Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Vi er takknemlige for Andreas Ladurner og Frank Schnorrer for generøs støtte. Vi takker Sandra Esser for utmerket teknisk assistanse og Akanksha Roy for generering av massen massespektrometri data. Vi erkjenner Bloomington og Wien lager sentre for å gi fluer. Vi takker Core Facility Bioimaging for hjelp med konfokalmikroskopi Imaging og Zentrallabor für Proteinanalytik for analyse av masse massespektrometri prøver, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, DE). Vårt arbeid ble støttet av Deutsche Forschungs gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated protein Science Munich (CIPSM) ved Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS), og den internasjonale Max Planck Research School (EN).

1. Oppsamling av pupae
<ol><li>Hev fluene av ønsket genotype i flasker (figur 1E). Enten lage en fersk flip av disseksjon lager eller sette et kors med minst 20 kvinnelige jomfru fluer. Oppretthold flasker til fluene begynner å pupate.</li>
	<li>Samle pre-pupae med en fuktet pensel og Overfør til fuktet filter papir i en 60 mm Petri parabol (figur 1F).</li>
	<li>Sex pupae, samle riktig kjønn for eksperimentet (figur 1G). Hanner er identifisert ved tilstedeværelsen av testiklene, som vises som gjennomskinnelig baller i ellers ugjennomsiktig puppe.</li>
	<li>Merk Petri parabolen med tid, dato og genotype, deretter alder pupae til ønsket Stadium (figur 1H). Merk: Oppretthold kryss/aksjer og alder pupae i en temperaturstyrt inkubator (dvs. 25 ° c eller 27 ° c for RNAi krysser, som økt Gal4 aktivitet ved høyere temperaturer øker knock-Down effektivitet40). Sørg for at fuktigheten er tilstrekkelig høy, slik pupae ikke tørker ut når aldring flere dager.</li>
</ol>2. IFM disseksjon før 48 h APF
<ol><li>Monter nødvendig utstyr inkludert to #5 biologi grade tang, en pipette, pipette tips, tørr is, og (for RNA prøver) isolasjon reagens (se tabell over materialer). I tillegg, chill svart dissekere retter (se tabell over materialer), 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer, og 1,5 ml mikrosentrifugen rør på isen.</li>
	<li>Ved hjelp av en fuktet pensel, overføring iscenesatt pupae til en svart dissekere parabolen fylt omtrent to tredjedeler med kaldt 1x PBS (figur 2a, B). Flytt til et fluorescerende dissekere mikroskop. Merk: Bruk så mange pupae som kan være dissekert innen en 30 min tid vindu. Avhengig av erfaring, varierer dette fra 3 – 15 pupae. Se supplerende metoder for diskusjon av alternativer til svart dissekere retter.</li>
	<li>Ved hjelp av #5 tang, skyver en av pupae til bunnen av en svart dissekere parabolen og justere mikroskopet zoom og fokus for å tydelig se puppe (figur 2C).</li>
	<li>Ta tak i fremre av puppe med en tang (figur 2D), og deretter dytte den pupae med et enkelt tips av de andre tang litt off-Center i magen, like bak thorax. Dette holder puppe på plass og hindrer IFMs fra å flytte inn i magen (figur 2E). Merk: Begynn timing lengden på disseksjon fra dette punktet, så snart puppestadiet integritet er forstyrret. Bruk en definert lengde på disseksjon (for eksempel 20 – 30 min) for å minimere muskel død og tilknyttede transcriptomic og Proteomikk endringer. Analysere så mange fluer som mulig i denne perioden av tid.</li>
	<li>Ved hjelp av den første tang, fjerne den fremre halvdelen av puppestadiet saken (figur 2F).</li>
	<li>Bruk samme tang til å klype den eksponerte pupae rett bak thorax, og Skill buken fra thorax (figur 2G).</li>
	<li>Bruk tang, klem forsiktig den fremre delen av thorax (for < 35 h APF) eller rip åpne thorax å eksponere fluorescensmerkete merket IFMs (figur 2h). IFMs vil lett løsne fra epidermis, som sene vedlegg ved tidlig tidspunkter er skjøre. Kast den gjenværende stammen ved hjelp av Tang for å skyve den til motsatt side av fatet.</li>
	<li>Gjentar skritt 2.3 – 2.7, analysere i tillegg pupae.</li>
	<li>Samle IFM fibre med tang og organisere dem i en haug på bunnen av den svarte dissekere parabolen (figur 2I, J). Fjern eventuelle rusk ved å skyve den ut av synsfeltet ved hjelp av tang. Merk: Med praksis kan tang tips bringes i umiddelbar nærhet uten å berøre hverandre. Denne teknikken kan brukes til å løst Grip IFMs uten å ødelegge dem. Alternative metoder inkluderer forsiktig skyve eller løfte IFMs med et enkelt tips eller helt lukket pinsett, eller ta litt fett eller annet vev med IFM og fjerne fettet som beskrevet i trinn 2,10.</li>
