Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Agradecemos a Andreas Ladurner e Frank schnorrer pelo apoio generoso. Agradecemos a Sandra Esser pela excelente assistência técnica e Akanksha Roy para gerar os dados de espectrometria de massas. Nós reconhecemos os centros de estoque de Bloomington e de Viena para fornecer moscas. Agradecemos ao Core Facility BioImaging para obter ajuda com a imagem confocal e o Zentrallabor für Proteinanalytik para análise de amostras de espectrometria de massas, tanto no centro biomédico LMU (Martinsried, DE). Nosso trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungs gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), o centro de ciência integrada de proteínas de Munique (CIPSM) na Ludwig-Maximilians-University München (MLS), o Frederich-Bauer Stiftung (MLS), e o International Max Escola de pesquisa de Planck (EN).

1. encenando as pupas
<ol><li>Aumentar as moscas do genótipo desejado em frascos (Figura 1E). Ou fazer uma nova aleta do estoque de dissecção ou definir uma cruz com pelo menos 20 fêmeas moscas virgens. Manter garrafas até que as moscas começam a pupate.</li>
	<li>Colete pré-pupas com um pincel umedtado e transfira para o papel de filtro molhado em uma placa de Petri de 60 mm (Figura 1F).</li>
	<li>Sexo as pupas, coletando o gênero apropriado para o experimento (Figura 1G). Os machos são identificados pela presença de testículos, que aparecem como bolas translúcidas na pupa de outra forma opaca.</li>
	<li>Rotule a placa de Petri com a hora, a data e o genótipo, depois a idade das pupas até o estágio desejado (Figura 1H). Nota: Manter cruzes/estoques e pupas da idade em uma incubadora temperatura-controlada (isto é, 25 ° c ou 27 ° c para cruzes de RNAi, como a atividade aumentada de Gal4 em umas temperaturas mais elevadas aumenta a eficiência do Knock-down40). Assegure-se de que a humidade seja suficientemente alta para que as pupas não se secam ao envelhecer vários dias.</li>
</ol>2. IFM dissecção antes 48 h APF
<ol><li>Monte o equipamento necessário, incluindo dois #5 fórceps grau biologia, uma pipeta, pontas de pipeta, gelo seco, e (para amostras de RNA) reagente de isolamento (ver tabela de materiais). Além disso, Chill preto dissecando pratos (ver tabela de materiais), 1x fosfato tampão salina (PBS) buffer, e 1,5 ml tubos de microcentrífuga no gelo.</li>
	<li>Usando um pincel molhado, transfira pupas encenadas para um prato de dissecação preto preenchido cerca de dois terços com frio 1X PBS (Figura 2a, B). Mude para um microscópio de dissecação fluorescente. Nota: Use quantas pupas como pode ser dissecado dentro de uma janela de tempo de 30 min. Dependendo da experiência, isso varia de 3 – 15 pupas. Veja métodos suplementares para a discussão de alternativas aos pratos de dissecação pretos.</li>
	<li>Usando #5 fórceps, empurre uma das pupas para o fundo de um prato de dissecação preto e ajuste o zoom do microscópio e foco para ver claramente a pupa (Figura 2C).</li>
	<li>Segure o anterior da pupa com um fórceps (Figura 2D), em seguida, pique as pupas com uma única ponta do outro fórceps ligeiramente fora do centro no abdômen, logo atrás do tórax. Isto prende a pupa no lugar e impede que os IFMs movam no abdômen (Figura 2e). Nota: Comece cronometrar o comprimento da dissecção deste ponto, assim que a integridade do pupal for interrompida. Use um comprimento definido de dissecção (por exemplo 20 – 30 min) para minimizar a morte muscular e alterações transcriptomicas e proteômicas associadas. Dissecar o maior número de moscas possível neste período de tempo.</li>
	<li>Usando o primeiro fórceps, retire a metade anterior do caso pupal (Figura 2F).</li>
	<li>Use o mesmo fórceps para beliscar as pupas expostas logo atrás do tórax, e separar o abdômen do tórax (Figura 2G).</li>
	<li>Utilizando o fórceps, aperte suavemente a parte anterior do tórax (por < 35 h APF) ou abra o tórax para expor os IFMs fluorescentamente rotulados (Figura 2h). O IFMs desaparecerá facilmente da epiderme, pois os anexos tendinosos nos tempos iniciais são frágeis. Descarte a carcaça restante usando fórceps para empurrá-lo para o lado oposto do prato.</li>
	<li>Repetindo as etapas 2.3 – 2.7, dissecar pupas adicionais.</li>
