Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

हम उदार समर्थन के लिए एंड्रियास Ladurner और फ्रैंक Schnorrer के आभारी हैं. हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और Akanksha रॉय मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा उत्पन्न करने के लिए सैंड्रा Esser धन्यवाद. हम मक्खियों प्रदान करने के लिए Bloomington और वियना स्टॉक केन्द्रों स्वीकार करते हैं. हम confocal इमेजिंग के साथ मदद के लिए कोर सुविधा Bioimaging धन्यवाद और जेस्पस्पेक्ट्रोमेट्री नमूनों के विश्लेषण के लिए zentrallabor f]r Proteinanalytik, दोनों LMU बायोमेडिकल सेंटर में (Martinsried, डे). हमारे काम ड्यूश Forschungs Gemeinschaft (एमएलएस, एसपी 1662/3-1), लुडविग-Maximilians-यूनिवर्सिटी मोंचेन (एमएलएस), फ्रेडरिक-Bauer Stiftung (एमएलएस), और अंतर्राष्ट्रीय मैक्स में एकीकृत प्रोटीन विज्ञान म्यूनिख (CIPSM) के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था प्लैंक रिसर्च स्कूल (एन.एन.)।

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रोटीन, डीएनए, आरएनए या अन्य मैक्रो अणुओं के डाउनस्ट्रीम अलगाव के लिए प्रारंभिक और देर से चरण प्यूपा से Drosophila IFMs विच्छेदन करने के लिए बुनियादी तकनीक प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल आसानी से वयस्क मक्खियों से IFM विच्छेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम MRNA-सेक, प्रोटीओमिक्स और आरटी-पीसीआर अनुप्रयोगों के लिए हमारे विच्छेदन प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं। omics प्रौद्योगिकियों के निरंतर सुधार के साथ कम शुरू सामग्री और कम इनपुट सांद्रता के साथ नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, इन विच्छेदन की संभावना कई अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए मूल्यवान हो जाएगा. के रूप में IFMs मानव myopathies4,24 और मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट विकास9,12के लिए एक स्थापित मॉडलहैं,हम कल्पना, उदाहरण के लिए, IFM समृद्ध metabolomics, क्रोमैटिन रचना की जांच 3C या 4C के माध्यम से, CLiP बातचीत या मायोफिब्रिलोजेनेसिस के फॉस्फो-प्रोटीओमिक्स के माध्यम से नेटवर्क मूल्यांकन का छिड़काव।
यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि इन विच्छेदन एक शुद्ध IFM नमूने के बजाय IFM के लिए समृद्ध नमूना का उत्पादन. यह मोटर न्यूरॉन innervation, कण्डरा संलग्नक और मांसपेशी फाइबर के श्वासनली आक्रमण के कारण अपरिहार्य है. Bioinformatics विश्लेषण IFM समृद्ध जीन या प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन आगे प्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए कि वे वास्तव में IFM-विशिष्ट हैं की आवश्यकता है. नमूना शुद्धता ऐसे धारी45 (टेन्डन), Act79B4,44 (ट्यूबलर मांसपेशी), Act88F15 (IFM), या syb46 (न्यूरॉन विशिष्ट) के रूप में प्रकाशित ऊतक-विशिष्ट मार्करों का उपयोग कर परख किया जा सकता है। IFM-विशिष्ट सामग्री के लिए डेटासेट को सामान्य करने के लिए ऐसे मार्कर का उपयोग करना संभव हो सकता है, लेकिन उपयोगकर्ताओं को चेतावनी दी जाती है कि सामान्यीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले जीनों की अभिव्यक्ति में अस्थायी परिवर्तन, IFM-विशिष्ट जीन या ट्यूबुलिन के उदाहरण के लिए, इस तरह के दृष्टिकोण को पूर्वाग्रह कर सकते हैं।