	<li>Kvalitetskontroll av IFM muskel prøven, ved hjelp av Tang for å fjerne ikke-IFM muskler, fett, cuticle, etc. fra prøven (figur 2K, L). Merk: Med Mef2-Gal4, IFM er merket sterkere enn andre muskel typer ved tidlig tidspunkter (figur 2k, k '), slik at fjerning av hoppe muskel og larvestadiet muskler basert på fluorescens intensitet og muskel form. Fett og cuticle vev ser annerledes og er ikke merket med en muskel-spesifikk fluorescens etikett (figur 2k, k '). Se diskusjons delen for andre Gal4-linjer som gir navn til IFM.</li>
	<li>Ved hjelp av et avkuttet pipette tips, overføre haugen av IFMs inn i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube fylt med 250 μL av kjølt 1x PBS (figur 2M-O). Fortsett umiddelbart til seksjon 4. Merk: IFM prøver kan gå tapt bare ved å stikke til siden av pipette spissen. Pipettering buffer opp og ned flere ganger før du samler IFMs kan gjøre standard tips mindre klissete, og silikonbehandlet eller perfluoroalkoxy (PFA) tips (se tabell over materialer) med lavere overflate spenninger kan bidra til å forhindre prøve tap.</li>
</ol>3. IFM disseksjon etter 48 h APF
<ol><li>Monter nødvendig utstyr inkludert to #5 biologi grade tang, fine saks, standard glass mikroskop lysbilder, dobbel-Stick tape, pipette, pipette tips, tørr is, og (for RNA applikasjoner) isolasjon reagens (se tabell over materialer). Avkjøl 1x PBS og mikrosentrifugen rør på isen.</li>
	<li>Bruke en lett fuktet pensel, overføre iscenesatt pupae til en stripe av tosidige klebrig tape montert på et mikroskop lysbilde (Figur 3a). Plasser pupae i en linje som er orientert i samme retning (ventrale ned og fremre mot bunnen av lysbildet). Merk: Vær forsiktig så du ikke bruker for mye vann på pensel eller filter, eller pupae vil ikke holde seg godt. Hvis pupae ikke stikker, tørk dem ved først å overføre til et tørt filter eller silkepapir. Mount så mange pupae som kan være dissekert innen en 30 min tid vindu, ideelt ~ 10 pupae.</li>
	<li>Fjern puppe fra puppestadiet saken. Bruk tang til å erte fra hverandre og åpne puppestadiet saken over fremre trakeer (Figur 3B).</li>
	<li>Skyv forsiktig et par tang dorsalt mot bakre, klippe puppestadiet saken som tang flytte (Figur 3B '). Vær forsiktig så du ikke sprekker den underliggende puppe. Frigjør puppe fra den åpnede saken og umiddelbart overføre den til en dråpe 1x PBS på et annet mikroskop lysbilde (Figur 3B ", C).</li>
	<li>Gjenta trinn 3,3 og 3,4 for alle pupae i linjen, og sett deretter dobbel-Stick tape gli til side.</li>
	<li>Bruke fine saks, klippe magen av puppe bort fra thorax og skyv den inn i en egen haug (Figur 3d, d '). Gjenta for de resterende pupae. Merk: Begynn timing lengden på disseksjon med trinn 3,6, så snart puppestadiet integritet er forstyrret. Analysere så mange fluer som mulig i 20-30 min for å hindre celle død og tilhørende transcriptomic og Proteomikk endringer. Når dissekere 1 d voksne eller > 90 h pupae, er det ofte praktisk for senere trinn for å i tillegg fjerne hodet med den fine saks.</li>
	<li>Bruk en silkepapir, fjerne flertallet av 1x PBS (generelt skyet med suspendert fett) samt haug av abdomens (Figur 3E). Legg en dråpe frisk, kjølt 1x PBS til de resterende thoraxes.</li>
	<li>Bruk saksen til å kutte thorax i to (Figur 3f, f ') ved å kutte fra hodet ned langsgående kroppen aksen i en enkelt bevegelse. Alternativt, hvis hodet er fjernet, må du først sette inn saksen der hodet var festet og kutte den øverste halvdelen av thorax lengderetningen mellom IFMs. Deretter klippes den ventrale siden av thorax med en andre kuttet i samme retning.</li>
	<li>Gjenta trinn 3,7 og 3,8 for alle pupae som skal dissekert, og Generer en haug med thorax hemisections nær midten av lysbildet. Sørg for at det er nok kjølt 1x PBS på lysbildet slik at hemisections ikke tørker ut. Merk: Etter 48 h APF, IFMs er store nok til å være synlig under en standard dissekere mikroskop til trent øyet. På dette punktet i protokollen, muskler med et fluorescerende merke kan flyttes til et fluorescerende dissekere omfang for å hjelpe i IFM identifikasjon eller for opplæring, men dette er ikke nødvendig.</li>
