielsweise wird Act88F-GAL4 zuerst um 24 h APF ausgedrückt, sodass es nicht für frühere Zeitpunkte verwendet werden kann; Es wird jedoch stark als IFM bezeichnet und kann nützlich sein, um RNAi-assoziierte frühe Letalität zu vermeiden. Him-GFP oder Act88F-GFP Label IFM, wieder mit zeitlichen Einschränkungen, aber sie vermeiden GAL4 Abhängigkeit von Marker-Expression und kann in Kombination mit einem mutierten Hintergrund von Interesse nützlich sein. Listen anderer möglicher Markerlinien sind verfügbar19. Es sollte auch beachtet werden, dass die Verwendung von Transgenen und dem GAL4/UAS-System Genexpressionsartefakte verursachen kann, daher ist es wichtig, geeignete Kontrollen zu verwenden, z. B. die Treiberlinie, die zum Wildtyp-Hintergrundstamm gekreuzt wird, so dass solche Artefakte vermutlich in allen Proben gleich.
Mit dem begleitenden Video soll dieses detaillierte Protokoll die pupalIFM-Sektion zugänglicher machen und den Einsatz von Omics-Ansätzen zur Erforschung der Muskelentwicklung fördern. Die Kopplung der Kraft der Drosophila-Genetik und Der Zellbiologie mit den Biochemie- und Omics-Assays, die durch seziertes IFM zugänglich sind, hat das Potenzial, das mechanistische Verständnis von Myogenese und Muskelfunktion zu fördern. Zukünftige Studien, die Beobachtungen von Transkriptom und Proteomregulation auf Systemebene mit metabolischen und funktionellen Ausgängen verknüpfen, werden ein tieferes Verständnis der muskelspezifischen Entwicklung und der Pathogenese von Muskelerkrankungen liefern.

Moderne Omics-Technologien liefern wichtige Einblicke in die Muskelentwicklung und die Mechanismen, die menschlichen Muskelerkrankungen zugrunde liegen. Beispielsweise hat die Analyse von Transkriptomikdaten in Verbindung mit genetischer und biochemischer Verifikation in Tiermodellen ergeben, dass der Verlust des Spleißfaktors RBM20 aufgrund der Regulierung eines Zielnetzes von mehr als 30 Sarcomere eine erweiterte Kardiomyopathie verursacht. Gene, die zuvor mit Herzerkrankungen in Verbindung gebracht wurden, einschließlich Titin1,2,3.
In einem zweiten Beispiel haben Studien von Zellkultur, Tiermodellen und menschlichen Patienten gezeigt, dass myotonische Dystrophie durch eine Störung der RNA-Regulierung durch Sequestrierung von Muscleblind (MBNL) und Upregulation von CELF14,5verursacht wird. Die interregulierende und zeitliche Dynamik zwischen MBNL und CELF1 (auch CUGBP1 oder Bruno-Like 2 genannt) hilft, die anhaltenden embryonalen Spleißmuster bei myotonischen Dystrophie-Patienten zu erklären. Darüber hinaus hilft das große Netzwerk von falsch regulierten Zielen, die komplexe Natur derKrankheit4,6,7,8zu erklären. Eine Mehrheit dieser Studien nutzt omics Ansätze in genetischen Modellorganismen, um die Mechanismen zu verstehen, die menschlichen Muskelerkrankungen zugrunde liegen. Darüber hinaus unterstreichen sie die Bedeutung des ersten Verständnisses der zeitlichen und Gewebe-spezifischen Genexpression, Proteinmodifikation und Metabolische Muster in gesunden Muskeln, um Veränderungen in kranken oder alternden Muskeln zu verstehen.
Drosophila melanogaster ist ein weiterer etablierter genetischer Modellorganismus. Die Struktur des Sarcomere sowie einzelne Sarkome-Komponenten sind von Fliegen bis wirbeltiere stark konserviert4,9,10, und die indirekten Flugmuskeln (IFMs) sind zu einem leistungsstarken Modell zum Studium geworden mehrere Aspekte der Muskelentwicklung11,12. Erstens unterscheiden sich die fibrillaren Flugmuskeln funktionell und morphologisch von den röhrenförmigen Körpermuskeln11,13, was die Untersuchung muskelspezifischer Entwicklungsmechanismen ermöglicht. Transkriptionsfaktoren wie Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd) und Homothorax (Hth)15 wurden als fibrillare Schicksalsregulatoren identifiziert. Zusätzlich leitet der CELF1-Homolog Bruno1 (Bru1, Aret) flussabwärts von Salm ein fibrillarspezifisches Spleißprogramm16,17.
