Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Siamo grati ad Andreas Ladurner e Frank Schnorrer per il generoso sostegno. Ringraziamo Sandra Esser per l'eccellente assistenza tecnica e Akanksha Roy per aver generato i dati della spettrometria di massa. Riconosciamo i centri di borsa Bloomington e Vienna per la fornitura di mosche. Ringraziamo il Core Facility Bioimaging per l'aiuto con l'imaging confocale e il Proteinanalytik di .entrallabor per l'analisi dei campioni di spettrometria di massa, entrambi presso il Centro Biomedico LMU (Martinsried, DE). Il nostro lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), dal Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) presso la Ludwig-Maximilians-University M'nchen (MLS), dal Frederich-Bauer Stiftung (MLS) e dall'International Max Scuola di ricerca Planck (EN).

1. Staging pupae
<ol><li>Sollevare le mosche del genotipo desiderato in bottiglie (Figura 1E). O fare un nuovo capovolgimento del brodo di dissezione o impostare una croce con almeno 20 mosche vergini femminili. Mantenere le bottiglie fino a quando le mosche iniziano a pupate.</li>
	<li>Raccogliere pre-pupae con un pennello bagnato e trasferire su carta da filtro bagnata in una parabola Petri da 60 mm (Figura 1F).</li>
	<li>Sesso le pupe, raccogliendo il genere appropriato per l'esperimento(Figura 1G). I maschi sono identificati dalla presenza di testicoli, che appaiono come palle traslucide nella pupa altrimenti opaca.</li>
	<li>Etichettare il piatto Petri con l'ora, la data e il genotipo, quindi invecchiare le pupe fino allo stadio desiderato (Figura 1H). NOT:</</c8> Mantenere croci/stock e pupe di età in un'incubatrice a temperatura controllata (cioè 25 o 27 gradi centigradi per le croci di RNAi, poiché l'aumento dell'attività Gal4 a temperature più elevate aumenta l'efficienza di abbattimento40). Assicurarsi che l'umidità sia sufficientemente elevata in modo che le pupe non si asciughino quando invecchiano per diversi giorni.</li>
</ol>2. Dissezione IFM Prima di 48 h APF
<ol><li>Assemblare le attrezzature necessarie, tra cui due pinze di grado di biologia #5, una pipetta, punte pipette, ghiaccio secco e (per campioni di RNA) reagente di isolamento (vedere Tabella dei materiali). Inoltre, raffreddare piatti di sezionare nero (vedi Tabella dei materiali), 1x buffer salina con tampone salina con tamponamenti di fosfato (PBS) e tubi di microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando un pennello bagnato, trasferire le pupe in scena in un piatto di dissezione nero riempito circa due terzi con 1x PBS freddo (Figura 2A,B). Passare a un microscopio di dissecazione fluorescente. NOT:</</c2> Utilizzare il maggior numero di pupe come può essere sezionato all'interno di un 30 min intervallo di tempo. A seconda dell'esperienza, questo varia da 3 a 15 pupe. Vedere Metodi supplementari per la discussione delle alternative ai piatti neri che si disiziono.</li>
	<li>Utilizzando #5 pinze, spingere una delle pupe sul fondo di una parabola nera e regolare lo zoom del microscopio e la messa a fuoco per vedere chiaramente la pupa (Figura 2C).</li>
	<li>Afferrare l'anteriore della pupa con una pinze (Figura 2D), quindi colpire le pupe con una sola punta delle altre pinze leggermente fuori centro nell'addome, appena dietro il torace. Questo mantiene la pupa in posizione e impedisce agli IFM di muoversi nell'addome (Figura 2E). NOT:</</c4> Iniziare la temporizzazione della lunghezza della dissezione da questo punto, non appena l'integrità pupale viene interrotta. Utilizzare una lunghezza definita della dissezione (ad esempio 20-30 min) per ridurre al minimo la morte muscolare e i cambiamenti trascrittomici e proteomici associati. Dissezionare il maggior numero possibile di mosche in questo periodo di tempo.</li>
	<li>Utilizzando le prime pinze, rimuovere la metà anteriore della custodia pupal (Figura 2F).</li>
	<li>Utilizzare le stesse pinze per pizzicare le pupe esposte appena dietro il torace e separare l'addome dal torace (Figura 2G).</li>
	<li>Utilizzando le pinze, spremere delicatamente la parte anteriore del torace (per l'APF di <35 h) o strappare il torace per esporre gli IFM fluorescenti (Figura 2H). Gli IFM si staccano facilmente dall'epidermide, poiché gli attacchi tendini nei primi tempi sono fragili. Scartare la carcassa rimanente usando le pinze per spingerlo sul lato opposto del piatto.</li>
	<li>Ripetendo i passaggi 2.3–2.7, sezionare le pupe aggiuntive.</li>
	<li>Raccogliere le fibre IFM con pinze e organizzarle in una pila nella parte inferiore del piatto di dissezione nera (Figura 2I,J). Rimuovere eventuali detriti spingendolo fuori dal campo visivo utilizzando pinze. NOT:</</c2> Con la pratica, le punte delle pinze possono essere portate in prossimità senza toccarsi a vicenda. Questa tecnica può essere utilizzata per afferrare liberamente gli IFM senza distruggerli. I metodi alternativi includono spingere delicatamente o sollevare gli IFM con una sola punta o pinze completamente chiuse, o prendere del grasso o altro tessuto con IFM e rimuovere il grasso come descritto al punto 2.10.</li>