	<li>Colete as fibras IFM com fórceps e organize-as em uma pilha na parte inferior do prato de dissecação preto (Figura 2I, J). Retire todos os detritos empurrando-o para fora do campo de visão usando fórceps. Nota: Com a prática, as pontas do fórceps podem ser trazidas na proximidade próxima sem tocar-se. Esta técnica pode ser usada para agarrar frouxamente IFMs sem destruí-los. Os métodos alternativos incluem delicadamente empurrando ou levantando o IFMs com uma única ponta ou fórceps completamente fechado, ou tomando algum tecido gordo ou outro com o IFM e removendo a gordura como descrito na etapa 2,10.</li>
	<li>Controle de qualidade da amostra de músculo IFM, utilizando o fórceps para remover os músculos não IFM, gordura, cutícula, etc. da amostra (Figura 2K, L). Nota: Com Mef2-Gal4, IFM é rotulado mais fortemente do que outros tipos musculares em tempos iniciais (Figura 2k, k '), permitindo a remoção de músculo de salto e músculos larvares com base na intensidade de fluorescência e forma muscular. A gordura e o tecido da cutícula parecem diferentes e não são rotulados por uma etiqueta de fluorescência específica do músculo (Figura 2k, k '). Consulte a seção de discussão para outras linhas Gal4 que rotulam IFM.</li>
	<li>Usando uma ponta cortada da pipeta, transfira a pilha de IFMs em um tubo do microcentrifugador de 1,5 mL enchido com 250 μL de 1x refrigerado PBS (Figura 2M-O). Prossiga imediatamente para a seção 4. Nota: As amostras de IFM podem ser perdidas simplesmente aderindo ao lado da ponta da pipeta. O amortecedor de pipetagem acima e para baixo diversas vezes antes de coletar ifms pode fazer pontas padrão menos pegajosas, e as pontas siliconized ou com (PFA) (veja a tabela dos materiais) com umas mais baixas tensões de superfície podem ajudar a impedir a perda da amostra.</li>
</ol>3. dissecção IFM após 48 h APF
<ol><li>Monte o equipamento necessário que inclui dois #5 fórceps da classe da biologia, tesouras finas, corrediças de vidro padrão do microscópio, fita da dobro-vara, pipeta, pontas da pipeta, gelo seco, e (para aplicações do RNA) reagente da isolação (veja a tabela dos materiais). Chill o 1X PBS e tubos de microcentrífuga no gelo.</li>
	<li>Usando um pincel levemente molhado, transfira as pupas encenadas para uma faixa de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de microscópio (Figura 3a). Coloc as pupas em uma linha orientada na mesma orientação (ventral para baixo e anterior para a parte inferior da corrediça). Nota: Tenha cuidado para não usar muita água no pincel ou filtro, ou as pupas não vai ficar bem. Se as pupas não furar, seque-os pela primeira transferência para um filtro seco ou papel tissue. Monte como pupas muitos como pode ser dissecado dentro de uma janela de tempo de 30 min, idealmente ~ 10 pupas.</li>
	<li>Retire a pupa do caso pupal. Use fórceps para provocar os pedaços e abrir o caso pupal acima das espiráculos anteriores (Figura 3B).</li>
	<li>Deslize suavemente um par de fórceps dorsalmente em direção ao posterior, cortando o caso pupal como o movimento fórceps (Figura 3B '). Tenha cuidado para não romper a pupa subjacente. Libere a pupa do caso aberto e transfira-a imediatamente a uma gota de 1X PBS em uma segunda corrediça do microscópio (Figura 3B ", C).</li>
	<li>Repita as etapas 3,3 e 3,4 para todas as pupas na linha e, em seguida, defina o slide de fita dupla vara de lado.</li>
	<li>Usando a tesoura fina, corte o abdômen da pupa longe do tórax e empurre-o para uma pilha separada (Figura 3d, d '). Repita para as pupas restantes. Nota: Comece cronometrar o comprimento da dissecção com etapa 3,6, assim que a integridade do pupal for interrompida. Dissecar o maior número possível de moscas em 20 – 30 min para evitar a morte celular e alterações transcriptomicas e proteômicas associadas. Quando dissecando 1 d adultos ou > 90 h pupas, muitas vezes é conveniente para etapas posteriores para remover adicionalmente a cabeça com a tesoura fina.</li>
	<li>Usando um papel tissue, retire a maioria do 1X PBS (geralmente nublado com gordura suspensa), bem como a pilha de algúmens (Figura 3E). Adicionar uma gota de fresco, refrigerado 1X PBS para os restantes thoraxes.</li>