	<li>Analysere IFMs ut av thorax. Isoler en av hemisections ved hjelp av #5 tang (Figur 3G, H). Sett forsiktig inn tuppen av en pinsett over og under midten av IFMs (Figur 3G ', H '). Mens du holder den første tang fortsatt, bruk fine saks til å kutte den ene enden av IFM bort fra cuticle og sener. Deretter kuttet den andre enden av IFM fri fra cuticle (Figur 3G ' ', H ' '). Merk: Avhengig av retningen på thorax etter den første IFM kuttet, er det nyttig å rotere thorax 180 ° slik at den andre IFM kuttet er lettere å utføre.</li>
	<li>Fjern IFM Bundle fra thorax med tang (Figur 3G ' ' ', H ' ' '), overføre den til kanten av PBS boblen å bruke vann spenning for å holde den på plass (Figur 3I). Skyv stammen til motsatt side av lysbildet. Gjenta for de resterende thorax hemisections, genererer en samling av dissekert IFMs. Merk: Hvis IFMs ikke bo i en pen haug, fjerne noen av 1x PBS med en vev. Vær forsiktig så du ikke la alle PBS fordampe, og sikre at dissekert IFMs og hemithoraxes forblir dekket av buffer.</li>
	<li>Etter dissekere alle IFMs, raskt utføre en kvalitetskontroll på dissekert muskelen. Ved hjelp av #5 tang, fjerne eventuelle hoppe muskler eller cuticle fragmenter som kan ha funnet veien inn i prøven (Figur 3J-K ' '). Merk: Jump muskelen vises forskjellig fra IFM. Hvis dissekere Mef2-Gal4 merket muskelen under fluorescens, har hoppe muskelen en svakere fluorescens og en annen form og tekstur. Under normal lys, synes det nesten gjennomskinnelig mens IFMs er en ugjennomsiktig, melkeaktig gul (Figur 3J-J ' ', K).</li>
	<li>Ved hjelp av vann spenninger, fangst (men ikke squish) den dissekert IFMs mellom et par tang (Figur 3L). Overfør IFMs til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør som er forhåndsutfylt med 250 μL av kjølt 1x PBS (fig. 3M). Fortsett umiddelbart med avsnitt 4. Merk: Når pinsett tips er brakt i nærheten av hverandre og løftet ut av en buffer løsning, forårsaker vann spenning en boble av buffer som skal fanges mellom pinsett tips. Hvis IFMs også er til stede i denne boblen, kan de løftes ut av løsningen og enkelt overføres til en annen buffer fylt beholder. Det er viktig å presse pinsett til å bringe tips nær hverandre uten å berøre hverandre, for å unngå macerating vevet fanget i buffer boblen.</li>
</ol>4. pellet og bevare IFM sample
<ol><li>Pellet IFMs ved å sentrifugering 1,5 mL mikrosentrifugen rør for 3 – 5 min ved 2 000 x g i en bord topp sentrifuge (Figur 4a, B).</li>
	<li>Fjern bufferen ved hjelp av en pipette (Figur 4C).
</li>
	<li>For RNA-applikasjoner, resuspend IFM pellet i 50 – 100 μL av ønsket RNA isolasjons buffer (se tabell over materialer, Figur 4D). Hvis ikke, går du til trinn 4,4. Merk: IFMs kan være tørr frosset etter trinn 4,2 for masse massespektrometri preparater eller isolering av RNA med kommersielle sett (se representative resultater). For RNA-programmer oppnås bedre resultater ved umiddelbart å blanding og fryse IFM pellet i isolasjons buffer.</li>
	<li>Frys prøven på tørr is eller smekk fryse i flytende nitrogen (Figur 4E). Oppbevares ved-80 ° c til det er klart for påfølgende trinn i prøve forberedelsene for nedstrøms analyse. Merk: Etter kryonisk bevaring, kan prøvene lagres i flere måneder før behandling for nedstrøms etterforskning.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Inne denne protokollen, vi gave det grunn-teknikk å analysere Drosophila IFMs fra tidlig og sen-scene pupae for nedstrøms isolasjon av PROTEIN, DNA, RNA eller annet makromolekyler. Protokollen kan enkelt tilpasses til å analysere IFM fra voksen fluer. Vi viser nytten av vår disseksjon-protokoll for mRNA-SEQ-, Proteomikk-og RT-PCR-applikasjoner. Med kontinuerlig forbedring av omics teknologier for å muliggjøre analyse av prøver med mindre Start materiale og lavere inn data konsentrasjoner, vil disse dissections trolig bli verdifulle for mange tilleggsprogrammer. Som IFMs er en etablert modell for Human myopatier4,24 og muskel-type spesifikk utvikling9,12, vi ser for eksempel, IFM-beriket Plantemetabolomikk, undersøkelser av kromatin konformasjon via 3C eller 4C, skjøting nettverks evaluering via CLiP interaksjoner eller fosfat-Proteomikk av myofibrillogenesis.