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ऊतक-विशिष्ट लेबलिंग विधियाँ, उदाहरण के लिए EC-टैगिंग47,48 या PABP-लेबलिंग49,50 आरएनए को अलग करने के लिए हाल के वर्षों में विकसित किया गया है, जो वास्तव में प्राप्त करने में मदद कर सकता है ऊतक-विशिष्ट आरएनए नमूना. हालांकि, ईसी-टैगिंग के लिए मक्खियों को लगातार खिलाने की आवश्यकता होती है47 और इस प्रकार प्यूपल चरणों के दौरान लागू नहीं होता है। PABP-लेबल ट्रांसक्रिप्टम की संवेदनशीलता और पूर्णता की सीमाएँ51हो सकती हैं. व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर को अलग करने के लिए FACS दृष्टिकोण IFMs के बड़े आकार और syncytial प्रकृति से जटिल हैं. INTACT52,53 शैली दृष्टिकोण IFMs से विशिष्ट subcellular-compartments को अलग करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो IFM नाभिक या mitochondria की शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है. मैनुअल विच्छेदन अभी भी सबसे बहाव अनुप्रयोगों के लिए बरकरार IFM ऊतक प्राप्त करने के लिए वर्तमान मानक हैं.
नमूना गुणवत्ता विच्छेदन प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करता है। विच्छेदन तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, विच्छेदन गति और नमूना शुद्धता के साथ अनुभव के साथ बढ़ रही है. डिटर्जेंट के बिना ठंडा बफर में समय की छोटी अवधि (20-30 मिनट) के लिए विच्छेदन और तुरंत ठंड नमूना अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है, के रूप में माउस कण्डरा अलगाव54के लिए पहले देखा गया है. IFMs गोली से सभी बफर को हटाने के बाद सफलतापूर्वक सूखी-फ्रोज़न किया जा सकता है, लेकिन विशेष रूप से आरएनए अलगाव के लिए, अलगाव बफर में ठंड के नमूने बेहतर परिणाम का उत्पादन करने के लिए जाता है. अप करने के लिए 20 अलग विच्छेदन से IFMs आरएनए या प्रोटीन अलगाव से पहले संयुक्त कर रहे हैं, स्केलिंग और पर्याप्त सामग्री इकट्ठा करने की अनुमति, यहां तक कि प्रारंभिक timepoints या म्यूटेंटसे 16,32,बहाव विश्लेषण के लिए.
आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम आरएनए ही अलगाव हो सकता है. ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट-फेनोल-क्लोरोफॉर्म आइसोलेशन (विधि 1 ऊपर) सबसे वाणिज्यिक किट परीक्षण outperforms और, जैसा कि पहले उल्लेख किया, काफी कम महंगाहै 55. आरएनए आइसोलेशन में देखी गई परिवर्तनशीलता वाणिज्यिक किटों के साथ पिछली टिप्पणियों के साथ समझौता करती है56,57. हम आगे सभी आरएनए ठीक करने में मदद करने के लिए आइसोप्रोपेनोल वर्षा के दौरान ग्लाइकोजन जोड़ें। आरएनए उपज के अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए आरएनए अखंडता की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि विच्छेदन और अलगाव प्रक्रियाओं के दौरान नमूना खंडित या निम्नीकृत नहीं किया गया है। यह भी RNase मुक्त काम करने के लिए आवश्यक है. अंत में, आरटी-किट का चुनाव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया की संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकता है। जबकि अक्सर विस्तार से चर्चा नहीं, इन बिंदुओं के सभी IFM नमूना की गुणवत्ता और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों से प्राप्त डेटा को प्रभावित करते हैं.
कई महत्वपूर्ण संशोधन प्रोटोकॉल को मौजूदा IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल से अलग सेट करते हैं. हालांकि IFM इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक विस्तृत विच्छेदन प्रोटोकॉल मौजूदहै 19, इस प्रोटोकॉल pupal विच्छेदन है कि IFM ऊतक के और अधिक तेजी से अलगाव की अनुमति देता है के लिए एक अलग दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. यह IFM ऊतक की बड़ी मात्रा के संग्रह की अनुमति देता है (relatively बोल) सीमित विच्छेदन समय के साथ proteome या transcriptome परिवर्तन को