	<li>Controllo di qualità del campione muscolare IFM, utilizzando le pinze per rimuovere i muscoli non IFM, grasso, cuticola, ecc dal campione (Figura 2K, L). NOT:</</c2> Con Mef2-Gal4, IFM è etichettato più fortemente di altri tipi di muscolo nei primi tempi (Figura 2K, K'),consentendo la rimozione dei muscoli del salto e dei muscoli larvali in base all'intensità di fluorescenza e alla forma muscolare. Il tessuto grasso e cuticolario ha un aspetto diverso e non sono etichettati con un'etichetta di fluorescenza specifica per il muscolo (Figura 2K, K'). Vedere la sezione discussione per altre righe Gal4 che etichettano IFM.</li>
	<li>Utilizzando una punta di pipetta tagliata, trasferire la pila di IFM in un tubo di microcentrismo di 1,5 mL riempito con 250 -L di 1x pbx(Figura 2M-O). Procedere immediatamente alla sezione 4. NOT:</</c2> I campioni IFM possono essere persi semplicemente attaccandosi al lato della punta della pipetta. Il bufferttamento su e giù più volte prima di raccogliere IFM può rendere le punte standard meno appiccicose e le punte siliconizzate o perfluoroalkoxy (CLA)con tensioni superficiali più basse possono aiutare a prevenire la perdita del campione.</li>
</ol>3. Dissezione IFM dopo 48 h APF
<ol><li>Assemblare le attrezzature necessarie, tra cui due pinze di grado #5, forbici fini, vetrini standard al microscopio in vetro, nastro adesivo, pipetta, punte di pipetta, ghiaccio secco e (per applicazioni di RNA) reagente di isolamento (vedere Tabella dei materiali). Raffreddare i tubi 1x PBS e microcentrifuga sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando un pennello leggermente bagnato, trasferire le pupe in scena in una striscia di nastro adesivo a due lati montato su un vetrino al microscopio (Figura 3A). Posizionare le pupe in una linea orientata nello stesso orientamento (ventrale verso il basso e anteriore verso la parte inferiore della diapositiva). NOT:</</c2> Fare attenzione a non usare troppa acqua sul pennello o sul filtro, altrimenti le pupe non si attaccano bene. Se le pupe non si attaccano, asciugarle prima trasferendole su un filtro asciutto o su carta velina. Montare il maggior numero di pupe come può essere sezionato all'interno di una finestra di tempo di 30 min, idealmente pupe da 10 dollari.</li>
	<li>Rimuovere la pupa dalla custodia del pupali. Utilizzare pinze per prendere in giro e aprire il caso pupali sopra gli spiracoli anteriori (Figura 3B).</li>
	<li>Far scorrere delicatamente un paio di pinze dorsalmente verso il posteriore, tagliando la cassa pupa mentre le pinze si muovono (Figura 3B '). Fare attenzione a non rompersi la pupa sottostante. Liberare la pupa dalla custodia aperta e trasferirla immediatamente a una goccia di 1x PBS su un secondo vetrino (Figura 3B",C).</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.3 e 3.4 per tutte le pupe della linea, quindi impostare la diapositiva a doppio nastro da parte.</li>
	<li>Utilizzando le forbici fini, tagliare l'addome della pupa lontano dal torace e spingerlo in un mucchio separato (Figura 3D,D'). Ripetere l'operazione per le pupe rimanenti. NOT:</</c2> Iniziare a cronometrare la lunghezza della dissezione con il passaggio 3.6, non appena l'integrità pupa viene interrotta. Disseziona il maggior numero possibile di mosche in 20-30 min per prevenire la morte cellulare e i cambiamenti trascrittomici e proteomici associati. Quando si seziona 1 d adulti o >90 h pupae, è spesso conveniente per i passaggi successivi per rimuovere ulteriormente la testa con le forbici fini.</li>
	<li>Utilizzando una carta velina, rimuovere la maggior parte del 1x PBS (generalmente nuvoloso con grasso sospeso) così come la pila di addome (Figura 3E). Aggiungere una goccia di 1x PBS fresco e refrigerato ai restanti thoraxes.</li>
	<li>Utilizzare le forbici per tagliare il torace a metà (Figura 3F,F')tagliando dalla testa lungo l'asse longitudinale del corpo in un unico movimento. In alternativa, se la testa è stata rimossa, inserire prima le forbici in cui la testa era attaccata e tagliare la metà superiore del torace longitudinalmente tra gli IFM. Quindi, tagliare il lato ventrale del torace con un secondo taglio nello stesso orientamento.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.7 e 3.8 per tutte le pupe da sezionare, generando una pila di emisezioni torace vicino al centro della diapositiva. Assicurarsi che sul vetrino sia presente 1x PBS sufficiente affinché le emisezioni non si asciughino. NOT:</</c0> Dopo 48 h APF, gli IFM sono abbastanza grandi da essere visibili al microscopio standard di sezionamento all'occhio allenato. A questo punto del protocollo, i muscoli con un'etichetta fluorescente possono essere spostati in un ambito di dissezione fluorescente per facilitare l'identificazione IFM o per scopi di allenamento, ma ciò non è necessario.</li>
