Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

アンドレアス・ラドゥルナーとフランク・シュノーラーの寛大な支援に感謝します。我々は、優れた技術支援と質量分析データを生成するためのアカンクシャロイのためのサンドラ・エッサーに感謝します。我々は、ハエを提供するためのブルーミントンとウィーンのストックセンターを認めます。我々は、LMUバイオメディカルセンター(マーティンスリード、DE)の両方で質量分析サンプルの分析のための共焦点イメージングとゼントララボフュルプロテナリティックの助けをコアファシリティバイオイメージングに感謝します。私たちの研究は、ドイツのフォルシュン・ゲミンシャフト(MLS、SP 1662/3-1)、ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン(MLS)の統合タンパク質科学ミュンヘンセンター(CIPSM)、フレデリッヒ・バウアー・スティフトゥン(MLS)、インターナショナル・マックスによって支えられた。プランク研究学校(EN)。

1. プパエのステージング
<ol><li>ボトル内の所望の遺伝子型のハエを上げる(図1E)。解剖ストックの新鮮なフリップを作るか、少なくとも20人の女性の処女ハエと十字架を設定します。ハエが子犬を始めるまでボトルを維持します。</li>
	<li>濡れたペイントブラシでプリパペを収集し、60mmペトリ皿で濡れたフィルターペーパーに転送します(図1F)。</li>
	<li>子犬をセックスし、実験に適した性別を収集する(図1G)。男性は精巣の存在によって識別され、それ以外の場合は不透明なパパに半透明のボールとして現れる。</li>
	<li>時間、日付、遺伝子型でペトリ皿にラベルを付け、その後、所望の段階に子犬を熟出します(図1H)。 注:温度制御されたインキュベーターで十字架/ストックと年齢の子犬を維持します(すなわち、RNAiクロスの場合は25°Cまたは27 °C、高温でのGal4活性の増加はノックダウン効率40を増加させます)。数日熟成時に子犬が乾燥しないように湿度が十分に高いことを確認してください。</li>
</ol>2. 48 h APF 前のIFM解剖
<ol><li>2つの#5バイオロジーグレード鉗子、ピペット、ピペットチップ、ドライアイス、および(RNAサンプル用)絶縁試薬を含む必要な機器を組み立てます(材料の表を参照)。さらに、チルブラック解剖皿(材料の表を参照)、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)バッファ、および氷上の1.5mLマイクロ遠心管を参照してください。</li>
	<li>濡れたペイントブラシを使用して、ステージングされたpupaeを冷たい1x PBSで約3分の2を満たした黒い解剖皿に移します(図2A,B)。蛍光解剖顕微鏡に移動します。 注:30分の時間枠内で解剖できる限り多くの子犬を使用してください。経験に応じて、これは3-15パペの範囲です。黒い解剖料理の代替案の議論については、「補足方法」を参照してください。</li>
	<li>#5鉗子を使用して、黒い解剖皿の底に子犬の1つを押し、顕微鏡ズームを調整し、pupaをはっきりと見るように焦点を合わせます(図2C)。</li>
	<li>1つの鉗子(図2D)で子犬の前部をつかみ、その後、胸部のすぐ後ろに、腹部のわずかに中央から離れた他の鉗子の単一の先端で子犬を突く。これにより、子犬が所定の位置に保持され、IFMが腹部に移動するのを防ぎます(図2E)。 注:この時点から解剖の長さのタイミングを開始します。解剖の定義された長さ(例えば20-30分)を使用して、筋肉死および関連する転写およびプロテオミクスの変化を最小限に抑える。この期間にできるだけ多くのハエを解剖します。</li>
	<li>最初の鉗子を使用して、プパルケースの前半分を取り外します(図2F)。</li>
	<li>同じ鉗子を使用して、露出した子犬を胸部のすぐ後ろにつまみ、腹部を胸郭から分離します(図2G)。</li>
	<li>鉗子を使用して、胸郭の前部を静かに絞るか(<35 h APF用)、または胸郭を開けて蛍光標識IFM(図2 H)を露出させる。IFMは、初期の時点で腱の取り付けが壊れやすいので、表皮から簡単に切り離されます。残りの死体を鉗子で捨てて皿の反対側に押し込みます。</li>
	<li>ステップ2.3-2.7を繰り返し、追加の子犬を解剖する。</li>
	<li>鉗子でIFM繊維を収集し、黒い解剖皿の底部の山にそれらを整理する(図2I,J)。鉗子を使用して視野からそれを押し出すことによって、任意の破片を削除します。 注:練習では、鉗子の先端は互いに触れることなく近くに持って来ることができる。この手法を使用すると、IFM を破棄せずにゆるやかにつかむことができます。別の方法は、単一の先端または完全に閉じた鉗子でIFMを静かに押し上げたり持ち上げたり、IFMで脂肪や他の組織を取り出し、ステップ2.10で説明するように脂肪を除去することです。</li>