रोकने के लिए. अन्य प्रोटोकॉल व्यक्तिगत myofibrills39 में GFP धुंधला visualizing के लिए वयस्क IFM के विच्छेदन का वर्णन या लार्वा शरीर की दीवार की मांसपेशियों के धुंधला के लिए58, लेकिन वे pupal चरणों में विच्छेदन पता नहीं है या आरएनए या प्रोटीन के अलगाव के लिए. यह दृष्टिकोण भी cryosections38से pupal IFMs के microdissection के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल से अलग है, जो एक शुद्ध IFM नमूना उत्पन्न कर सकते हैं, लेकिन अधिक श्रम गहन है और कम सामग्री का उत्पादन. अन्य तेजी से वयस्क IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल की तुलना में38,39, IFMs तनाव प्रेरण और अन्य प्रमुख अभिव्यक्ति परिवर्तन को सीमित करने के लिए डिटर्जेंट के बिना पीबीएस बफर में अलग कर रहे हैं.
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण अग्रिम एक जीवित, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के शामिल किए जाने, जल्दी pupal चरणों में IFMs के अलगाव की अनुमति है. हम मानक रूप से उपयोग Mef2-GAL459 ड्राइविंग या तो UAS-CD8::GFP या UAS-GFP::Gma60| यह IFM के अंतर लेबलिंग की अनुमति देता है (उड़ान की मांसपेशियों को और अधिक दृढ़ता से लेबल और अन्य प्यूपल मांसपेशियों की तुलना में अलग आकार) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GAL4-UAS आधारित जोड़तोड़ के प्रदर्शन, उदाहरण के लिए बचाव या RNAi प्रयोगों. यह भी संभव है Mef2-GAL4 टबके साथ गठबंधन करने के लिए -GAL80ts RNAi-संबद्ध जल्दी घातकता से बचने के लिए या UAS-Dcr2 के साथ RNAi दक्षता40में वृद्धि करने के लिए.
अतिरिक्त GAL4 ड्राइवर या GFP-लाइनों उपलब्ध है कि मांसपेशियों में भिन्नता प्रकार विशिष्टता, लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न, और ड्राइवर ताकत19,61 कि Mef2-GAL4 के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Act88F-GAL4 पहले 24 h APF के आसपास व्यक्त की है, तो यह पहले timepoints के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है; हालांकि, यह दृढ़ता से IFM लेबल और RNAi-संबद्ध जल्दी घातकता से बचने के लिए उपयोगी हो सकता है. उसे-GFP या Act88F-GFP लेबल IFM, फिर से अस्थायी प्रतिबंध के साथ, लेकिन वे मार्कर अभिव्यक्ति की GAL4 निर्भरता से बचने और ब्याज की एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ संयोजन में उपयोगी हो सकता है. अन्य संभावित मार्कर रेखाओं की सूचियाँ19उपलब्ध हैं। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि transgenes और GAL4/UAS प्रणाली का उपयोग जीन अभिव्यक्ति कलाकृतियों का कारण हो सकता है, तो यह उचित नियंत्रण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए ड्राइवर लाइन जंगली प्रकार पृष्ठभूमि तनाव को पार कर, ताकि ऐसी कलाकृतियों संभवतः कर रहे हैं सभी नमूनों में एक ही.
साथ वीडियो के साथ, इस विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए प्यूपल IFM विच्छेदन और अधिक सुलभ बनाने के लिए और मांसपेशियों के विकास का अध्ययन करने के लिए omics दृष्टिकोण के उपयोग को बढ़ावा देने के उद्देश्य. जैव रसायन और omics के साथ Drosophila आनुवंशिकी और कोशिका जीव विज्ञान की शक्ति युग्मन विच्छेदन IFM के माध्यम से सुलभ assays मायोजेनेसिस और मांसपेशियों के समारोह के यंत्रवादी समझ अग्रिम करने की क्षमता है. चयापचय और कार्यात्मक outputs के लिए transcriptome और proteome विनियमन के सिस्टम स्तर टिप्पणियों को जोड़ने के भविष्य के अध्ययन मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट विकास और मांसपेशियों के विकारों के रोगजनन की एक गहरी समझ प्रदान करेगा.