	<li>Dissezionare gli IFM fuori dal torace. Isolare una delle emisezioni utilizzando le pinze #5 (Figura 3G,H). Inserire delicatamente le punte di una pinza sopra e sotto il centro degli IFM (Figura 3G',H'). Tenendo le prime pinze ancora, utilizzare forbici sottili per tagliare un'estremità del IFM lontano dalla cuticola e tendini. Quindi, tagliare l'altra estremità del IFM libero dalla cuticola (Figura 3G'',H''). NOT:</</c6> A seconda dell'orientamento del torace dopo il primo taglio IFM, è utile ruotare il torace di 180 gradi in modo che il secondo taglio IFM sia più facile da eseguire.</li>
	<li>Rimuovere il fascio IFM dal torace con pinze (Figura 3G''',H'''),trasferendolo al bordo della bolla PBS per utilizzare la tensione dell'acqua per tenerlo in posizione (Figura 3I). Spingere la carcassa sul lato opposto del vetrino. Ripetere l'operazione per gli altri emisezioni toraciche, generando una raccolta di IFM sezionati. NOT:</</c4> Se gli IFM non rimangono in una pila ordinata, rimuovere parte del 1x PBS con un tessuto. Fare attenzione a non far evaporare tutti i PBS e assicurarsi che gli IFM e gli emithoraxes sezionati rimangano coperti da tamponamento.</li>
	<li>Dopo aver sezionato tutti gli IFM, eseguire rapidamente un controllo di qualità sul muscolo sezionato. Utilizzando #5 forceps, rimuovere eventuali frammenti di jump muscle o cuticle che potrebbero aver trovato la loro strada nel campione (Figura 3J-K''). NOT:</</c2> Il muscolo di salto appare diverso da IFM. Se si dissigella Mef2-Gal4 etichettato muscolo sotto fluorescenza, salto muscolare ha una fluorescenza più debole e una forma e una consistenza diversa. Sotto la luce normale, appare quasi traslucido mentre gli IFM sono un giallo opaco e lattiginoso(Figura 3J-J',K).</li>
	<li>Utilizzando la tensione dell'acqua, catturare (ma non schiacciare) gli IFM sezionati tra una coppia di pinze (Figura 3L). Trasferire gli IFM in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL pre-riempito con 250 - L di 1x PBS refrigerato(Figura 3M). Procedere immediatamente con la sezione 4. NOT:</</c4> Quando le punte di pinzetta vengono portate in prossimità l'una dell'altra e sollevate da una soluzione tampone, la tensione dell'acqua provoca la cattura di una bolla di tampone tra le punte delle pinze. Se gli IFM sono presenti anche in questa bolla, possono essere sollevati dalla soluzione e facilmente trasferiti in un altro recipiente riempito da buffer. È importante spremere le pinze per portare le punte l'una vicino all'altra senza toccarsi l'un l'altro, per evitare di macerare il tessuto catturato nella bolla tampone.</li>
</ol>4. Pellet e conservazione del campione IFM
<ol><li>Pellet l'IFM centrifugando il tubo di microcentrifuga da 1,5 mL per 3-5 min a 2.000 x g in una centrifuga da tavolo (Figura 4A,B).</li>
	<li>Rimuovere il buffer utilizzando una punta pipetta (Figura 4C).
</li>
	<li>Per le applicazioni di RNA, risospendere il pellet IFM in 50-100 - L del buffer di isolamento RNA desiderato (vedere Tabella dei materiali, Figura 4D). In caso contrario, procedere al passaggio 4.4. NOT:</</c9> Gli IFM possono essere congelati a secco dopo il passaggio 4.2 per preparazioni di spettrometria di massa o l'isolamento dell'RNA con kit commerciali (vedi risultati rappresentativi). Per le applicazioni di RNA, si ottengono risultati migliori rinviando immediatamente e congelando il pellet IFM nel buffer di isolamento.</li>
	<li>Congelare il campione sul ghiaccio secco o congelare lo snap in azoto liquido (Figura 4E). Conservare a -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per i passaggi successivi nella preparazione del campione per l'analisi a valle. NOT:</</c12> Dopo la crioconservazione, i campioni possono essere conservati per diversi mesi prima dell'elaborazione per l'indagine a valle.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, presentiamo la tecnica di base per sezionare gli IFM della Drosophila dalle pupe in fase avanzata e tardiva per l'isolamento a valle di proteine, DNA, RNA o altre macromolecole. Il protocollo può essere facilmente adattato per sezionare IFM da mosche adulte. Dimostriamo l'utilità del nostro protocollo di dissezione per applicazioni mRNA-Seq, proteomica e RT-PCR. Con il continuo miglioramento delle tecnologie omiche per consentire l'analisi di campioni con meno materiale di partenza e concentrazioni di ingresso inferiori, queste dissezioni diventeranno probabilmente preziose per molte applicazioni aggiuntive. Poiché gli IFM sono un modello consolidato per le miopatie umane4,24 e sviluppo specifico di tipo muscolare9,12, prevediamo, ad esempio, metabolomica arricchita di IFM, indagini sulla conformazione della cromatina tramite 3C o 4C, splicing network evaluation via CLiP interazioni o fosfo-proteomica della miofibrillogenesi.