Zweitens sind IFMs ein wichtiges Modell für das Verständnis des Prozesses der Myogenese selbst, von Myoblast-Fusion und Myotube-Bindung an Myofibrillogenese und Sarcomere Reifung9,18,19. Drittens ermöglicht die Drosophila-Genetik die Untersuchung von Beiträgen einzelner Proteine, Proteindomänen und Proteinisoformen zur Sarcomere-Bildung, Funktion und biophysikalischen Eigenschaften20,21,22 ,23. Schließlich wurden IFM-Modelle für die Untersuchung mehrerer menschlicher Muskelerkrankungen entwickelt, wie myotonische Dystrophie, myofibrillare Myopathien, Muskeldegenerative Störungen, Aktinopathien, etc.24,25,26 ,27, und haben wichtige Einblicke in Krankheitsmechanismen und mögliche Therapien28,29,30. Daher ist Drosophila ein nützliches Modell, um viele offene Fragen im Bereich der Myogenese zu beantworten, einschließlich Mechanismen der muskelspezifischen Transkription, Spleißen und Chromatinregulation, sowie die Rolle des Stoffwechsels bei der Muskelentwicklung. Die Anwendung moderner Omics-Technologien, insbesondere in Kombination mit der Vielzahl genetischer, biochemischer und zellbiologischer Assays in Drosophila,hat das Potenzial, das Verständnis von Muskel Entwicklung, Alterung und Krankheit.
IFMs sind die größten Muskeln der Fliege und überspannen fast 1 mm über die gesamte Länge des Thorax bei Erwachsenen31,32. Diese kleine Größe stellt jedoch die Herausforderung dar, genügend Proben zu erhalten, um Omics-Technologien in Drosophila auf gewebespezifische Weise anzuwenden. Darüber hinaus sind IFMs Teil der erwachsenen Muskulatur, die während der Pupalstadien gebildet wird. Myoblasten verschmelzen zu Myotuben, die nach der Pupariumbildung (APF) um 24 h an Sehnen anhaften und sich einem Verdichtungsschritt unterziehen, der notwendig ist, um die Myofibrillogenese um 30 h APF zu initiieren (Abbildung 1A-D)18,33, 34.
Die Myofiber wachsen dann, um die gesamte Länge des Thorax zu überspannen, wobei Myofibrils eine erste Wachstumsphase durchlaufen, die sich auf die Sarcomere-Zugabe bis etwa 48 h APF konzentriert und dann in eine Reifephase übergeht, in der Sarkome in Länge und Breite wachsen und umgestaltet, um die Stretch-Aktivierung durch 72 h APF (Abbildung 1A-D)32,35zu etablieren. Der Beginn der Faserreifung wird zumindest teilweise von Salm und E2F32,36,37und mehreren IFM-spezifischen Sarkomre-Protein-Isoformen kontrolliert, deren Spleißen durch Bru1 gesteuert wird, werden dabei eingearbeitet. Phase16,17. Reife Fliegen aus der Nähe von 90-100 h APF. Dies bedeutet, dass IFM zur Untersuchung der Muskelentwicklung mit ausreichender Quantität, Qualität und Reinheit von mehreren Pupal-Zeitpunkten isoliert werden muss, um die Analyse mit omics-Ansätzen zu erleichtern.
Mehrere Protokolle für die IFM-Sektion wurden veröffentlicht. Diese Protokolle eignen sich zwar gut für ihre beabsichtigten Anwendungen, aber keines ist ideal für omics-Ansätze. Protokolle, die die IFM-Morphologie zur Immunfluoreszenz von Pupal- und erwachsenen IFMs19erhalten, IFM-Fasern für die mechanische Auswertung isolieren31oder Mikrodissektion von Pupal-IFM aus Kryosektionen38 nutzen, sind zu spezialisiert und arbeitsintensiv, um ausreichend IFM-Gewebe für Omics-Anwendungen zu erhalten. Andere Protokolle wurden für die schnelle Zerlegung von speziell erwachsenen IFM38,39entwickelt, daher sind sie nicht auf Pupalstadien anwendbar und verwenden Puffer, die nicht ideal sind oder beispielsweise mit der RNA-Isolierung unvereinbar sein können. Daher ist es notwendig, neue Ansätze zu entwickeln, um pupal IFM für Biochemie- oder Omics-Anwendungen zu isolieren.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Zerlegung von IFM während der Pupalstadien vor, das erfolgreich für die mRNA-Seq-Analyse von 16 h APF bis zur Erwachsenenstufe16,32verwendet wurde. Das Protokoll verwendet ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) Label, um IFMs in allen Stadien der Pupal- und Erwachsenenentwicklung zu identifizieren, was eine lebende Sezierung unter einem fluoreszierenden Sezierenmikroskop ermöglicht. Der Ansatz ist weniger arbeitsintensiv und hat einen höheren Durchsatz als bestehende IFM-Sektionsprotokolle. Dies ermöglicht eine schnelle Isolierung und Kryokonservierung von Proben, wodurch nach mehreren Sezierensrunden genügend Material für Omics-Ansätze sowie für Standard-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder Western Blotting erzeugt wird.