	<li>品質管理 IFM 筋肉サンプル, 鉗子を使用してサンプルから非IFM筋肉, 脂肪, キューティクルなどを除去する (図 2K, L). 注:Mef2-Gal4では、IFMは初期の時点で他の筋肉タイプよりも強く標識され(図2K,K')、蛍光強度と筋肉形状に基づいてジャンプ筋および幼虫筋の除去を可能にする。脂肪およびキューティクル組織は異なって見え、筋肉特異的蛍光標識によって標識されていない(図2K,K')。IFM にラベルを付け、その他の Gal4 行については、「ディスカッション」セクションを参照してください。</li>
	<li>切り取られたピペット先端を使用して、IFMの山を1.5mLのマイクロ遠心分離管に移し、250 μLの冷蔵1x PBS(図2M-O)で満たします。直ちにセクション 4 に進みます。 注:IFMサンプルは、ピペット先端の側面に貼り付けるだけで失われる可能性があります。IFMを収集する前にバッファを数回上下に動かせば、標準的なチップの粘着性が低くなり、表面張力が低いシリファイドまたはパーフルオロアルコキシー(PFA)のヒント(材料の表を参照)がサンプル損失を防ぐのに役立ちます。</li>
</ol>3. 48 h APF後のIFM解剖
<ol><li>2つの#5生物学グレード鉗子、ファインハサミ、標準的なガラス顕微鏡スライド、ダブルスティックテープ、ピペット、ピペットチップ、ドライアイス、および(RNAアプリケーション用)絶縁試薬を含む必要な機器を組み立てます(材料の表を参照)。氷の上に1x PBSとマイクロ遠心管を冷やします。</li>
	<li>軽く濡れたペイントブラシを使用して、段階的な子犬を顕微鏡スライドに取り付けた両面粘着テープのストリップに移します(図3A)。同じ向きの線に子犬を置きます(スライドの下部に向かって腹部を下にして前にします)。 注:ペンキブラシやフィルターに水を多く使いすぎないように注意してください。子犬が付いていない場合は、まず乾いたフィルターまたはティッシュペーパーに移して乾燥させます。30分の時間枠内で解剖できる限り多くの子犬をマウントし、理想的には〜10パペ。</li>
	<li>子犬を子犬のケースから取り除く。鉗子を使って離れて、前の尖塔の上の子犬のケースを開きます(図3B)。</li>
	<li>鉗子のペアを後部に向かってそっとスライドさせ、鉗子が動くにつれて子犬のケースを切り取る(図3B')。下の子犬を破裂しないように注意してください。開いた場合からpupaを解放し、すぐに2番目の顕微鏡スライド上の1x PBSの滴に移します(図3B",C)。</li>
	<li>ライン内のすべての子犬に対して手順 3.3 と 3.4 を繰り返し、ダブルスティック テープ スライドを脇に置きます。</li>
	<li>細かいはさみを使って、子犬の腹部を胸郭から切り取り、別の杭に押し込む(図3D,D')。残りの子犬についても同じ手順を繰り返します。 注:ステップ3.6で解剖の長さのタイミングを開始します, pupalの完全性が中断されるとすぐに.細胞死および関連する転写およびプロテオミクスの変化を防ぐために、20-30分でできるだけ多くのハエを解剖する。1 d 大人または >90 h pupae を解剖する場合は、後で細かいはさみで頭部を取り除くのに便利です。</li>
	<li>ティッシュペーパーを使用して、1x PBSの大部分(一般的に浮遊脂肪で曇り)と腹部の山を取り除きます(図3E)。残りの胸部に新鮮な、冷やされた1x PBSの滴を追加します。</li>
	<li>はさみを使って胸郭を半分に切ります(図3F、F')。または、頭部を取り外した場合は、まず頭部が取り付けられたはさみを挿入し、胸郭の上半分をIFMの間で縦方向に切ります。次いで、胸郭の腹部側を同じ向きで第2の切り取りで切断する。</li>
	<li>すべての子犬を解剖するために手順3.7と3.8を繰り返し、スライドの中心付近に胸部の方面標本の山を生成します。多続部分が乾燥しないように、スライド上に十分な冷やされた1x PBSがあることを確認します。 注:48 h APF の後、IFM は、訓練を受けた目に標準的な解剖顕微鏡の下で見えるのに十分な大きさです。プロトコルのこの時点で、蛍光標識を持つ筋肉は、IFM同定またはトレーニング目的のために役立つ蛍光解剖範囲に移動することができますが、これは必要ありません。</li>
	<li>胸部からIFMを解剖します。#5鉗子を使用してヘミセクションの 1 つを分離します (図 3G,H)。IFMの真ん中の上下に1つの鉗子の先端を静かに挿入します(図3G',H')。最初の鉗子をまだ保持しながら、細かいはさみを使用して、キューティクルと腱からIFMの一方の端を切り取ります。次に、IFMのもう一方の端をキューティクルから切り取る(図3G',H'')。 注:最初のIFMカット後の胸郭の向きに応じて、2番目のIFMカットが実行しやすくなるように胸部を180°回転させることが有用である。</li>
	<li>鉗子で胸部からIFMバンドルを取り出し(図3G'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''を、PBSバブルの端に移して、水張力を使用して所定の位置に保持します(図3I)。死体をスライドの反対側に押します。残りの胸郭の各部を繰り返し、解剖された IFM のコレクションを生成します。 注:IFMがきちんとした山の中にとどまらない場合は、ティッシュで1x PBSの一部を取り除きます。すべての PBS が蒸発しないように注意し、解剖された IFM とヘミソラックスがバッファーで覆われたままであることを確認してください。</li>