È importante considerare che queste dissezioni producono un campione arricchito per IFM invece di un campione IFM puro. Questo è inevitabile a causa dell'innervazione del neurone motorio, degli attacchi tendini e dell'invasione tracheale delle fibre muscolari. L'analisi bioinformatica può essere utilizzata per identificare geni o proteine arricchite da IFM, ma sono necessari ulteriori esperimenti per dimostrare che sono in realtà specifici di IFM. La purezza del campione può essere analisi utilizzando marcatori specifici del tessuto pubblicati come Stripe45 (tend), Act79B4,44 (muscolo tubolare), Act88F15 (IFM) o syb46 (specifico neuronale). Potrebbe essere possibile utilizzare tali marcatori per normalizzare i set di dati in base al contenuto specifico di IFM, ma gli utenti sono avvertiti che i cambiamenti temporali nell'espressione dei geni utilizzati per la normalizzazione, ad esempio dei geni specifici di IFM o della tubulina, possono pregiudicare tale approccio.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di etichettatura specifica del tessuto codificati geneticamente, ad esempio l'etichettatura CE47,48 o49,50 per isolare l'RNA, il che può contribuire a campione di RNA specifico del tessuto. Tuttavia, il marcatura CE richiede l'alimentazione costante delle mosche47 e pertanto non è applicabile durante le fasi pupali. La sensibilità e la completezza dei trascrittomi con etichetta PABP possono avere limitazioni51. Gli approcci FACS per isolare le singole fibre muscolari sono complicati dalle grandi dimensioni e dalla natura sinciziale degli IFM. INTACT52,53 approcci di stile possono essere applicati per isolare specifici compartimenti subcellulari dagli IFM, che possono rivelarsi utili per isolare le popolazioni pure di nuclei IFM o mitocondri. Le dissezioni manuali sono ancora lo standard attuale per ottenere tessuto IFM intatto per la maggior parte delle applicazioni a valle.
La qualità del campione dipende da diversi passaggi critici del processo di dissezione. Le dissezioni sono tecnicamente impegnative, con la velocità di dissezione e la purezza del campione che aumenta con l'esperienza. Il dissezione per brevi periodi di tempo (20-30 min) in tamponamento refrigerato senza detersivo e congelo immediato aiuta a preservare l'integrità del campione, come è stato osservato in precedenza per l'isolamento del tendine del topo54. Gli IFM possono essere congelati a secco dopo aver rimosso tutto il buffer dal pellet, ma in particolare per l'isolamento dell'RNA, il congelamento dei campioni nel buffer di isolamento tende a produrre risultati migliori. Gli IFM da un massimo di 20 dissezioni separate vengono combinate prima dell'isolamento dell'RNA o delle proteine, consentendo il ridimensionamento e la raccolta di materiale sufficiente, anche dai primi tempi o mutanti16,32, per l'analisi a valle.
Per le applicazioni dell'RNA, il passo più critico può essere l'isolamento dell'RNA stesso. Il gelidio thiocyanate-phenol-chloroformio (metodo 1 sopra) supera la maggior parte dei kit commerciali testati e, come osservato in precedenza, è considerevolmente meno costoso55. La variabilità osservata nei rendimenti di isolamento dell'RNA con kit commerciali è in accordo con le precedenti osservazioni56,57. Aggiungiamo ulteriormente il glicogeno durante le precipitazioni isopropanolo per aiutare a recuperare tutto l'RNA. Oltre alla resa dell'RNA, è importante verificare l'integrità dell'RNA per garantire che il campione non sia stato frammentato o degradato durante i processi di dissezione e isolamento. È inoltre essenziale lavorare senza RNase. Infine, la scelta di RT-kit può influire sulla sensibilità del processo di trascrizione inversa. Anche se non spesso discusso in dettaglio, tutti questi punti influenzano la qualità del campione IFM e i dati ottenuti dalle applicazioni a valle.
Diverse importanti modifiche distinguono il protocollo dai protocolli di dissezione IFM esistenti. Sebbene esista un protocollo di dissezione dettagliato per l'immunofluorescenza IFM19, questo protocollo presenta un approccio diverso alle dissezioni puupali che consente un più rapido isolamento del tessuto IFM. Ciò consente la raccolta di grandi quantità di tessuto IFM (relativamente parlando) con tempi di dissezione limitati per prevenire cambiamenti di proteoma o trascrittoma. Altri protocolli descrivono la dissezione dell'IFM adulto per visualizzare la colorazione GFP nelle singole miofibrille39 o per la colorazione dei muscoli larvali della parete del corpo58, ma non affrontano la dissezione nelle fasi puiche o per l'isolamento di RNA o proteina. Questo approccio è anche distinto dal protocollo esistente per la microdisezione degli IFM pupali da criosezioni38, che può generare un campione IFM più puro, ma è più laborioso e produce meno materiale. Rispetto ad altri protocolli rapidi di dissezione IFM adulti38,39, IFM sono isolati in PBS buffer senza detersivo per limitare l'induzione dello stress e altre principali modifiche di espressione.