Det er viktig å tenke på at disse dissections produsere en prøve beriket for IFM stedet for en ren IFM prøve. Dette er uunngåelig på grunn av motorisk Nevron innervasjon, sene vedlegg og tracheal invasjon av muskelfibre. Bioinformatikk analyse kan brukes til å identifisere IFM beriket gener eller proteiner, men ytterligere eksperimenter er nødvendig for å demonstrere at de faktisk er IFM-spesifikke. Sample renhet kan være analyseres ved hjelp av publiserte vev-spesifikke markører som stripe45 (sene),Act79B 4,44 (rørformede muskelen), Act88F15 (IFM), eller Syb46 (neuronal spesifikke). Det kan være mulig å bruke slike markører for å normalisere datasett til IFM-spesifikt innhold, men brukere advares om at timelige endringer i uttrykk for gener som brukes til normalisering, for eksempel av IFM-spesifikke gener eller tubulin, kan være en slik tilnærming.
Genetisk kodet vev-spesifikke merkings metoder, for eksempel EC-tagging47,48 eller PABP-merking49,50 for å isolere RNA har blitt utviklet i de senere år, noe som kan bidra til å oppnå en virkelig av en vevs spesifikk RNA-prøve. Men EC-merking krever konstant mating av fluer47 og dermed ikke er aktuelt under puppestadiet stadier. Følsomheten og fullstendigheten av PABP-merket transcriptomes kan ha begrensninger51. FACS tilnærminger for å isolere enkelte muskelfibre er komplisert av den store størrelsen og syncytial natur IFMs. Intakt52,53 stil tilnærminger kan brukes til å isolere spesifikke subcellulære-rom fra IFMs, som kan være nyttig for å isolere rene populasjoner av IFM kjerner eller mitokondrier. Manuell dissections er fortsatt gjeldende standard for å oppnå intakt IFM vev for de fleste nedstrøms applikasjoner.
Prøvekvaliteten avhenger av flere kritiske trinn i disseksjon prosessen. Dissections er teknisk krevende, med disseksjon hastighet og prøve renhet som øker med erfaring. Dissekere for korte perioder (20-30 min) i kjølt buffer uten vaskemiddel og umiddelbart frysing bidrar til å bevare prøve integritet, som har vært observert tidligere for musen sene isolasjon54. IFMs kan med hell tørr-frosset etter fjerner alle buffer fra pellet, men spesielt for RNA isolasjon, fryser prøver i isolasjon buffer har en tendens til å gi bedre resultater. IFMs fra opptil 20 separate dissections kombineres før RNA eller protein isolering, slik at skalering opp og samle nok materiale, selv fra tidlig tidspunkter eller mutanter16,32, for nedstrøms analyse.
For RNA-programmer kan det mest kritiske trinnet være isolering av RNA-en selv. Guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat – fenol-kloroform isolering (metode 1 ovenfor) overgår de fleste kommersielle settene som er testet og, som tidligere nevnt, er betydelig rimeligere55. Variasjonen observert i RNA isolering gir med kommersielle kits er i overensstemmelse med tidligere observasjoner56,57. Vi legger ytterligere glykogen under isopropanol nedbør for å hjelpe gjenopprette alle RNA. Utover RNA-utbyttet er det viktig å verifisere RNA-integriteten for å sikre at prøven ikke har blitt fragmentert eller degradert under disseksjon-og isolasjons prosessene. Det er også viktig å jobbe RNase-Free. Endelig, valg av RT-Kit kan påvirke følsomheten til den omvendte transkripsjon prosessen. Selv om det ikke ofte diskutert i detalj, alle disse punktene påvirke kvaliteten på IFM prøven og data innhentet fra nedstrøms applikasjoner.
Flere viktige modifikasjoner sette protokollen bortsett fra eksisterende IFM disseksjon protokoller. Selv om en detaljert disseksjon protokoll for IFM immunofluorescence eksisterer19, denne protokollen presenterer en annen tilnærming til puppestadiet dissections som gjør at mer rask isolering av IFM vev. Dette gjør det mulig samling av store mengder IFM vev (relativt sett) med begrenset disseksjon ganger for å hindre proteom eller transcriptome endringer. Andre protokoller beskriver Disseksjon av voksen IFM for visualisering GFP farging i individuelle myofibrils39 eller for farging av larvestadiet Body-wall muskler58, men de ikke ta disseksjon på puppestadiet stadier eller for isolering av RNA eller protein. Denne tilnærmingen er også forskjellig fra den eksisterende protokollen for microdissection av puppestadiet IFMs fra cryosections38, som kan generere en renere IFM prøve, men er mer arbeidsintensiv og produserer mindre materiale. I forhold til andre raske voksne IFM disseksjon protokoller38,39, IFMs er isolert i PBS buffer uten vaskemiddel å begrense stress induksjon og andre store uttrykk endringer.