Wir präsentieren das Protokoll in zwei Teilen und zeigen, wie IFMs sowohl vor 48 h APF (während der frühen Metamorphose, wenn IFM-Anhänge zäher sind) als auch nach 48 h APF (wenn der pupal body plan und IFM-Anhänge gut definiert sind) schnell seziert werden können. Wir zeigen, dass wir qualitativ hochwertige RNA zu allen Zeitpunkten von sezierten IFMs isolieren und Daten zu verschiedenen Ansätzen zur RNA-Isolation und Reverse-Transkription präsentieren können. Schließlich zeigen wir die Anwendung des Dissektionsprotokolls auf mRNA-Seq, Massenspektrometrie und RT-PCR am Beispiel des CELF1-Homologs Bruno1. Wir zeigen Fehlexpression von Sarkome-Protein-Isoformen in Proteomik-Daten von Bruno1 mutant IFM und untersuchen Bruno1 Regulierung des C-Terminal Spleice Ereignis von Myosin schwere Kette (Mhc). Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie Omics-Daten ein tieferes Verständnis biologischer Phänomene ermöglichen und genetische und biochemische Experimente ergänzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila Flugmuskel ist ein leistungsfähiges Modell, um verschiedene Prozesse wie Transkriptionsregulation, alternative Spleißung, Stoffwechsel und Mechanobiologie zu studieren, die alle beeinflussen Muskelentwicklung und Myofibrillogenese. Omics-Daten, wie sie durch Massenspektrometrie oder tiefe Sequenzierung erzeugt werden, können wichtige mechanistische Einblicke in diese biologischen Prozesse liefern. Für solche Ansätze ist es vorteilhaft, gewebespezifische Proben zu analysieren, um sowohl die Selektivität als auch die Spezifität der Omics-Fingerabdrücke zu erhöhen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Zerlegung von fluoreszierend markierten Flugmuskeln aus lebenden Pupae vor, um hoch angereicherte Muskelproben für Omics-Anwendungen zu erzeugen. Wir beschreiben zunächst, wie man Flugmuskeln in frühen Pupalstadien seziert (<48 h nach Pupariumbildung [APF]), wenn die Muskeln durch die Kennzeichnung von grünem fluoreszierendem Protein (GFP) erkennbar sind. Wir beschreiben dann, wie man Muskeln von späten Welpen (>48 h APF) oder Erwachsenen seziert, wenn Muskeln unter einem Sezierenmikroskop unterscheidbar sind. Das begleitende Videoprotokoll wird diese technisch anspruchsvollen Sezierungen für die Muskel- und Drosophila-Forschungsgemeinschaften breiter zugänglich machen. Für RNA-Anwendungen prüfen wir die Quantität und Qualität von RNA, die zu verschiedenen Zeitpunkten und mit unterschiedlichen Ansätzen isoliert werden können. Wir zeigen weiter, dass Bruno1 (Bru1) für eine zeitliche Verschiebung in der Myosin-Schwerenkette (Mhc) spleißen notwendig ist, was zeigt, dass sezierte Muskeln für mRNA-Seq, Massenspektrometrie und Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendet werden können. Anwendungen. Dieses Sezierprotokoll wird dazu beitragen, gewebespezifische Omics-Analysen zu fördern und kann allgemein angewendet werden, um mehrere biologische Aspekte der Myogenese zu untersuchen.