Il progresso chiave di questo protocollo è l'inclusione di un reporter vivo e fluorescente, che consente l'isolamento degli IFM nelle prime fasi pupali. Usiamo standardmente Mef2-GAL459 alla guida UAS-CD8::GFP o UAS-GFP::Gma60. Ciò consente l'etichettatura differenziale di IFM (i muscoli del volo sono più fortemente etichettati e dalla forma diversa rispetto ad altri muscoli pupali) così come le prestazioni delle manipolazioni basate su GAL4-UAS, ad esempio gli esperimenti di salvataggio o RNAi. È anche possibile combinare Mef2-GAL4 con tub-GAL80ts per evitare la letalità precoce associata all'RNAi o con UAS-Dcr2 per aumentare l'efficienza dell'RNAi40.
Sono disponibili driver GAL4 o GFP aggiuntivi che variano in termini di specificità del tipo di muscolo, modello di espressione temporale e forza del driver19,61 che possono essere utilizzati al posto di Mef2-GAL4. Ad esempio, Act88F-GAL4 viene prima espresso intorno a 24 h APF, quindi non può essere utilizzato per timepoint precedenti; tuttavia, etichetta fortemente IFM e può essere utile per evitare la letalità precoce associata all'RNAi. Lui-GFP o Act88F -Etichetta GFPIFM, sempre con restrizioni temporali, ma evitano la dipendenza GAL4 di espressione marcatore e può essere utile in combinazione con un background mutante di interesse. Sono disponibili elenchi di altre possibili linee di marker19. Va anche notato che l'uso di transgeni e del sistema GAL4/UAS può causare artefatti di espressione genica, quindi è importante utilizzare controlli appropriati, ad esempio la linea di guida attraversata per la deformazione di fondo di tipo selvaggio, in modo che tali artefatti siano presumibilmente lo stesso in tutti i campioni.
Con il video di accompagnamento, questo protocollo dettagliato mira a rendere più accessibile la dissezione IFM pulatale e promuovere l'uso di approcci omici per studiare lo sviluppo muscolare. L'accoppiamento del potere della genetica della Drosophila e della biologia cellulare con i saggi di biochimica e omica accessibili attraverso l'IFM sezionato ha il potenziale per far progredire la comprensione meccanicistica della miogenesi e delle funzioni muscolari. Studi futuri che collegano le osservazioni a livello di sistemi della regolazione del trascrittoma e del proteoma alle uscite metaboliche e funzionali forniranno una comprensione più profonda dello sviluppo specifico del tipo muscolare e della patogenesi dei disturbi muscolari.

Le moderne tecnologie omiche forniscono importanti informazioni sullo sviluppo muscolare e sui meccanismi alla base dei disturbi muscolari umani. Ad esempio, l'analisi dei dati relativi alla trascrittomica combinata con la verifica genetica e biochimica nei modelli animali ha rivelato che la perdita del fattore di giunzione RBM20 causa cardiomiopatia dilatata a causa della sua regolamentazione di una rete target di oltre 30 sarcomere geni precedentemente associati a malattie cardiache, tra cui titin1,2,3.
In un secondo esempio, studi di coltura cellulare, modelli animali e pazienti umani hanno dimostrato che la distrofia miotonica è causata da un'interruzione della regolazione dell'RNA a causa del sequestro di Muscleblind (MBNL) e dall'upregulation di CELF14,5. Le dinamiche interregolatorie e temporali tra MBNL e CELF1 (chiamate anche CUGBP1 o Bruno-Like 2) aiutano a spiegare i persistenti modelli di giunzione embrionale nei pazienti con distrofia miotonica. Inoltre, la vasta rete di bersagli malregolamentati aiuta a spiegare la natura complessa della malattia4,6,7,8. La maggior parte di questi studi utilizza approcci omici negli organismi modello genetico per comprendere i meccanismi alla base della malattia muscolare umana. Inoltre, evidenziano l'importanza di comprendere prima l'espressione genica temporale e tissutale specifica, la modificazione delle proteine e i modelli metabolici nel muscolo sano per comprendere le alterazioni nel muscolo malato o invecchiamento.
La Drosophila melanogaster è un altro organismo modello genetico ben consolidato. La struttura del sarcomero e dei singoli componenti sarcomeri sono altamente conservati dalle mosche ai vertebrati4,9,10, e i muscoli indiretti di volo (IFM) sono diventati un potente modello da studiare molteplici aspetti dello sviluppo muscolare11,12. In primo luogo, i muscoli di volo fibrillar sono funzionalmente e morfologicamente distinti dai muscoli tubolari del corpo11,13, consentendo lo studio di meccanismi di sviluppo specifici di tipo muscolare. Fattori di trascrizione tra cui Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd) e Homothorax (Hth)15 sono stati identificati come regolatori del destino fibrillare. Inoltre, a valle di Salm, l'omologa CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programma di giunzione specifico per fibrillare16,17.