आधुनिक omics प्रौद्योगिकियों मांसपेशियों के विकास और मानव मांसपेशी विकारों अंतर्निहित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. उदाहरण के लिए, पशु मॉडलों में आनुवंशिक और जैव रासायनिक सत्यापन के साथ संयुक्त ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि 30 से अधिक सार्कोमर के लक्ष्य नेटवर्क के विनियमन के कारण स्पेलिंग कारक आरबीएम 20 की हानि फैली हुई कार्डियोमायोपैथी का कारण बनती है। पहले हृदय रोग से जुड़े जीन , जिसमें टिटिन1,2,3शामिल हैं .
एक दूसरे उदाहरण में, सेल संस्कृति से अध्ययन, पशु मॉडल, और मानव रोगियों से पता चला है कि मायोटोनिक dystrophy Muscleblind (MBNL) के अलगाव और CELF14,5के विनियमन के कारण आरएनए विनियमन में एक व्यवधान के कारण होता है. MBNL और CELF1 के बीच पार नियामक और लौकिक गतिशीलता (भी CUGBP1 या ब्रूनो की तरह कहा जाता है 2) मायोटोनिक dystrophy रोगियों में लगातार भ्रूण splicing पैटर्न समझाने में मदद. इसके अतिरिक्त, गलत विनियमित लक्ष्यों का बड़ा नेटवर्क रोग की जटिल प्रकृति4,6,7,8की व्याख्या करने में मदद करता है . इस तरह के अध्ययनों के बहुमत आनुवंशिक मॉडल जीवों में omics दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए मानव मांसपेशियों की बीमारी अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए. इसके अलावा, वे रोगग्रस्त या उम्र बढ़ने की मांसपेशियों में परिवर्तन को समझने के लिए स्वस्थ मांसपेशियों में पहली समझ अस्थायी और ऊतक प्रकार विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन संशोधन, और चयापचय पैटर्न के महत्व पर प्रकाश डाला.
Drosophila मेलेनोगैस्टर एक और अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक मॉडल जीव है. सार्कोमयर के साथ-साथ व्यक्तिगत सार्कोमयर घटकों की संरचना मक्खियों से कशेरुकियों के लिए अत्यधिक संरक्षित हैं4,9,10, और अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों (IFMs) का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बन गए हैं पेशी विकास के कई पहलू11,12. सबसे पहले, फाइब्रिलर उड़ान की मांसपेशियों को कार्यात्मक और ट्यूबलर शरीर की मांसपेशियों से आकृतिबद्ध रूप से अलग कर रहे हैं11,13,मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट विकास तंत्र की जांच की अनुमति. स्पैल्ट मेजर (सलम)14,एक्सट्राडेंटिकल (एक्सड) और होमोथोरेक्स (एचथ)15 सहित ट्रांसक्रिप्शन कारकों की पहचान फाइब्रिलर भाग्य नियामकों के रूप में की गई है। इसके अतिरिक्त, सालम के बहाव, CELF1 homlog Bruno1 (Bru1, Aret) एक तंतुकाकार-विशिष्ट splicing कार्यक्रम16,17निर्देशित करता है.
दूसरा, IFMs मायोजेनेसिस की प्रक्रिया को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल हैं, मायोब्लास्ट संलयन और मायोट्यूब लगाव से मायोब्रिलोजेनेसिस और सार्कोमर परिपक्वता9,18,19. तीसरा, Drosophila आनुवंशिकी व्यक्तिगत प्रोटीन, प्रोटीन डोमेन द्वारा योगदान की जांच की अनुमति देता है, और प्रोटीन isoforms सार्कोमकेर गठन करने के लिए, समारोह, और जैव भौतिक गुण20,21,22 ,23. अंत में, IFM मॉडल कई मानव मांसपेशी विकारों के अध्ययन के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के मायोटोनिक dystrophy के रूप में, मायोफिरिल मायोपैथी, मांसपेशी अपक्षयी विकार, actinopathies, आदि24,25,26 27, और रोग तंत्र और संभावित चिकित्सा28,29,30के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की है . इस प्रकार, Drosophila एक उपयोगी मॉडल के लिए myogenesis क्षेत्र में कई खुले सवालों का पता है, मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट प्रतिलेखन के तंत्र सहित, जोड़, और क्रोमैटिन विनियमन, साथ ही मांसपेशियों के विकास में चयापचय की भूमिका के लिए. आधुनिक omics प्रौद्योगिकियों के आवेदन, विशेष रूप से आनुवंशिक, जैव रासायनिक और सेल जैविक परख Drosophilaमें उपलब्ध की विस्तृत विविधता के साथ संयोजन में, नाटकीय रूप से मांसपेशियों की समझ अग्रिम करने की क्षमता है विकास, उम्र बढ़ने, और रोग.