	<li>すべてのIFMを解剖した後、すぐに解剖された筋肉の品質管理を行います。#5鉗子を使用して、サンプルに入り込んだ可能性のあるジャンプ筋またはキューティクル断片を取り除きます(図3J-K')。 注:ジャンプ筋肉はIFMとは異なって表示されます。蛍光下でMef2-Gal4標識筋を解剖した場合、ジャンプ筋は蛍光が弱く、形状や質感が異なる。通常の光の下では、IFMが不透明で乳白色の黄色である間、それはほぼ半透明に見えます(図3J-J'',K)。</li>
	<li>水張力を使用して、鉗子のペア間で解剖されたIFMを捕捉する(ただし、つぶさない)(図3L)。IFMを1.5mLのマイクロ遠心分離管に移し、250 μLの冷蔵1x PBS(図3M)であらかじめ充填した。セクション 4 に直ちに進みます。 注:鉗子の先端が互いに近接して持ち上げられ、バッファー溶液から持ち上げられると、水張りは鉗子の先端の間で捕捉されるバッファーの泡を引き起こす。IFMもこのバブルに存在する場合、溶液から持ち上げられ、別のバッファー充填容器に簡単に転送できます。バッファーバブルで捕捉された組織をマセレーションしないように、互いに触れることなく互いに近くに先端を持って来るために鉗子を絞ることが重要です。</li>
</ol>4. ペレットとIFMサンプルの保存
<ol><li>テーブルトップ遠心分離機で2,000 x gで3〜5分間1.5mLマイクロ遠心分離管を遠心分離することによりIFMをペレットします(図4A,B)。</li>
	<li>ピペットチップ(図4C)を使用してバッファを取り外します。
</li>
	<li>RNA アプリケーションの場合、所望の RNA 単離バッファーの 50 ~ 100 μL で IFM ペレットを再中断します (材料表、図 4Dを参照)。それ以外の場合は、手順 4.4 に進みます。 注:IFMは、質量分析製剤または市販キットでRNAを単離するためにステップ4.2の後に乾燥凍結することができる(代表的な結果を参照)。RNAアプリケーションの場合、IFMペレットを絶縁バッファー内で直ちに再中断および凍結することにより、より良い結果が得られます。</li>
	<li>ドライアイスでサンプルを凍結するか、液体窒素でスナップ凍結する(図4E)。下流分析のためのサンプル準備の後続のステップの準備ができるまで-80 °Cで貯える。 注:凍結保存後、サンプルは下流調査のために処理する前に数ヶ月間保存することができます。</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルでは、タンパク質、DNA、RNAまたは他の高分子の下流分離のために、早期および後期の子犬からショウジョウバエIFMを解剖する基本的な技術を提示する。プロトコルは大人のハエからIFMを解剖するために容易に合わせることができる。mRNA-Seq、プロテオミクスおよびRT-PCRアプリケーションの解剖プロトコルの有用性を実証します。オミクス技術の継続的な改善により、出発材料が少なく、入力濃度が低いサンプルの分析が可能になり、これらの解剖は多くの追加用途に有益になる可能性が高い。IFMはヒトミオパシー4、24および筋肉型特異的発達9、12の確立されたモデルであり、我々は、例えば、IFMを豊富に含むメタボロミクス、クロマチンの立体構造の調査を想像する3Cまたは4Cを介して、筋脂質形成のCLiP相互作用またはリンプロテオミクスを介してネットワーク評価をスプライシングする。
これらの解剖は、純粋なIFMサンプルの代わりにIFM用に濃縮されたサンプルを生成することを考慮することが重要です。これは、運動ニューロンの内性、腱の付着および筋線維の気管の侵入のために避けられない。バイオインフォマティクス解析は、IFM濃縮遺伝子またはタンパク質を同定するために使用できますが、それらが実際にIFM特異的であることを実証するためにさらなる実験が必要です。サンプル純度は、ストライプ45(腱)、Act79B4、44(管状筋)、Act88F 15(IFM)、またはsyb46(神経特異的)などの公公表組織特異的マーカーを用いてアッセイすることができる。このようなマーカーを使用してIFM特異的コンテンツにデータセットを正規化することは可能かもしれませんが、IFM特異的遺伝子やチューブリンなど、正規化に使用される遺伝子の発現の時間的変化は、そのようなアプローチに偏りが生じる可能性があることにユーザーは注意が必要です。
遺伝的にコードされた組織特異的標識法、例えばECタグ付け47、48またはPABP標識49、50は、近年開発され、真に得るのに役立つかもしれない組織特異的なRNAサンプル。しかし、ECタグ付けはハエ47の一定の供給を必要とするため、子犬の段階では適用されません。PABP標識トランスクリプトームの感度および完全性には、51の制限がある場合がある。個々の筋線維を分離するFACSアプローチは、IFMの大きなサイズと同期性によって複雑です。INTACT52,53スタイルアプローチは、IFMから特定の細胞内区画を分離するために適用され、IFM核またはミトコンドリアの純粋な集団を分離するのに有用であることが証明される可能性がある。手動解剖はほとんどの下流の適用のための無傷のIFMティッシュを得るために現在の標準である。