In secondo luogo, gli IFM sono un modello importante per comprendere il processo stesso della miogenesi, dalla fusione del mioblasto e l'attaccamento del miotubo alla miofibrillogenesi e alla maturazione sarcomere9,18,19. In terzo luogo, la genetica della Drosophila consente di studio i contributi di singole proteine, domini proteici e isoforme proteiche alla formazione, alla funzione e alle proprietà biofisiche20,21,22 ,23. Infine, sono stati sviluppati modelli IFM per lo studio di molteplici disturbi muscolari umani, come distrofia miotonica, miocellio, disturbi degenerativi muscolari, actinopatie, ecc.24,25,26 ,27, e hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi della malattia e sulle potenziali terapie28,29,30. Così, la Drosophila è un modello utile per affrontare molte questioni aperte nel campo della miogenesi, compresi i meccanismi di trascrizione specifica di tipo muscolare, splicing e regolazione della cromatina, così come al ruolo del metabolismo nello sviluppo muscolare. L'applicazione delle moderne tecnologie omiche, in particolare in combinazione con l'ampia varietà di analisi biologiche genetiche, biochimiche e cellulari disponibili in Drosophila,ha il potenziale per far progredire drasticamente la comprensione dei muscoli sviluppo, invecchiamento e malattia.
Gli IFM sono i muscoli più grandi della mosca, che si estende per quasi 1 mm su tutta la lunghezza del torace negli adulti31,32. Tuttavia, questa piccola dimensione genera la sfida di ottenere un campione sufficiente per applicare le tecnologie omiche nella Drosophila in modo specifico. Inoltre, gli IFM fanno parte della muscolatura adulta che si forma durante le fasi pupali. I mioblasti si fondono per formare miotubi, che si attaccano ai tendini circa 24 h dopo la formazione del puparium (APF) e subiscono un passo di compattazione necessario per avviare la miofibrillogenesi intorno a 30 h APF (Figura 1A-D)18,33, 34.
Le miofibre poi crescono fino a coprire l'intera lunghezza del torace, con miofibrille in fase di crescita iniziale focalizzata sull'aggiunta di sarcomero fino a circa 48 h APF, per poi passare a una fase di maturazione, in cui i sarcomecomeres crescono in lunghezza e larghezza e sono rimodellato per stabilire l'attivazione dell'estensione di 72 h APF (Figura 1A-D)32,35. L'insorgenza della maturazione della fibra è controllata almeno in parte da Salm ed E2F32,36,37,e molteplici isoforme proteiche sarcomere specifiche IFM la cui giunzione è controllata da Bru1 sono incorporate durante questo fase16,17. Le mosche mature schiudono da 90-100 h APF. Ciò significa che per studiare lo sviluppo muscolare, IFM deve essere isolato con sufficiente quantità, qualità e purezza da più tempi pupali per facilitare l'analisi utilizzando approcci omici.
Sono stati pubblicati diversi protocolli per la dissezione IFM. Sebbene questi protocolli funzionino bene per le applicazioni previste, nessuno è ideale per gli approcci omici. I protocolli che conservano la morfologia IFM per immunofluorescenza degli IFM pupali e adulti19, isolano le fibre IFM per la valutazione meccanica31o utilizzano la microdissezione dell'IFM pupalo da criosezioni38 sono troppo specializzati e manodopera per ottenere ragionevolmente quantità sufficienti di tessuto IFM per applicazioni omiche. Altri protocolli sono stati sviluppati per la rapida dissezione di IFM38,39 , specificamente adulti,39, quindi non sono applicabili alle fasi puidiche e utilizzano buffer che non sono ideali o possono essere incompatibili con, ad esempio, l'isolamento dell'RNA. Pertanto, è necessario sviluppare nuovi approcci per isolare l'IFM pupalo per applicazioni biochimiche o omiche.
Qui presentiamo un protocollo per la dissezione di IFM durante le fasi pupali che è stato utilizzato con successo per l'analisi mRNA-Seq da 16 h APF attraverso gli stadi adulti16,32. Il protocollo impiega un'etichetta verde di proteine fluorescenti (GFP) per identificare gli IFM in tutte le fasi dello sviluppo pupa e adulto, consentendo la dissezione dal vivo al microscopio di dissezione fluorescente. L'approccio è meno laborioso, con una velocità effettiva superiore rispetto ai protocolli di dissezione IFM esistenti. Ciò consente un rapido isolamento e crioconservazione dei campioni, generando abbastanza materiale dopo diversi cicli di dissezione per gli approcci omici nonché per la reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa standard (RT-PCR) o gonfiore occidentale.