Nøkkelen forhånd i denne protokollen er inkluderingen av en live, fluorescerende reporter, slik isolering av IFMs ved tidlig puppestadiet stadier. Vi Standardly bruke Mef2-GAL459 kjører enten UAS-CD8:: GFP eller UAS-GFP:: GMA60. Dette gjør at differensial merking av IFM (fly musklene er sterkere merket og annerledes formet enn andre puppestadiet muskler) samt ytelse av GAL4-UAS-baserte manipulasjoner, for eksempel redning eller RNAi eksperimenter. Det er også mulig å kombinere Mef2-GAL4 med badekar-GAL80TS å unngå RNAi-assosiert tidlig dødelighet eller med UAS-Dcr2 å øke RNAi effektivitet40.
Der er i tillegg GAL4 sjåførene eller GFP-linjer anvendelig det variere inne muskelen-type spesifisitet, Temporal gjengivelsen mønster, og sjåfør styrke19,61 det kanskje bli brukt istedet for Mef2-GAL4. For eksempel er Act88F-GAL4 først uttrykt rundt 24 h APF, slik at den ikke kan brukes til tidligere tidspunkter; men det sterkt etiketter IFM og kan være nyttig for å unngå RNAi-assosiert tidlig dødelighet. Ham-GFP eller Act88F-GFP Label IFM, igjen med timelige restriksjoner, men de unngår GAL4 avhengighet av markør uttrykk og kan være nyttig i kombinasjon med en mutert bakgrunn av interesse. Lister over andre mulige markerings linjer er tilgjengelige19. Det bør også bemerkes at bruk av transgenes og GAL4/UAS systemet kan forårsake genuttrykk gjenstander, så det er viktig å bruke egnede kontroller, for eksempel sjåføren linjen krysset til vill-type bakgrunn belastning, slik at slike gjenstander er antagelig det samme i alle prøvene.
Med den med følgende videoen, denne detaljerte protokollen tar sikte på å gjøre puppestadiet IFM disseksjon mer tilgjengelig og fremme bruken av omics tilnærminger for å studere muskelutvikling. Kobling kraften i Drosophila genetikk og cellebiologi med biokjemi og omics analyser tilgjengelig gjennom dissekert IFM har potensial til å fremme mekanistisk forståelse av myogenesis og muskel funksjon. Fremtidige studier knytte systemer-nivå observasjoner av transcriptome og proteom regulering til metabolske og funksjonelle utganger vil gi en dypere forståelse av muskel-type spesifikk utvikling og patogenesen av muskellidelser.

Moderne omics teknologi gir viktig innsikt i muskelutvikling og mekanismene underliggende menneskelige muskellidelser. For eksempel, analyse av transcriptomics data kombinert med genetisk og biokjemiske verifisering i dyremodeller har avdekket at tap av skjøting faktor RBM20 årsaker utvidede kardiomyopati på grunn av sin regulering av et målnettverk av mer enn 30 sarkomerlengde gener som tidligere er assosiert med hjertesykdom, inkludert titin1,2,3.
I et annet eksempel har studier fra cellekultur, dyremodeller og menneskelige pasienter vist at myotonisk dystrofi skyldes en forstyrrelse i RNA-regulering på grunn av opptak av Muscleblind (MBNL) og oppregulering av CELF14,5. Korset-regulatoriske og timelige dynamikk mellom MBNL og CELF1 (også kalt CUGBP1 eller Bruno-like 2) bidra til å forklare vedvarende embryonale skjøting mønstre i myotonisk dystrofi pasienter. I tillegg bidrar det store nettverket av misregulated mål å forklare komplekse natur av sykdommen4,6,7,8. Et flertall av slike studier benytte omics tilnærminger i genetisk modell organismer å forstå mekanismene underliggende menneskelige muskel sykdom. Videre understreker de viktigheten av første forståelse Temporal og vev-type spesifikke genuttrykk, protein modifikasjon, og metabolske mønstre i sunn muskel å forstå endringer i syke eller aldrende muskel.
Drosophila melanogaster er en annen veletablert genetisk modell organisme. Strukturen av sarkomerlengde så vel som individuelle sarkomerlengde komponenter er svært bevart fra fluer til virveldyr4,10, og den indirekte fly musklene (IFMs) har blitt en kraftig modell for å studere flere aspekter av muskelutvikling11,12. Først fibrillær fly musklene er funksjonelt og morfologisk forskjellig fra rørformede kroppen musklene11,13, tillater gransking av muskel-type spesifikke utviklingsmessige mekanismer. Transkripsjon faktorer inkludert Wolframs store (Salm)14, Extradenticle (EXD), og Homothorax (HTH)15 har blitt identifisert som fibrillær skjebne regulatorer. I tillegg, nedstrøms av Salm, den CELF1 homologe Bruno1 (Bru1, året) dirigerer en fibrillær-spesifikk skjøting program16,17.