サンプルの品質は、解剖プロセスのいくつかの重要なステップに依存します。解剖は技術的に要求され、解剖速度およびサンプルの純度は経験と共に増加する。洗剤を使用せずに冷蔵バッファーで短時間(20~30分)の解剖を行い、すぐに凍結すると、マウス腱分離54に関して以前に観察されているように、サンプルの完全性を維持するのに役立ちます。IFMは、ペレットからすべてのバッファを除去した後に正常にドライフリーズすることができますが、特にRNA単離のために、分離バッファー内のサンプルを凍結すると、より良い結果が得られる傾向があります。RNAまたはタンパク質の単離の前に最大20個の別々の解剖からIFMが組み合わされ、下流分析のために初期の時点または変異体16、32からでも十分な材料をスケールアップおよび収集することができます。
RNAアプリケーションの場合、最も重要なステップは、RNA自体の単離である可能性があります。グアニジニウムチオシアネート-フェノールクロロホルム単離(上記の方法1)は、試験されたほとんどの市販キットを上回り、前述のように、かなり安価な55である。市販キットとのRNA分離収率で観察された変動性は、以前の観測値56,57と一致している。我々はさらにすべてのRNAを回復するのに役立つイソプロパノール沈殿の間にグリコーゲンを追加します。RNA収率を超えて、解剖および単離プロセス中にサンプルが断片化または分解されていないことを確認するために、RNA整合性を検証することが重要です。また、RNaseフリーで作業することも不可欠です。最後に、RTキットの選択は、逆転転写プロセスの感度に影響を与えることができます。詳細に説明する必要はあまりありませんが、これらのポイントはすべて IFM サンプルの品質とダウンストリーム アプリケーションから取得したデータに影響します。
いくつかの重要な変更により、プロトコルは既存の IFM 解剖プロトコルとは別に設定されます。IFM免疫蛍光のための詳細な解剖プロトコルは19が存在するが、このプロトコルは、IFM組織のより迅速な単離を可能にするpupal解剖に対する異なるアプローチを提示する。これにより、プロテオームまたはトランスクリプトームの変化を防ぐために、解剖時間が限られた大量のIFM組織(比較的話す)の収集が可能になります。他のプロトコルは、個々の筋膜39におけるGFP染色を可視化するための成人IFMの解剖を記述する39、または幼虫体壁筋58の染色のために、しかし、それらは、プパール段階での解剖またはRNAまたはタンパク質の単離に対処しない。このアプローチはまた、より純粋なIFMサンプルを生成する可能性があるが、より労働集約的であり、より少ない材料を生成するクライオセクション38からのpupal IFMの微小解剖のための既存のプロトコルとは異なります。他の急速成人IFM解剖プロトコル38、39と比較して、IFMは、ストレス誘導および他の主要な発現変化を制限するために洗剤なしでPBSバッファー内で単離される。
このプロトコルの主な進歩は、ライブ、蛍光レポーターを含めることであり、初期の子犬の段階でIFMを隔離することができます。私たちは標準的にMef2-GAL459を使用してUAS-CD8::GFPまたはUAS-GFP::Gma60.これにより、IFMの差分ラベリング(飛行筋肉は他の水力筋とは異なるラベル付け)とGAL4-UASベースの操作(例えば救助やRNAi実験)の性能が可能になります。また、Mef2-GAL4と浴槽-GAL80tsを組み合わせてRNAi関連の早期致死性を回避したり、UAS-Dcr2を使用してRNAi効率を40に向上させることも可能です。
Mef2-GAL4 の代わりに使用できる筋肉型特異性、時間発現パターン、およびドライバ強度19,61で異なる GAL4 ドライバーまたは GFP ラインが追加で利用可能です。たとえば、Act88F-GAL4 は最初に 24 h APF の周りに表現されるため、以前のタイムポイントでは使用できません。しかし、それはIFMに強くラベルを付け、RNAi関連の早期致死を避けるのに役立つかもしれません。彼-GFPまたはAct88F-GFPラベルIFMは、再び時間的な制限を伴うが、それらはマーカー式のGAL4依存性を避け、目的の変異背景と組み合わせて有用であり得る。その他の可能なマーカー行のリストは19.また、トランスジーンとGAL4/UASシステムを使用すると遺伝子発現アーティファクトを引き起こす可能性があるため、例えば、ドライバラインが野生型の背景株に交差するなど、適切なコントロールを使用することが重要です。すべてのサンプルで同じです。
付属のビデオでは、この詳細なプロトコルは、pupal IFM解剖をよりアクセスしやすくし、筋肉の発達を研究するためのオミクスアプローチの使用を促進することを目的としています。解剖IFMを通じてアクセス可能な生化学およびオミクスアッセイとショウジョウバエの遺伝学と細胞生物学の力を結合することは、筋形成と筋肉機能の機械的理解を進める可能性を秘めています。転写物とプロテオーム調節のシステムレベルの観察を代謝および機能的な出力に結びつける将来の研究は、筋肉型特異的な発達と筋肉障害の病因をより深く理解することを提供する。