Vi presentiamo il protocollo in due parti, dimostrando come sezionare rapidamente IFM sia prima di 48 h APF (durante la metamorfosi precoce, quando gli allegati IFM sono più tenui) e dopo 48 h APF (quando il piano del corpo pupali e gli allegati IFM sono ben definiti). Dimostriamo che possiamo isolare l'RNA di alta qualità dagli IFM sezionati in tutti i momenti e presentare i dati sui diversi approcci all'isolamento dell'RNA e alla trascrizione inversa. Infine, dimostriamo l'applicazione del protocollo di dissezione a mRNA-Seq, spettrometria di massa e RT-PCR usando l'omologa CELF1 Bruno1 come esempio. Mostriamo la mancata espressione delle isoforme proteiche sarcomere nei dati proteomici di Bruno1 mutant IFM ed esaminiamo la regolazione Bruno1 dell'evento di giunzione del terminale C della catena pesante Myosin (Mhc). Questi risultati illustrano come i dati omici possono fornire una comprensione più profonda dei fenomeni biologici, integrando esperimenti genetici e biochimici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Il muscolo di volo della Drosophila è un potente modello per studiare processi diversi come la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia, che influenzano tutti lo sviluppo muscolare e la mioribrillogenesi. I dati omici, come quelli generati dalla spettrometria di massa o dal sequenziamento profondo, possono fornire importanti informazioni meccanicistiche su questi processi biologici. Per tali approcci, è utile analizzare campioni specifici dei tessuti per aumentare sia la selettività che la specificità delle impronte digitali omiche. Qui presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo fluorescente dalle pupe vive per generare campioni muscolari altamente arricchiti per applicazioni omiche. Descriviamo innanzitutto come sezionare i muscoli di volo nelle prime fasi puiche (<48 h dopo la formazione del puparium [APF]), quando i muscoli sono distinguibili dall'etichettatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP). Descriviamo quindi come sezionare i muscoli delle pupe tardive (>48 h APF) o degli adulti, quando i muscoli sono distinguibili al microscopio dissezioso. Il protocollo video di accompagnamento renderà queste dissezioni tecnicamente impegnative più ampiamente accessibili alle comunità di ricerca muscolari e della Drosophila. Per le applicazioni dell'RNA, esaminiamo la quantità e la qualità dell'RNA che può essere isolata in diversi momenti temporali e con approcci diversi. Dimostriamo inoltre che Bruno1 (Bru1) è necessario per uno spostamento temporale nello splicing della catena pesante della miosina(Mhc),dimostrando che i muscoli sezionati possono essere utilizzati per mRNA-Seq, spettrometria di massa e reazione a catena di trascrittorione inversa (RT-PCR) Applicazioni. Questo protocollo di dissezione contribuirà a promuovere analisi omiche specifiche dei tessuti e può essere generalmente applicato per studiare molteplici aspetti biologici della miogenesi.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Il muscolo di volo della Drosophila è un modello potente per studiare la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo con etichettafluere fluorescente dalle pupe vive per generare campioni altamente arricchiti ideali per la proteomica e il sequenziamento profondo. Questi campioni possono offrire importanti approfondimenti meccanicistici su diversi aspetti dello sviluppo muscolare.

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Il protocollo facilita la dissezione del muscolo di volo indiretto etichettato GFP dalla Drosophila in vari punti di tempo durante lo sviluppo delle pupe per valutare i cambiamenti nell'espressione genica e proteica. Utilizzando queste tecniche, è possibile ottenere un campione muscolare di volo ad alto arricchimento con una minima degradazione delle proteine dell'RNA adatto per approcci RT-PCR, western blot o omic. Queste dissezioni specializzate richiedono pratica e abilità, ma il numero di pupe che possono essere sezionate e la qualità dei campioni migliorano con l'esperienza.La dimostrazione visiva di questa dissezione è fondamentale per determinare come distinguere i muscoli di volo dai tessuti non muscolari e facilitare il rapido isolamento dei muscoli di volo dagli esemplari pupali. Per in scena le pupe, utilizzare un pennello bagnato per raccogliere e trasferire pre-pupe in una piastra di Petri di 60 millimetri e fare sesso con le pupe al microscopio binoculare. I maschi sono identificati dalla presenza di teste, che appaiono come globi traslucidi sulle pupe altrimenti opache.Dopo aver etichettato il piatto con l'ora, la data e il genotipo delle mosche, invecchiare le pupe in un'incubatrice da 25 a 27 gradi Celsius fino allo stadio appropriato. Per la dissezione IFM prima di 48 H APF, utilizzare un pennello bagnato per trasferire le pupe opportunamente messe in scena in un piatto di sezionatura nera circa 2/3 riempito con PBS refrigerato. Sotto il microscopio di sezionamento fluorescente, utilizzare un 5 forcep per spingere una delle pupe sul fondo del piatto di sezionazione nero.Regolare lo zoom e la messa a fuoco del microscopio fino a quando le pupe non possono essere chiaramente visualizzate. Usando un paio di forcep per afferrare la parte anteriore delle pupe, colpisce le pupe con una singola punta di un secondo paio di forcep, leggermente fuori centro nell'addome, appena