For det andre, IFMs er en viktig modell for å forstå prosessen med myogenesis seg selv, fra myoblast fusjon og myotube vedlegg til myofibrillogenesis og sarkomerlengde modning9,18,19. Tredje, Drosophila genetikk tillater gransking av bidrag fra individuelle proteiner, protein domener, og protein isoformene til sarkomerlengde formasjon, funksjon, og Biofysiske egenskaper20,21,22 ,23. Endelig, IFM modeller har blitt utviklet for studiet av flere menneskelige muskellidelser, som myotonisk dystrofi, myofibrillære myopatier, muskel degenerative lidelser, actinopathies, etc.24,25,26 ,27, og har gitt viktig innsikt i sykdoms mekanismer og potensielle terapier28,29,30. Således, Drosophila er en nyttig modell for å løse mange åpne spørsmål i myogenesis feltet, inkludert mekanismer av muskel-type spesifikk transkripsjon, skjøting, og kromatin regulering, samt til rollen som metabolisme i muskelutvikling. Anvendelsen av moderne omics teknologier, spesielt i kombinasjon med det store utvalget av genetiske, biokjemiske og celle biologiske analyser tilgjengelig i Drosophila, har potensial til å dramatisk fremme forståelsen av muskel utvikling, aldring og sykdom.
IFMs er de største musklene i fly, som spenner over nesten 1 mm over hele lengden av thorax i voksne31,32. Imidlertid genererer denne lille størrelsen utfordringen med å skaffe nok prøve å anvende omics teknologier i Drosophila i en vev-type spesifikk måte. Videre er IFMs en del av den voksne muskulaturen som dannes under puppestadiet etapper. Myoblasts sikring å danne myotubes, som festes til sener rundt 24 h etter puparium formasjon (APF) og gjennomgår en komprimerings trinn nødvendig å initiere myofibrillogenesis rundt 30 h APF (figur 1a-D)18,33, i 34.
Den myofibers deretter vokse til span hele lengden av thorax, med myofibrils gjennomgår en innledende vekstfase fokusert på sarkomerlengde tillegg til ca 48 h APF, og deretter overgangen til en modnings fase, der sarcomeres vokse i lengde og bredde og er ombygd for å etablere stretch-aktivering av 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Utbruddet av fiber modning er minst delvis kontrollert av Salm og E2F32,36,37, og flere IFM-spesifikke sarkomerlengde protein isoformene hvis skjøting styres av Bru1 er innarbeidet i løpet av denne Phase16,17. Modne fluer Eclose fra 90-100 h APF. Dette betyr at for å studere muskelutvikling, IFM må isoleres med tilstrekkelig mengde, kvalitet og renhet fra flere puppestadiet tidspunkter å forenkle analyse ved hjelp av omics tilnærminger.
Flere protokoller for IFM disseksjon har blitt publisert. Selv om disse protokollene fungerer bra for de tiltenkte applikasjonene, er ingen ideelle for omics tilnærminger. Protokoller som bevarer IFM morfologi for immunofluorescence av puppestadiet og voksne IFMs19, isolere IFM fibre for mekanisk evaluering31, eller utnytte microdissection av puppestadiet IFM fra cryosections38 er for spesialisert og tid og arbeidsintensiv til rimelig å få tilstrekkelige mengder IFM vev for omics applikasjoner. Andre protokoller er utviklet for rask Disseksjon av spesifikt voksen IFM38,39, således ikke gjelder for puppestadiet stadier, og bruke buffere som ikke er ideelle eller kan være uforenlig med for eksempel RNA isolasjon. Dermed er det behov for å utvikle nye tilnærminger for å isolere puppestadiet IFM for biokjemi eller omics applikasjoner.
Her presenterer vi en protokoll for Disseksjon av IFM under puppestadiet stadier som har blitt brukt med hell for mRNA-SEQ analyse fra 16 h APF gjennom voksen etapper16,32. Protokollen sysselsetter en grønn fluorescerende protein (GFP) etikett for å identifisere IFMs på alle stadier av puppestadiet og voksen utvikling, slik at Live disseksjon under et fluorescerende dissekere mikroskop. Tilnærmingen er mindre arbeidskrevende, med en høyere gjennomstrømning enn eksisterende IFM disseksjon protokoller. Dette gir rask isolering og kryonisk bevaring av prøver, genererer nok materiale etter flere runder med disseksjon for omics tilnærminger så vel som for standard omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) eller vestlig blotting.