現代のオミクス技術は、筋肉の発達と人間の筋肉障害の根底にあるメカニズムに重要な洞察を提供します。例えば、動物モデルにおける遺伝的および生化学的検証と組み合わせたトランスクリプトミクスデータの分析は、30以上のサルコメアの標的ネットワークの調節に起因する拡張型心筋症を引き起こすスプライシング因子RBM20の喪失を引き起こすことを明らかにした。以前に心臓病に関連した遺伝子, ティチン1,2,3を含む.
第2の例では、細胞培養、動物モデル、およびヒト患者からの研究は、筋緊張性ジストロフィーが筋盲目(MBNL)の隔離およびCELF14、5のアップレギュレーションによるRNA調節の中断によって引き起こされたことを示している。MBNLとCELF1(CUGBP1またはブルーノ様2とも呼ばれる)間の交差調節および時間的ダイナミクスは、筋力ジストロフィー患者における持続的な胚性スプライシングパターンを説明するのに役立つ。さらに、誤って規制された標的の大規模なネットワークは、病気4、6、7、8の複雑な性質を説明するのに役立ちます。このような研究の大半は、ヒトの筋肉疾患の根底にあるメカニズムを理解するために、遺伝モデル生物におけるオミクスアプローチを利用しています。さらに、健康な筋肉における時間的および組織型の特定遺伝子発現、タンパク質修飾、代謝パターンを最初に理解し、病気や老化した筋肉の変化を理解することの重要性を強調する。
ショウジョウバエメラノガスターは、もう一つの確立された遺伝モデル生物です。サルコメアの構造と個々のサルコメア成分は、ハエから脊椎動物4、9、10まで高度に保存され、間接飛行筋肉(IFM)は研究する強力なモデルとなっています。筋肉の発達の複数の側面11,12.第1に、線維飛行筋は、管状体筋11、13とは機能的および形態的に異なり、筋肉型特異的発達機構の調査を可能にする。スパルトメジャー(Salm)14、エクスデンティクル(Exd)、およびホモソラックス(Hth)15を含む転写因子は、フィブリル運命調節因子として同定されている。さらに、サルムの下流、CELF1ホモログブルーノ1(Bru1、アレット)は、フィブリル特異的スプライシングプログラム16、17を指示します。
第二に、IFMは筋芽生全性融合および筋管愛着から筋症形成およびサルコメア成熟9、18、19に至る筋形成の過程を理解するための重要なモデルである。第三に、ショウジョウバエ遺伝学は、個々のタンパク質、タンパク質ドメイン、およびタンパク質アイソフォームによるサルコメア形成、機能、および生物物理学的特性20、21、22への寄与の調査を可能にする。 、23.最後に、IFMモデルは、筋緊張性ジストロフィー、筋頭筋筋症、筋変性疾患、アクチノパシーなど、複数のヒト筋障害の研究のために開発されました24,25,26 、27、および疾患メカニズムおよび潜在的な治療法に関する重要な洞察を提供している28,29,30.したがって、ショウジョウバエは、筋肉型特異的転写、スプライシング、クロマチン調節のメカニズム、ならびに筋肉発達における代謝の役割を含む、筋形成分野における多くの未解決の質問に対処するのに有用なモデルである。現代のオミクス技術の応用は、特にショウジョウバエで利用可能な多種多様な遺伝的、生化学的および細胞生物学的アッセイと組み合わせることで、筋肉の理解を劇的に進める可能性を秘めている。発達、老化、病気。
IFMは、大人31、32の胸郭の全長にわたってほぼ1ミリメートルに及ぶハエの最大の筋肉です。しかし、この小さなサイズは、組織型の特定の方法でショウジョウバエのオミクス技術を適用するのに十分なサンプルを得ることに挑戦を生成します。さらに、IFMは、子犬の段階で形成される成人の筋肉の一部です。ミオブラストヒューズは、子宮形成後24時間後に腱に付着し、30時間APF(図1A-D)18,33の周り筋線形成を開始するために必要な圧縮ステップを受ける筋管を形成する。 34.