dietro il torace. Utilizzare il primo paio di forcep per rimuovere la metà anteriore della custodia pupale e per pizzicare le pupe esposte appena dietro il torace per separare l'addome dal torace.Quindi, spremere delicatamente la parte anteriore del torace per esporre gli IFM etichettati fluorescentmente. Quindi, utilizzare le forcep per scartare la carcassa rimanente sul lato opposto del piatto e sezionare le pupe successive nello stesso modo. Quando tutte le pupe sono state sezionate, utilizzare le forcep per raccogliere le fibre IFM e organizzare le fibre in una pila nella parte inferiore del piatto di sezionazione nero.Utilizzare le forcep per spingere eventuali detriti fuori dal campo visivo e rimuovere eventuali muscoli non IFM, grasso, cuticole o altri tessuti indesiderati dai campioni. Quindi, utilizzare una punta di pipetta ritagliata per trasferire la pila di IFM in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS refrigerato. Per la dissezione IFM dopo 48 H APF, utilizzare un pennello leggermente bagnato per trasferire le pupe messe in scena su una striscia di nastro adesivo a doppia parte montato su uno scivolo al microscopio.Orientare le pupe in una linea, lato ventrale verso il basso e anteriore verso il fondo dello scivolo. Quando tutte le pupe sono state posizionate, utilizzare le flessori per prendere in giro e aprire il primo caso pupale sopra gli spiracoli anteriori e far scivolare delicatamente un paio di forcep dorsalmente, verso il posteriore, tagliando la custodia pupale mentre le forcep si muovono. Libera le pupe dalla custodia aperta e trasferisci immediatamente le pupe in una goccia di PBS su un secondo scivolo al microscopio.Quando tutte le pupe vengono liberate, utilizzare forbici fini per tagliare l'addome delle pupe lontano dal torace e spingere gli addome in una pila separata. Quando tutti i torace sono stati rimossi, utilizzare un pezzo di carta velina per rimuovere la maggior parte del PBS e la pila di addome. Aggiungere una goccia di PBS fresco e refrigerato ai torace rimanenti, prima di utilizzare le forbici per tagliare dalla testa lungo l'asse longitudinale del corpo in un unico movimento per dividere il torace a metà.Quando tutte le pupe sono state sezionate, utilizzare le 5 forcep per selezionare una delle emisezioni e inserire delicatamente le punte di una forza sopra e sotto il centro degli IFM. Tenendo fermo il primo paio di forcep, utilizzare forbici fini per tagliare un'estremità dell'IFM lontano dalla cuticola e dai tendini, prima di ruotare le pupe di 180 gradi, per consentire all'altra estremità dell'IFM di essere tagliata libera dalla cuticola e dai tendini. Utilizzare le forcep per trasferire il fascio IFM dal torace al bordo della bolla PBS, utilizzando la tensione dell'acqua per mantenere il fascio in posizione.Quindi, spingere la carcassa sul lato opposto della diapositiva e sezionare il resto degli IFM nello stesso modo. Una volta raccolti tutti gli IFM, utilizzare le 5 forcep per rimuovere eventuali frammenti di muscoli di salto o cuticola che potrebbero aver trovato la loro strada nei campioni. Quindi utilizzare la tensione dell'acqua per catturare delicatamente gli IFM sezionati tra un paio di forcep e posizionare gli IFM in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS refrigerato.I dati di sequenziamento dell'mRNA degli IFM IR BRUNO1 mostrano cambiamenti nell'espressione a livello di unità genica rispetto ai dati di sequenziamento dei tipi selvatici. Utilizzando la spettrometria di massa del proteoma intero sugli IFM sezionati, si osserva una regolazione simile ai livelli di isoformi proteici e proteici. Dopo l'inserimento di una linea di trappola proteica nell'introne finale di Mhc, l'incorporazione della proteina etichettata GFP può essere osservata in IFM come due punti su entrambi i lati della linea M a 90 H APF, mentre nel tessuto muscolare delle gambe il segnale GFP può essere osservato uniformemente attraverso la linea M del sarcomero.Quando si utilizza RT-PCR su IFM sezionato, è possibile rilevare un interruttore isoformico Mhc dall'evento esone 34 a 37 con etichetta GFP all'evento esone non etichettato da 34 a 35, tra 30 e 48 ore dopo la formazione del puparium a 27 gradi Celsius. Dai dati di sequenziamento dell'mRNA, i tessuti muscolari delle gambe e del salto esprimono tutte e tre le isoforme Mhc, mantenendo l'espressione dell'isoforma etichettata GFP nel muscolo maturo. Sia spalt mutante maggiore che BRUNO1 IR-IFM, non sono riusciti a disattivare l'espressione dell'isoforma Mhc etichettata GFP mentre si sviluppano, risultando in un profilo di espressione isoforma simile a quello del tessuto muscolare gamba e salto.Ricorda che le dissezioni devono essere eseguite in meno di 30 minuti per prevenire la degradazione dell'RNA. E, per fare attenzione a limitare la contaminazione da altri tipi di cellule. Questo metodo genera campioni arricchiti di IFM adatti ad approcci biochimici come RT-PCR, o western blotting, così come approcci di stile omico, come spettrometria di massa, sequenziamento ad alta velocità effettiva, acquisizione della conformazione della cromatina e metabolomica.Queste dissezioni possono integrare i potenti approcci genetici in Drosophila con dati a livello di sistema per indagare i meccanismi fondamentali dello sviluppo e della regolazione genica.

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