IFMs मक्खी में सबसे बड़ी मांसपेशियों रहे हैं, वयस्कों में छाती की पूरी लंबाई में लगभग 1 मिमी फैले31,32. हालांकि, इस छोटे आकार के एक ऊतक प्रकार विशिष्ट तरीके से Drosophila में omics प्रौद्योगिकियों लागू करने के लिए पर्याप्त नमूना प्राप्त करने की चुनौती उत्पन्न करता है. इसके अलावा, IFMs वयस्क पेशी का हिस्सा है कि pupal चरणों के दौरान गठन किया है. मायोब्लास्ट्स मायोट्यूब बनाने के लिए फ्यूज होता है, जो प्यूपरियम गठन (एपीएफ) के बाद 24 एच के आसपास कण्डरा को संलग्न करता है और 30 एच एपीएफ के आसपास मायोब्रिलोजेनेसिस शुरू करने के लिए आवश्यक एक संहनन चरण से गुजरना पड़ता है (चित्र 1ए-डी)18,33, 34.
मायोफाइबर्स तो छाती की पूरी लंबाई अवधि के लिए बढ़ने के लिए, myofibrills के बारे में 48 एच एपीएफ तक सार्कोमर इसके अलावा पर ध्यान केंद्रित एक प्रारंभिक विकास चरण के दौर से गुजर के साथ, और फिर एक परिपक्वता चरण में संक्रमण, जिसमें sarcomeres लंबाई और चौड़ाई में वृद्धि और कर रहे हैं 72 ज एपीएफ द्वारा खिंचाव सक्रियण स्थापित करने के लिए फिर से तैयार किया गया (चित्र 1ए -डी)32,35. फाइबर परिपक्वता की शुरुआत कम से कम आंशिक रूप से सालम और E2F32,36,37, और एकाधिक IFM-विशिष्ट सार्कोमर प्रोटीन आइसोफॉर्म जिसका splicing द्वारा नियंत्रित किया जाता है द्वारा नियंत्रित किया जाता है इस के दौरान शामिल किया जाता है चरण16,17. परिपक्व मक्खियों 90-100 एच एपीएफ से eclose. इसका मतलब यह है कि मांसपेशियों के विकास का अध्ययन करने के लिए, IFM के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ अलग किया जाना है, गुणवत्ता, और कई pupal timepoints से शुद्धता omics दृष्टिकोण का उपयोग कर विश्लेषण की सुविधा के लिए.
IFM विच्छेदन के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किया गया है। जबकि इन प्रोटोकॉल उनके इच्छित अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, कोई भी omics दृष्टिकोण के लिए आदर्श होते हैं. प्रोटोकॉल है कि प्यूपल और वयस्क IFMs19के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए IFM आकृति विज्ञान की रक्षा , यांत्रिक मूल्यांकन के लिए IFM फाइबर को अलग31, या cryosections38 से प्यूपल IFM के microdissection का उपयोग भी विशेष और समय और कर रहे हैं omics अनुप्रयोगों के लिए उचित IFM ऊतक की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए गहन श्रम. अन्य प्रोटोकॉल विशेष रूप से वयस्क IFM38,39के तेजी से विच्छेदन के लिए विकसित किया गयाहै,इस प्रकार pupal चरणों के लिए लागू नहीं हैं, और बफ़र्स कि आदर्श नहीं हैं या के साथ असंगत हो सकता है का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, आरएनए अलगाव. इस प्रकार, जैव रसायन या omics अनुप्रयोगों के लिए प्यूपल IFM को अलग करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने की आवश्यकता है.
यहाँ हम pupal चरणों है कि वयस्क चरणों16,32के माध्यम से 16 एच एपीएफ से MRNA-सेक विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के दौरान IFM के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबल को रोजगार के लिए pupal और वयस्क विकास के सभी चरणों में IFMs की पहचान, एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जीना विच्छेदन की अनुमति. दृष्टिकोण कम श्रम गहन है, मौजूदा IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल की तुलना में एक उच्च थ्रूपुट के साथ. यह तेजी से अलगाव और नमूनों के cryopservation की अनुमति देता है, omics दृष्टिकोण के लिए विच्छेदन के कई दौर के बाद पर्याप्त सामग्री पैदा करने के साथ ही मानक रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) या पश्चिमी सोख्ता के लिए.