Vi presentere protokollen i to deler, demonstrere hvordan du raskt analysere IFMs både før 48 h APF (under tidlig forvandling, når IFM vedlegg er mer spinkel) og etter 48 h APF (når puppestadiet kroppen plan og IFM vedlegg er godt definert). Vi viser at vi kan isolere høy kvalitet RNA fra dissekert IFMs på alle tidspunkter og presentere data på ulike tilnærminger til RNA isolasjon og omvendt transkripsjon. Til slutt viser vi anvendelsen av disseksjon protokollen til mRNA-SEQ, Mass massespektrometri, og RT-PCR ved hjelp av CELF1 homologe Bruno1 som et eksempel. Vi viser misexpression av sarkomerlengde protein isoformene i Proteomikk data fra Bruno1 mutant IFM og undersøke Bruno1 regulering av C-terminalen skjøte tilfelle myosin tung kjede (MHC). Disse resultatene illustrerer hvordan omics data kan gi en dypere forståelse av biologiske fenomener, utfyller genetiske og biokjemiske eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila Flight muskelen er en kraftfull modell for å studere ulike prosesser som transcriptional regulering, alternative skjøting, metabolisme, og mechanobiology, som alle påvirker muskelutvikling og myofibrillogenesis. Omics data, slik som de som genereres av masse massespektrometri eller dype sekvensering, kan gi viktig mekanistisk innsikt i disse biologiske prosesser. For slike tilnærminger, er det fordelaktig å analysere vev-spesifikke prøver å øke både selektivitet og spesifisitet av omics fingeravtrykk. Her presenterer vi en protokoll for Disseksjon av fluorescerende-merket fly muskelen fra live pupae å generere svært beriket muskel prøver for omics applikasjoner. Vi for det første beskrive hvor å analysere flyreise muskelen for tidlig puppestadiet scener (< 48 h etter puparium formasjon [APF]), når det muskelen er merkes av grønn fluorescerende protein (GFP) merking. Vi så beskrive hvor å analysere muskelen fra sen pupae (> 48 h APF) eller voksen, når muskelen er gjenkjennelig under en dissekere mikroskop. Den med følgende video protokollen vil gjøre disse teknisk krevende dissections mer allment tilgjengelig for muskel-og Drosophila forskningsmiljøer. For RNA-programmer, analysen vi mengden og kvaliteten av RNA som kan isoleres på ulike tidspunkter og med ulike tilnærminger. Vi viser videre at Bruno1 (Bru1) er nødvendig for et timelig skifte i myosin tunge kjeden (MHC) skjøting, viser at dissekert musklene kan brukes til MRNA-SEQ, masse massespektrometri, og omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) Programmer. Denne disseksjon protokollen vil bidra til å fremme vev-spesifikke omics analyser og kan generelt anvendes for å studere flere biologiske aspekter av myogenesis.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila fly muskelen er en kraftfull modell for å studere transcriptional regulering, alternative skjøting, metabolisme, og mechanobiology. Vi presenterer en protokoll for Disseksjon av fluorescerende-merket fly muskelen fra live pupae å generere svært beriket prøver ideell for Proteomikk og dyp-sekvensering. Disse prøvene kan tilby viktig mekanistisk innsikt i ulike aspekter av muskelutvikling.

Disseksjon av Drosophila melanogaster fly musklene for omics tilnærminger

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Protokollen letter disseksjon av GFP-merket indirekte flymuskel fra Drosophila på ulike tidspunkter under pupaeutvikling for å vurdere endringer i gen- og proteinuttrykk. Ved hjelp av disse teknikkene kan en høy beriket flymuskelprøve med minimal RNA-proteinforringelse oppnås som er egnet for RT-PCR, vestlig flekk eller omiske tilnærminger. Disse spesialiserte disseksjonene krever praksis og dyktighet, men antall pupper som kan dissekeres og kvaliteten på prøvene forbedres med erfaring.Visuell demonstrasjon av denne disseksjonen er avgjørende for å bestemme hvordan man skiller flymuskler fra ikke-muskelvev og letter rask isolering av flymuskler fra pupale prøver. For å iscenesette puppen, bruk en fuktet pensel til å samle og overføre pre-pupae til en 60 millimeter petriskål, og sex puppene under et kikkert mikroskop. Hanner identifiseres ved tilstedeværelse av testiklene, som vises som gjennomsiktige globuser på den ellers ugjennomsiktige puppen.Etter merking av parabolen med tiden, datoen og genotypen av fluene, eldes puppene i en 25 til 27 grader Celsius inkubator til riktig stadium. For IFM-disseksjon før 48 H APF, bruk en fuktet pensel til å overføre den riktig iscenesatte puppen til en svart dissekeringsfat ca. 2/3 fylt med kjølt PBS. Under det fluorescerende disseksjonsmikroskopet bruker du en 5 tang til å presse en av puppene til bunnen av den svarte disseksjonsfatet.Juster mikroskopet zoom og fokus til puppene kan tydelig visualiseres. Bruk ett par tang for å forstå dukkens fremre, poke puppene med en enkelt spiss av et andre par tang, litt utenfor midten i magen, like bak thoraxen. Bruk det første paret tang til å fjerne den fremre halvdelen av pupal tilfellet, og å klemme den eksponerte puppen like bak thoraxen for å skille magen fra thoraxen.Deretter klemmer du forsiktig den fremre delen av thoraxen for å eksponere de