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila Flugmuskel ist ein leistungsfähiges Modell, um Transkriptionsregulation, alternative Spleißung, Stoffwechsel und Mechanobiologie zu studieren. Wir präsentieren ein Protokoll zur Zerlegung von fluoreszierend markierten Flugmuskeln aus lebenden Pupas, um hoch angereicherte Proben zu erzeugen, die ideal für Proteomik und Tiefensequenzierung sind. Diese Proben können wichtige mechanistische Einblicke in verschiedene Aspekte der Muskelentwicklung bieten.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Das Protokoll erleichtert die Zerlegung des GFP-markierten indirekten Flugmuskels von Drosophila zu verschiedenen Zeitpunkten während der Pupae-Entwicklung, um Veränderungen der Gen- und Proteinexpression zu bewerten. Mit diesen Techniken kann eine hoch angereicherte Flugmuskelprobe mit minimalem RNA-Proteinabbau erreicht werden, die für RT-PCR-, Western Blot- oder omic-Ansätze geeignet ist. Diese speziellen Abschnitte erfordern Übung und Geschicklichkeit, aber die Anzahl der Pupas, die seziert werden können und die Qualität der Proben verbessern sich mit der Erfahrung.Die visuelle Demonstration dieser Zerlegung ist entscheidend für die Bestimmung, wie Flugmuskeln von nicht-muskelbem Geweben unterschieden werden können und was die schnelle Isolierung der Flugmuskulatur von Pupalproben erleichtert. Um die Pupae zu inszenieren, verwenden Sie einen nassen Pinsel, um Pre-Pupae zu sammeln und in eine 60-Millimeter-Petrischale zu übertragen, und die Pupae unter einem binokularen Mikroskop zu sexen. Männchen werden durch das Vorhandensein von Hoden identifiziert, die als durchscheinende Kugeln auf den ansonsten undurchsichtigen Pupas erscheinen.Nachdem Sie das Gericht mit der Uhrzeit, dem Datum und dem Genotyp der Fliegen gekennzeichnet haben, altern Sie die Pupae in einem 25 bis 27 Grad Celsius Inkubator bis zum entsprechenden Stadium. Für die IFM-Sektion vor 48 H APF verwenden Sie einen benetzten Pinsel, um die entsprechend inszenierten Pupae auf eine schwarze Sezierschale zu übertragen, die etwa 2/3 mit gekühltem PBS gefüllt ist. Unter dem fluoreszierenden Sezieren mikroskop, verwenden Sie eine 5 Zange, um eine der Pupae auf den Boden der schwarzen Sezieren Schale zu drücken.Passen Sie den Mikroskopzoom und -fokus an, bis die Welpen klar visualisiert werden können. Mit einem Paar Zange, um das Vorderteil der Pupae zu greifen, schlagen Sie die Pupae mit einer einzigen Spitze eines zweiten Paares von Zangen, leicht aus der Mitte im Bauch, direkt hinter dem Thorax. Verwenden Sie das erste Paar Zangen, um die vordere Hälfte des Pupal-Gehäuses zu entfernen, und um die exponierten Pupilben direkt hinter dem Thorax zu kneifen, um den Bauch vom Thorax zu trennen.Als nächstes drücken Sie vorsichtig den vorderen Teil des Thorax, um die fluoreszierend beschrifteten IFMs freizulegen. Verwenden Sie dann die Zange, um den verbleibenden Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Schale zu werfen, und sezieren Sie die nachfolgenden Welpen auf die gleiche Weise. Wenn alle Pupas seziert wurden, verwenden Sie die Zange, um die IFM-Fasern zu sammeln, und organisieren Sie die Fasern in einem Stapel am Boden der schwarzen Sezierenschale.Verwenden Sie die Zange, um Schmutz aus dem Sichtfeld zu schieben, und entfernen Sie alle Nicht-IFM-Muskeln, Fett, Nagelhaut oder anderes unerwünschtes Gewebe aus den Proben. Verwenden Sie dann eine abgeschnittene Pipettenspitze, um den Stapel von IFMs in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 250 Mikroliter gekühlten PBS zu übertragen. Für die IFM-Sektion nach 48 H APF, verwenden Sie einen leicht benetzten Pinsel, um die inszenierten Pupae auf einen Streifen aus doppelseitigem Klebeband zu übertragen, das auf einem Mikroskopschlitten montiert ist.Richten Sie die Pupae in einer Linie, ventrale Seite nach unten und vorderin an der Unterseite der Folie aus. Wenn alle Pupillen platziert sind, verwenden Sie Zangen, um auseinander zu necken und öffnen Sie das erste Pupal-Gehäuse über den vorderen Spiracles, und schieben Sie sanft ein Paar Zangen dorsal, in Richtung des Hinterteils, schneiden