हम प्रोटोकॉल को दो भागों में प्रस्तुत करते हैं, यह प्रदर्शित करते हैं कि 48 एच एपीएफ से पहले IFMs को तेजी से कैसे विभाजित किया जाए (शुरुआती कायापलट के दौरान, जब IFM अनुलग्नक अधिक कठोर होते हैं) और 48 एच एपीएफ के बाद (जब प्यूपल बॉडी प्लान और IFM अनुलग्नक अच्छी तरह से परिभाषित होते हैं)। हम प्रदर्शित करते हैं कि हम सभी timepoints पर विच्छेदन IFMs से उच्च गुणवत्ता आरएनए को अलग कर सकते हैं और आरएनए अलगाव और रिवर्स प्रतिलेखन के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों पर डेटा वर्तमान. अंत में, हम एक उदाहरण के रूप में CELF1 homolog Bruno1 का उपयोग कर MRNA-सेक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और RT-PCR करने के लिए विच्छेदन प्रोटोकॉल के आवेदन का प्रदर्शन. हम ब्रूनो1 उत्परिवर्ती आई.एफ.एम. से प्रोटीओमिक्स डेटा में सार्कोमर प्रोटीन आइसोफॉर्म्स की गलत अभिव्यक्ति दिखाते हैं और मायोसिन भारी श्रृंखला(एमएचसी)के सी-टर्मिनल जोड़ घटना के ब्रूनो1 विनियमन की जांच करते हैं। इन परिणामों से यह स्पष्ट होता है कि ओमिक्स डेटा किस प्रकार जैविक परिघटनाओं की गहरी समझ प्रदान कर सकता है, जो आनुवंशिक और जैव रासायनिक प्रयोगों का पूरक है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila उड़ान मांसपेशियों ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, वैकल्पिक splicing, चयापचय, और mechanobiology, जो सभी मांसपेशियों के विकास और myofibrillogenesis को प्रभावित के रूप में विविध प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है. Omics डेटा, ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री या गहरी अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न उन के रूप में, इन जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. ऐसे दृष्टिकोणों के लिए, यह ऊतक-विशिष्ट नमूनों का विश्लेषण करने के लिए दोनों चयनात्मकता और omics उंगलियों के निशान की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए फायदेमंद है. यहाँ हम omics अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक समृद्ध मांसपेशियों के नमूने उत्पन्न करने के लिए लाइव प्यूपा से फ्लोरोसेंट लेबल उड़ान मांसपेशियों के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम पहले वर्णन कैसे जल्दी pupal चरणों में उड़ान की मांसपेशियों को विभाजित करने के लिए (lt;48 एच प्यूपरियम गठन के बाद [APF]), जब मांसपेशियों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबलिंग द्वारा स्पष्ट कर रहे हैं. हम तो वर्णन कैसे देर से प्यूपा से मांसपेशियों को विभाजित करने के लिए (gt; 48 एच एपीएफ) या वयस्कों, जब मांसपेशियों को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत भेद कर रहे हैं. साथ वीडियो प्रोटोकॉल इन तकनीकी रूप से dissections और अधिक व्यापक रूप से मांसपेशियों और Drosophila अनुसंधान समुदायों के लिए सुलभ की मांग कर देगा. आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, हम आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता परख करते हैं जिसे अलग-अलग समय बिंदुओं पर और विभिन्न दृष्टिकोणों के साथ अलग-अलग किया जा सकता है। हम आगे बताते हैं कि Bruno1 (Bru1) मायोसिन भारी श्रृंखला में एक अस्थायी बदलाव के लिए आवश्यक है (Mhc) splicing, प्रदर्शन है कि विच्छेदित मांसपेशियों MRNA-सेक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) अनुप्रयोगों. इस विच्छेदन प्रोटोकॉल ऊतक विशेष omics विश्लेषण को बढ़ावा देने में मदद मिलेगी और आम तौर पर मायोजेनेसिस के कई जैविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila उड़ान मांसपेशियों ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है, वैकल्पिक splicing, चयापचय, और mechanobiology. हम लाइव प्यूपा से फ्लोरोसेंट लेबल उड़ान मांसपेशियों के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए अत्यधिक समृद्ध नमूने proteomics और गहरी अनुक्रमण के लिए आदर्श उत्पन्न करने के लिए. इन नमूनों मांसपेशियों के विकास के विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण मशीनी अंतर्दृष्टि की पेशकश कर सकते हैं.