筋線維は胸郭の全長に及ぶまで成長し、筋線維は約48h APFまでサルコメア添加に焦点を当てた初期成長期を経て、その後、サルコメアが長さと幅で成長し、成熟期に移行し、72 h APF (図 1A-D)32,35によってストレッチ活性化を確立するために改造。繊維成熟の発症は、少なくとも部分的にSalmおよびE2F32、36、37によって制御され、そのスプライシングがBru1によって制御される複数のIFM特異的サルコメアタンパク質アイソフォームは、この間に組み込まれるフェーズ16,17.成熟したハエは90-100 h APFから閉じます。これは、筋肉の発達を研究するために、IFMは、オミクスアプローチを使用して分析を容易にするために、複数の水疱のタイムポイントから十分な量、品質、および純度で分離されなくてはならないことを意味します。
IFM 解剖用のプロトコルがいくつか公開されています。これらのプロトコルは、意図したアプリケーションに適していますが、オミクスアプローチに最適なものはありません。プパールおよび成人IFM19の免疫蛍光のためのIFM形態を保存するプロトコルは、機械的評価31のためにIFM繊維を単離するか、または凍結切除38からプパルIFMの微小解剖を利用するはあまりにも専門的で時間が多すぎるオミクスの適用のための十分な量のIFMティッシュを合理的に得るために集中的にする。他のプロトコルは、特異的に成人IFM38、39の迅速な解剖のために開発され、従って、pupal段階には適用されず、理想的でないか、またはRNA単離と互換性がない可能性のあるバッファーを使用する。したがって、生化学またはオミクス用途用のpupal IFMを分離するための新しいアプローチを開発する必要がある。
ここでは、成人段階16、32を通じて16h APFからmRNA-Seq分析に成功したプパル段階中のIFMの解剖のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)ラベルを採用して、蛍光および成人の発達のすべての段階でIFMを同定し、蛍光解剖顕微鏡下での生解剖を可能にします。このアプローチは、既存の IFM 解剖プロトコルよりも高いスループットを持つ、より少ない労力を伴います。これにより、サンプルの迅速な単離および凍結保存が可能になり、オミクスアプローチの解剖の数回のラウンド後に十分な材料を生成するだけでなく、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)またはウェスタンブロッティングを生成します。
このプロトコルは2つの部分で示し、48 h APFの前(初期変態時、IFMアタッチメントがより緊張している場合)と48 h APF後(pupalボディプランとIFMアタッチメントが明確に定義されている場合)の両方でIFMを迅速に解剖する方法を示します。我々は、すべての時点で解剖されたIFMから高品質のRNAを分離し、RNA分離および逆転転写に対する異なるアプローチに関するデータを提示できることを実証する。最後に、CELF1ホモログブルーノ1を例にしたmRNA-Seq、質量分析、RT-PCRへの解剖プロトコルの応用を示す。ブルーノ1変異体IFMからのプロテオミクスデータにおけるサルコメアタンパク質アイソフォームの誤発現を示し、ミオシン重鎖のC末端スプライス事象のBruno1調節を調べる(Mhc)。これらの結果は、オミクスデータが生物学的現象をより深く理解し、遺伝的および生化学的実験を補完する方法を示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