fluorescerende merkede IFM-ene. Bruk deretter tangen til å kaste det gjenværende til motsatt side av fatet, og dissekere den påfølgende puppen på samme måte. Når alle puppene er dissekert, bruk tangene til å samle IFM-fibrene, og organiser fibrene i en haug nederst på den svarte disseksjonsfatet.Bruk tangen til å skyve eventuelle rester ut av synsfeltet, og fjern eventuelle ikke-IFM muskler, fett, neglebånd eller annet uønsket vev fra prøvene. Deretter bruker du en klippet pipettespiss til å overføre bunken av IFMer til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder 250 mikroliter kjølt PBS. For IFM-disseksjon etter 48 H APF, bruk en lett fuktet pensel til å overføre den iscenesatte puppen på en stripe med dobbeltsidig klebrig tape montert på et mikroskopsklie.Orienter puppene i en linje, ventral side ned, og fremre mot bunnen av lysbildet. Når alle puppene er plassert, bruk tang til å erte fra hverandre og åpne det første pupale tilfellet over fremre spirakler, og skyv forsiktig et par tang dorsally, mot bakre, kutte pupal tilfelle som tangene beveger seg. Frigjør puppene fra det åpnede tilfellet, og overfør umiddelbart puppene til en dråpe PBS på et annet mikroskopsklie.Når alle puppene er frigjort, bruk fin saks for å kutte puppenes underliv bort fra thoraxen, og skyv magen inn i en egen haug. Når alle thoraxene er fjernet, bruk et stykke vevpapir for å fjerne flertallet av PBS og haugen av underliv. Tilsett en dråpe fersk, kjølt PBS til de resterende thoraxene, før du bruker saksen til å kutte fra hodet langs den langsgående kroppsaksen i en enkelt bevegelse for å dele thoraxen i to.Når alle puppene er dissekert, bruk de 5 tangene til å velge en av hemiseksjonene, og sett forsiktig inn tuppene til en tang over og under midten av IFMs. Hold det første paret tang stille, bruk fin saks for å kutte den ene enden av IFM bort fra skjellaget og sener, før du roterer puppene 180 grader, slik at den andre enden av IFM kuttes fri fra skjellaget og sener. Bruk tang til å overføre IFM-bunten fra thoraxen til kanten av PBS-boblen, ved hjelp av vannspenning for å holde bunten på plass.Deretter skyver du til motsatt side av lysbildet, og dissekerer resten av IFMs på samme måte. Når alle IFMs har blitt samlet, bruk 5 tang for å fjerne eventuelle hoppe muskel eller cuticle fragmenter som kan ha funnet veien inn i prøvene. Bruk deretter vannspenningen til å forsiktig fange opp dissekerte IFMer mellom et par tang, og plasser IFMs i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder 250 mikroliter kjølt PBS.mRNA-sekvenseringsdata fra BRUNO1 IR-ifmer viser endringer i uttrykk på genenhetsnivå sammenlignet med wildtypesekvenseringsdata. Ved hjelp av hele proteommassespektrometri på dissekerte IFMer, observeres en lignende regulering på protein- og proteinisoformnivåene. Etter innsetting av en proteinfellelinje i den endelige intronen av Mhc, kan inkorporering av GFP-merket protein observeres i IFM som to prikker på hver side av M-linjen ved 90 H APF, mens GFP-signalet i benet kan observeres jevnt over sarcomere M-linjen.Når du bruker RT-PCR på dissekert IFM, kan en Mhc isoformbryter fra den GFP-merkede exon 34 til 37-hendelsen til den umerkede exon 34 til 35-hendelsen oppdages mellom 30 og 48 timer etter pupariumdannelse ved 27 grader Celsius. Fra mRNA sekvensering data, ben og hoppe muskel vev uttrykke alle tre Mhc isoformer, opprettholde uttrykk for GFP-merket isoform i modne muskler. Både Spalt major mutant og BRUNO1 IR-IFM, klarte ikke å slå av uttrykk for GFP-merket Mhc isoform som de utvikler, noe som resulterer i en isoform uttrykk profil som ligner på ben og hoppe muskelvev.Husk at disseksjonene skal utføres på under 30 minutter for å forhindre RNA-nedbrytning. Og, for å ta vare på å begrense forurensning av andre celletyper. Denne metoden genererer IFM-berikede prøver egnet for biokjemiske tilnærminger som RT-PCR, eller vestlig blotting, samt omic stil tilnærminger, som massespektrometri, høy gjennomstrømning sekvensering, kromatin konformasjon fangst, og metabolomics.Disse disseksjonene kan utfylle de kraftige genetiske tilnærmingene i Drosophila med data på systemnivå for å undersøke de grunnleggende mekanismene for utvikling og genregulering.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantifiserende abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høy fett diett fôring og høy gjennomstrømning Triacylglyceride analysen i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Måle trening nivåer i Drosophila melanogaster bruke den roterende øvelse kvantifisering System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

TreadWheel: Intervall trening protokollen for forsiktig indusert øvelse i Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genetisk Screen å identifisere Novel nervecellene gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Bruk av Drosophila S2 Cells for Live Imaging av Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

En screeningmetode for identifisering av heterochromatinfremmende legemidler ved hjelp av drosofil

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...