Omics दृष्टिकोण के लिए Drosophila मेलेनोगैस्टर उड़ान मांसपेशियों का विच्छेदन

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

प्रोटोकॉल जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का आकलन करने के लिए पिल्ला विकास के दौरान विभिन्न समय बिंदु पर ड्रोसोफिला से जीएफपी-लेबल अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशी के विच्छेदन की सुविधा प्रदान करता है। इन तकनीकों का उपयोग करके, न्यूनतम आरएनए प्रोटीन क्षरण के साथ एक उच्च समृद्ध उड़ान मांसपेशी नमूना प्राप्त किया जा सकता है जो आरटी-पीसीआर, पश्चिमी दाग या ओमिक दृष्टिकोणों के लिए उपयुक्त है। इन विशेष विच्छेदन अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है, लेकिन पिल्ले की संख्या जिसे विच्छेदित किया जा सकता है और नमूनों की गुणवत्ता अनुभव के साथ सुधरती है।इस विच्छेदन का दृश्य प्रदर्शन यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उड़ान की मांसपेशियों को गैर-मांसपेशियों के ऊतकों से कैसे अलग किया जाए और पुपल नमूनों से उड़ान मांसपेशियों के तेजी से अलगाव को सुविधाजनक बनाया जाए। प्यूप को स्टेज करने के लिए, प्री-प्यूप को 60 मिलीमीटर पेट्री डिश में इकट्ठा करने और ट्रांसफर करने के लिए गीले तूलिका का इस्तेमाल करें, और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के नीचे प्यूप को सेक्स करें। पुरुषों की पहचान टेस्ट की उपस्थिति से होती है, जो अन्यथा अपारदर्शी पिल्ले पर पारदर्शी ग्लोब के रूप में दिखाई देते हैं।मक्खियों के समय, तिथि और जीनोटाइप के साथ पकवान को लेबल करने के बाद, उपयुक्त चरण तक 25 से 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्यूप की उम्र। ४८ एच एपीएफ से पहले IFM विच्छेदन के लिए, एक गीला तूलिका का उपयोग करने के लिए उचित मंचन pupae एक काले विच्छेदन पकवान के बारे में 2/3 ठंडा PBS से भरा हस्तांतरण । फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक 5 संदंश का उपयोग करने के लिए काले विच्छेदन पकवान के नीचे पिल्ले में से एक धक्का ।माइक्रोस्कोप ज़ूम को समायोजित करें और तब तक ध्यान केंद्रित करें जब तक कि पिल्ला स्पष्ट रूप से कल्पना न कर सके। पिल्ले के पूर्वकाल को समझने के लिए एक जोड़ी संदंश का उपयोग करना, पिल्ले को एक दूसरी जोड़ी संदंश की एक नोक के साथ प्रहार करें, पेट में थोड़ा ऑफ-सेंटर, छाती के ठीक पीछे। पुपल मामले के पूर्वकाल के आधे हिस्से को हटाने के लिए संदंश की पहली जोड़ी का उपयोग करें, और छाती के ठीक पीछे उजागर पिल्ले को छाती से पेट को अलग करने के लिए चुटकी लें।इसके बाद, फ्लोरोसेंटी लेबल वाले आईएफएम को बेनकाब करने के लिए छाती के पूर्वकाल के हिस्से को धीरे से निचोड़ें। फिर, शेष शव को पकवान के विपरीत दिशा में त्यागने के लिए संदंश का उपयोग करें, और बाद के पिल्ले को उसी तरीके से विच्छेदन करें। जब सभी पिल्ले को विच्छेदित कर दिया गया है, तो IFM फाइबर इकट्ठा करने के लिए संदंश का उपयोग करें, और फाइबर को काले विच्छेदन पकवान के तल पर एक ढेर में व्यवस्थित करें।किसी भी मलबे को देखने के क्षेत्र से बाहर धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें, और नमूनों से किसी भी गैर-IFM मांसपेशियों, वसा, क्यूटिकल्स या अन्य अवांछित ऊतकों को हटा दें। फिर, आईएफएम के ढेर को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक काटा हुआ पिपेट टिप का उपयोग करें जिसमें ठंडा पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर होते हैं। ४८ एच APF के बाद IFM विच्छेदन के लिए, एक हल्के से गीला तूलिका का उपयोग करने के लिए एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार डबल तरफा चिपचिपा टेप की एक पट्टी पर मंचन pupae हस्तांतरण ।एक लाइन में pupae ओरिएंट, वेंट्रल साइड नीचे, और स्लाइड के नीचे की ओर पूर्वकाल । जब सभी पिल्ले रखे गए हैं, तो पूर्वकाल सर्पिल के ऊपर पहला प्यूपल मामले को खोलने के लिए संदंश का उपयोग करें, और धीरे-धीरे पीछे की ओर, संदंश की एक जोड़ी स्लाइड करें, पुपल मामले को काटते हुए संदंश आगे बढ़ते हैं। खोले गए मामले से पिल्ला को मुक्त करें, और तुरंत पिल्ला को दूसरे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पीबीएस की एक बूंद में स्थानांतरित करें।जब सभी पिल्ले मुक्त हो जाएं, तो प्यूप के पेट को छाती से दूर काटने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें, और पेट को एक अलग ढेर में धकेल दें। जब सभी छाती हटा दी गई हैं, तो अधिकांश पीबीएस और पेट के ढेर को हटाने के लिए ऊतक कागज के एक टुकड़े का उपयोग करें। आधे में छाती को विभाजित करने के लिए एक ही गति में देशांतर शरीर धुरी के साथ सिर से काटने के लिए कैंची का उपयोग करने से पहले, शेष छाती के लिए ताजा, ठंडा PBS की एक बूंद जोड़ें ।