ショウジョウバエ飛行筋は、転写調節、代替スプライシング、代謝、メカノバイオロジーなどの多様なプロセスを研究するための強力なモデルであり、筋肉の発達と筋線維新症に影響を与えます。質量分析や深いシーケンシングによって生成されたようなオミクスデータは、これらの生物学的プロセスに重要な機械的洞察を提供することができます。このようなアプローチでは、オミクス指紋の選択性と特異性の両方を高めるために、組織特異的なサンプルを分析することが有益です。ここでは、オミクス用途に対して高濃縮された筋肉サンプルを生成するために、生きている子犬から蛍光標識飛行筋を解剖するためのプロトコルを提示する。最初に、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識によって筋肉が識別可能な初期の水疱の段階(<48hの子犬の形成後(<48 h)で飛行筋肉を解剖する方法について説明します。次に、解剖顕微鏡下で筋肉が区別可能な場合に、後期の子犬(>48 h APF)または成人から筋肉を解剖する方法について説明します。付属のビデオプロトコルは、これらの技術的に要求の厳しい解剖は、筋肉とショウジョウバエ研究コミュニティに広くアクセスできるようになります。RNAアプリケーションでは、異なる時点で、異なるアプローチで単離できるRNAの量と品質をアッセイします。さらに、Bruno1(Bru1)がミオシン重鎖(Mhc)スプライシングの時間的シフトに必要であることを示し、解剖された筋肉がmRNA-Seq、質量分析、および逆転転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)に使用できることを実証する。アプリケーション。この解剖プロトコルは、組織特異的なオミクス分析を促進するのに役立ち、一般的に筋形成の複数の生物学的側面を研究するために適用することができる。