Sie das Pupal-Gehäuse, während sich die Zangen bewegen. Befreien Sie die Pupae aus dem geöffneten Gehäuse und übertragen Sie die Pupae sofort auf einen Tropfen PBS auf einem zweiten Mikroskopschlitten.Wenn alle Pupas befreit sind, verwenden Sie eine feine Schere, um den Bauch der Pupae vom Thorax wegzuschneiden, und schieben Sie den Bauch in einen separaten Haufen. Wenn alle Thoraxen entfernt wurden, verwenden Sie ein Stück Tissuepapier, um den Großteil der PBS und den Haufen Von Bauch zu entfernen. Fügen Sie einen Tropfen frische, gekühlte PBS zu den verbleibenden Thoraxen, bevor Sie die Schere verwenden, um vom Kopf entlang der Längskörperachse in einer einzigen Bewegung zu schneiden, um den Thorax in der Hälfte zu teilen.Wenn alle Pupas seziert wurden, verwenden Sie die 5 Zangen, um eine der Halbsektionen auszuwählen, und legen Sie vorsichtig die Spitzen einer Zange über und unter der Mitte der IFMs ein. Halten Sie das erste Zangenpaar still, verwenden Sie eine feine Schere, um ein Ende des IFM von der Nagelhaut und den Sehnen wegzuschneiden, bevor Sie die Pupae um 180 Grad drehen, damit das andere Ende des IFM frei von Derhaut und Sehnen geschnitten werden kann. Verwenden Sie Zangen, um das IFM-Bundle vom Thorax an den Rand der PBS-Blase zu übertragen, indem Sie Wasserspannung verwenden, um das Bündel an Ort und Stelle zu halten.Dann schieben Sie den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Rutsche, und sezieren Sie den Rest der IFMs auf die gleiche Weise. Wenn alle IFMs gesammelt wurden, verwenden Sie die 5 Zangen, um alle Sprungmuskel- oder Nagelhautfragmente zu entfernen, die ihren Weg in die Proben gefunden haben könnten. Verwenden Sie dann die Wasserspannung, um die sezierten IFMs zwischen einem Zangenpaar sanft einzufangen, und legen Sie die IFMs in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 250 Mikroliter gekühlten PBS.mRNA-Sequenzierungsdaten von BRUNO1 IR IFMs zeigen Veränderungen der Expression auf der Geneinheitsebene im Vergleich zu Wildtyp-Sequenzierungsdaten. Mit Der Gesamten Proteom-Massenspektrometrie an sezierten IFMs wird eine ähnliche Regulation auf den Protein- und Proteinisoformspiegel beobachtet. Nach dem Einsetzen einer Proteinfalleinlinie in das endgültige Intron von Mhc kann die Aufnahme des GFP-markierten Proteins in IFM als zwei Punkte auf beiden Seiten der M-Linie bei 90 H APF beobachtet werden, während im Beinmuskelgewebe das GFP-Signal gleichmäßig über die Sarkome M-Linie beobachtet werden kann.Bei Verwendung von RT-PCR auf seziertem IFM kann ein Mhc-Isoformschalter vom GFP-markierten exon 34- bis 37-Ereignis zum unbeschrifteten Exon-34-35-Ereignis zwischen 30 und 48 Stunden nach der Pupariumbildung bei 27 Grad Celsius nachgewiesen werden. Aus mRNA-Sequenzierungsdaten exprimieren Bein- und Sprungmuskelgewebe alle drei Mhc-Isoformen und erhalten so die Expression der GFP-markierten Isoform in reifen Muskeln. Sowohl Spalt-Hauptmutant als auch BRUNO1 IR-IFM konnten die Expression der GFP-markierten Mhc-Isoform bei ihrer Entwicklung nicht abschalten, was zu einem isoformen Expressionsprofil führte, das dem von Bein- und Sprungmuskelgewebe ähnelt.Denken Sie daran, dass die Sezierungen in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden sollten, um den RNA-Abbau zu verhindern. Und darauf zu achten, die Kontamination durch andere Zelltypen zu begrenzen. Diese Methode erzeugt IFM-angereicherte Proben, die für biochemische Ansätze wie RT-PCR oder Western Blotting geeignet sind, sowie omic Style-Ansätze wie Massenspektrometrie, Hochdurchsatzsequenzierung, Chromatin-Konformierungsaufnahme und Metabolomik.Diese Abschnitte können die leistungsstarken genetischen Ansätze in Drosophila mit Daten auf Systemebene ergänzen, um die grundlegenden Mechanismen der Entwicklung und Genregulation zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Forschung

Genetik

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Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

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Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

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