जब सभी पिल्ले को विच्छेदित कर लिया गया हो, तो हेमीस्लेक्शन में से एक का चयन करने के लिए 5 संदंश का उपयोग करें, और धीरे-धीरे आईएफएम के बीच और नीचे एक संदंश के सुझाव डालें। अभी भी संदंश की पहली जोड़ी पकड़े हुए, ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए आईएफएम के एक छोर को क्यूटिकल और टेंडन से दूर काट, pupae १८० डिग्री घूर्णन से पहले, IFM के दूसरे छोर को क्यूटिकल और टेंडन से मुक्त करने की अनुमति देने के लिए । आईएफएम बंडल को छाती से पीबीएस बुलबुले के किनारे पर स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें, बंडल को जगह में रखने के लिए पानी के तनाव का उपयोग करें।फिर, स्लाइड के विपरीत दिशा में शव को धक्का, और उसी तरीके से आईएफएम के बाकी टुकड़े। जब सभी आईएफएम एकत्र किए गए हैं, तो किसी भी कूद मांसपेशी या क्यूटिकल टुकड़ों को हटाने के लिए 5 संदंश का उपयोग करें जो नमूनों में अपना रास्ता ढूंढ सकते हैं। फिर एक जोड़ी संदंश के बीच विच्छेदित आईएफएम को धीरे से कैप्चर करने के लिए पानी के तनाव का उपयोग करें, और आईएफएम को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्राइज ट्यूब में रखें जिसमें ठंडा पीबीएस का 250 माइक्रोलीटर होता है।ब्रूनो1 आईआर आईएफएम से एमआरएनए अनुक्रमण डेटा वाइल्डटाइप अनुक्रमण डेटा की तुलना में जीन-यूनिट स्तर पर अभिव्यक्ति में परिवर्तन दिखाता है। विच्छेदित आईएफएम पर पूरे प्रोटेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, प्रोटीन और प्रोटीन आइसोफॉर्म स्तर पर एक समान विनियमन देखा जाता है। एमएचसी के अंतिम इंट्रोन में प्रोटीन ट्रैप लाइन के सम्मिलन के बाद, जीएफपी-लेबल प्रोटीन का समावेश आईएफएम में 90 एच एपीएफ पर एम-लाइन के दोनों ओर दो बिंदुओं के रूप में देखा जा सकता है, जबकि पैर की मांसपेशियों के ऊतकों में जीएफपी संकेत को सरकोमेरे एम-लाइन के पार समान रूप से देखा जा सकता है।विच्छेदित आईएफएम पर आरटी-पीसीआर का उपयोग करते समय, जीएफपी-लेबल एक्सोन 34 से 37 ईपर 34 से 35 ईवेंट तक एक एमएचसी आइसोफॉर्म स्विच, 27 डिग्री सेल्सियस पर प्यूपरियम गठन के 30 से 48 घंटे के बीच पता लगाया जा सकता है। एमआरएनए अनुक्रमण डेटा, पैर और कूद मांसपेशियों के ऊतकों से सभी तीन Mhc आइसोफॉर्म व्यक्त करते हैं, परिपक्व मांसपेशियों में GFP लेबल आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति को बनाए रखने । दोनों Spalt प्रमुख उत्परिवर्ती और ब्रूनो1 आईआर-IFM, GFP लेबल Mhc isoform की अभिव्यक्ति बंद करने में विफल के रूप में वे विकसित, एक आइसोफॉर्म अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में जिसके परिणामस्वरूप पैर और कूद मांसपेशियों के ऊतकों की तरह ।याद रखें कि आरएनए क्षरण को रोकने के लिए विच्छेदन 30 मिनट के तहत किया जाना चाहिए। और, अन्य सेल प्रकारों द्वारा संदूषण को सीमित करने का ख्याल रखना। यह विधि आरटी-पीसीआर, या पश्चिमी ब्लॉटिंग जैसे जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के साथ-साथ ओमिक शैली के दृष्टिकोण जैसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण, क्रोमेटिन संरचना कैप्चर और मेटाबोलोमिक्स के लिए उपयुक्त आईएफएम-समृद्ध नमूने उत्पन्न करती है।ये विच्छेदन विकास और जीन विनियमन के मौलिक तंत्रों की जांच के लिए सिस्टम-स्तर के आंकड़ों के साथ ड्रोसोफिला में शक्तिशाली आनुवंशिक दृष्टिकोणों के पूरक हो सकते हैं ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

पेट में रंजकता को बढ़ाते हुए<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

उच्च वसा आहार खिलाने और उच्च प्रवाह Triacylglyceride परख में Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Drosophila भ्रूण और Tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर ऊतकों में सीटू संकरण में उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

जीनोम की पीढ़ी चौड़ा क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा पुस्तकालयों जल्दी Drosophila भ्रूण का मंचन

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

घूर्णन व्यायाम ठहराव प्रणाली (REQS) का उपयोग Drosophila melanogaster में व्यायाम के स्तर को मापने

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

TreadWheel: Drosophila melanogaster में धीरे प्रेरित व्यायाम के लिए अंतराल प्रशिक्षण प्रोटोकॉल

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

बढ़ाने का विच्छेदन कार्य मल्टीप्लेक्स CRISPR-आधारित बढ़ाने का प्रयोग सेल लाइंस में व्यवधान

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

विवो फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर में उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान करने के लिए

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

सेल डिवीजन के लाइव इमेजिंग के लिए Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

ड्रोसोफिला का उपयोग करके हेट्रोक्रोमेंटिन-को बढ़ावा देने वाली दवाओं की पहचान के लिए एक स्क्रीनिंग विधि

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...