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

ショウジョウバエ飛行筋は、転写調節、代替スプライシング、代謝、およびメカノバイオロジーを研究するための強力なモデルです。我々は、プロテオミクスおよび深いシーケンシングに最適な高濃縮サンプルを生成するために、生きている子犬から蛍光標識飛行筋を解剖するためのプロトコルを提示する。これらのサンプルは、筋肉の発達の多様な側面に重要な機械的洞察を提供することができます。

オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

このプロトコルは、遺伝子およびタンパク質発現の変化を評価するために、小児の発達中のさまざまな時点でショウジョウバエからのGFP標識間接飛行筋の解剖を容易にする。これらの技術を使用して、最小限のRNAタンパク質分解を伴う高富化飛行筋試料は、RT-PCR、ウェスタンブロット、またはオミックアプローチに適したものを達成することができます。これらの専門的な解剖は練習とスキルを必要としますが、解剖できる子犬の数とサンプルの品質は経験によって向上します。この解剖の視覚的なデモンストレーションは、飛行筋肉と非筋肉組織を区別する方法を決定し、プパル標本からの飛行筋肉の迅速な分離を促進するために重要である。子犬をステージングするには、濡れたペイントブラシを使用して、プレパエを収集して60ミリメートルのペトリ皿に移し、双眼鏡顕微鏡で子犬をセックスします。オスは精巣の存在によって識別され、そうでなければ不透明な子犬の上に半透明の地球儀として現れる。ハエの時間、日付、および遺伝子型で皿にラベルを付けた後、適切な段階まで25〜27度の摂氏インキュベーターで子犬を老化させる。48 H APF の前に IFM 解剖の場合は、湿潤した絵筆を使用して、適切にステージングされた子犬を、冷たいPBSで満たされた約 2/3 の黒い解剖皿に移します。蛍光解剖顕微鏡の下で、5鉗子を使用して、1つの子犬を黒い解剖皿の底に押し出します。子犬が明確に視覚化できるまで、顕微鏡のズームとフォーカスを調整します。1組の鉗子を使って子犬の前部をつかみ、胸郭のすぐ後ろにある腹部のわずかに中心から離れた2番目の鉗子の1つの先端で子犬を突く。最初の鉗子を使用して、プパルケースの前半分を取り除き、露出した子犬を胸郭のすぐ後ろにつまんで腹部を胸郭から分離します。次に、胸郭の前部を軽く絞り、蛍光標識されたIFMを露出させる。次に、残りのカーカスを皿の反対側に捨てる鉗子を使用し、同様にしてその後の子犬を解剖する。すべての子犬が解剖されたら、鉗子を使用してIFM繊維を収集し、黒い解剖皿の底にある杭に繊維を整理します。鉗子を使用して、残骸を視野から押し出し、IFM以外の筋肉、脂肪、キューティクル、または他の不要な組織をサンプルから取り除きます。次に、切り取ったピペットチップを使用して、IFMの杭を250マイクロリットルの冷蔵PBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。48 H APF後のIFM解剖の場合は、軽く濡れた絵筆を使用して、ステージされた子犬を顕微鏡スライドに取り付けられた両面付き粘着テープのストリップに移します。子犬の向きをラインに、腹側を下に、前部をスライドの下部に向けます。すべての子犬が配置されたら、鉗子を使用して前尖塔の上の最初のプパルケースを離して開き、後部に向かってゆっくりと一対の鉗子を下にスライドさせ、鉗子が動くにつれてパパルケースを切断します。開いたケースから子犬を解放し、すぐに2番目の顕微鏡スライド上のPBSの滴に子犬を移します。すべての子犬が解放されたら、細かいはさみを使用して胸郭から離れて子犬の腹部を切断し、腹部を別の山に押し込む。すべてのソア軸が取り除かれたら、組織紙を使ってPBSの大部分と腹部の山を取り除きます。残りの胸郭に新鮮な冷たいPBSの滴を追加し、ハサミを使用して縦方向の体軸に沿って頭から切り取り、胸郭を半分に分割します。すべての子犬が解剖されたら、5つの鉗子を使用してヘミセクションの1つを選択し、IFMの中央部の上下に1つの鉗子の先端を静かに挿入します。鉗子の最初のペアを保持し、キューティクルと腱から離れてIFMの一方の端をカットするために細かいはさみを使用して、子犬を180度回転させる前に、IFMのもう一方の端をキューティクルと腱から自由に切断できるようにします。鉗子を使用して、IFMバンドルを胸郭からPBSバブルの端に移し、水張力を使用してバンドルを所定の位置に保持します。次に、スライドの反対側にカーカスを押し、同様にIFMの残りの部分を解剖します。すべてのIFMが収集されたら、5鉗子を使用して、サンプルに入った可能性のあるジャンプ筋肉またはキューティクルの断片を取り除きます。その後、水張力を使用して、一対の鉗子の間で解剖されたIFMを穏やかに捕獲し、250マイクロリットルの冷たいPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にIFMを入れます。BRUNO1 IR IFMからのmRNAシーケンシングデータは、野生型シーケンシングデータと比較して、遺伝子単位レベルでの発現の変化を示しています。解剖されたIFMに対する全体のプロテオーム質量分析を用いて、タンパク質およびタンパク質アイソフォームレベルでも同様の調節が観察される。Mhcの最終イントロンにタンパク質トラップラインを挿入した後、GFP標識タンパク質の組み込みは、90H APFのM線の両側の2つのドットとしてIFMで観察され、脚筋組織ではサルコマーM線を横切ってGFP信号を均一に観察することができる。解剖されたIFMに対してRT-PCRを使用する場合、MhcアイソフォームスイッチをGFP標識エキソン34~37イベントからラベルなしエキソン34~35イベントに切り替え、摂氏27度でのpuparium形成後30~48時間の間で検出することができる。mRNAシーケンシングデータから、脚およびジャンプ筋組織は3つのMhcアイソフォームすべてを発現し、成熟した筋肉におけるGFP標識アイソフォームの発現を維持する。スピルト主突然変異体およびBRUNO1 IR-IFMの両方が、GFP標識Mhcアイソフォームの発現を発達するにつれてオフにすることができず、脚およびジャンプ筋組織に似たアイソフォーム発現プロファイルをもたらした。RNA分解を防ぐために、30分以内に分法を行う必要があることを覚えておいてください。そして、他の細胞タイプによる汚染を制限するよう注意する。この方法は、RT-PCR、またはウェスタンブロッティングなどの生化学的アプローチに適したIFM濃縮サンプルを生成し、質量分析、ハイスループットシーケンシング、クロマチン立体構造キャプチャ、およびメタボロミクスのようなオミックスタイルのアプローチを生成します。これらの切片は、ショウジョウバエの強力な遺伝的アプローチを、開発および遺伝子調節の基本的なメカニズムを調査するためのシステムレベルのデータと共に補完することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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腹部色素沈着の定量化<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

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高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

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ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

回転運動の定量化システム (リクエスト) を用いたキイロショウジョウバエの運動レベルの測定

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

キイロショウジョウバエで優しく誘導運動されて: インターバル トレーニングのプロトコル

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬の同定のためのスクリーニング方法

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...