	<li>Use a tesoura para cortar o tórax ao meio (Figura 3f, f ') cortando da cabeça para baixo o eixo longitudinal do corpo em um único movimento. Alternativamente, se a cabeça foi removida, primeiro insira a tesoura onde a cabeça foi anexada e corte a metade superior do tórax longitudinalmente entre o IFMs. Em seguida, corte o lado ventral do tórax com um segundo corte na mesma orientação.</li>
	<li>Repita as etapas 3,7 e 3,8 para que todas as pupas sejam dissecadas, gerando uma pilha de hemisections do tórax perto do centro da corrediça. Assegure-se de que há bastante refrigerado 1X PBS no slide para que as hemisections não secar. Nota: Após 48 h APF, os IFMs são grandes bastante ser visíveis um microscópio de dissecação padrão ao olho treinado. Neste ponto do protocolo, os músculos com uma etiqueta fluorescente podem ser movidos para um espaço de dissecação fluorescente para auxiliar na identificação de IFM ou para fins de treinamento, mas isso não é necessário.</li>
	<li>Dissecar o IFMs fora do tórax. Isolar um dos hemisections usando o fórceps #5 (Figura 3G, H). Insira suavemente as pontas de um fórceps acima e abaixo do meio do IFMs (Figura 3G ', H '). Enquanto segurando o primeiro fórceps ainda, use tesouras finas para cortar uma extremidade do IFM longe da cutícula e tendões. Em seguida, corte a outra extremidade do IFM livre da cutícula (Figura 3G ' ', H ' '). Nota: Dependendo da orientação do tórax após o primeiro corte IFM, é útil girar o tórax 180 ° para que o segundo corte IFM seja mais fácil de executar.</li>
	<li>Retire o pacote IFM do tórax com fórceps (Figura 3G ' ' ', H ' ' '), transferindo-o para a borda da bolha PBS para usar a tensão da água para segurá-la no lugar (Figura 3I). Empurre a carcaça para o lado oposto do slide. Repita para as hemisections restantes do tórax, gerando uma coleção de IFMs dissecados. Nota: Se o IFMs não permanecer em uma pilha pura, remova algum do 1X PBS com um tecido. Tenha cuidado para não deixar todos os PBS evaporarem, e garantir que os ifms dissecados e hemitórax permanecem cobertos por tampão.</li>
	<li>Após a dissecação de todos os IFMs, execute rapidamente um controle de qualidade no músculo dissecado. Usando #5 pinça, remover qualquer músculo de salto ou fragmentos de cutícula que podem ter encontrado o seu caminho para a amostra (Figura 3J-K ' '). Nota: O músculo do salto parece diferente de IFM. Se dissecando Mef2-Gal4 rotulado músculo fluorescência, o músculo de salto tem uma fluorescência mais fraca e uma forma e textura diferentes. a luz normal, parece quase translúcido, enquanto o IFMs são um opaco, amarelo leitoso (Figura 3j-j ' ', K).</li>
	<li>Usando a tensão da água, Capture (mas não Squish) os IFMs dissecados entre um par de fórceps (Figura 3L). Transfira o IFMs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-preenchido com 250 μL de 1X PBS refrigerado (Figura 3M). Prossiga imediatamente com a secção 4. Nota: Quando as pontas do fórceps são trazidas na proximidade de se e levantado fora de uma solução do amortecedor, a tensão da água faz com que uma bolha do amortecedor seja capturada entre as pontas do fórceps. Se IFMs também estão presentes nesta bolha, eles podem ser levantados para fora da solução e facilmente transferidos para outro receptáculo cheio de buffer. É importante espremer o fórceps para trazer as pontas perto de uma outra sem tocar-se, para evitar macerar o tecido capturado na bolha do amortecedor.</li>
</ol>4. pellet e preservar a amostra IFM
<ol><li>Pellet o IFMs por centrifugação do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 3 – 5 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa (Figura 4a, B).</li>
	<li>Retire o tampão utilizando uma ponteira de pipeta (Figura 4C).
</li>
	<li>Para aplicações de RNA, ressuscite o pellet IFM em 50 – 100 μL do buffer de isolamento de RNA desejado (ver tabela de materiais, Figura 4D). Caso contrário, avance para o passo 4,4. Nota: IFMs pode ser seco-congelado após a etapa 4,2 para preparações da espectrometria maciça ou isolação do RNA com jogos comerciais (veja resultados representativos). Para aplicações de RNA, melhores resultados são obtidos por imediatamente ressuscitava e congelando a pelota IFM em buffer de isolamento.</li>
	<li>Congelar a amostra em gelo seco ou congelamento de pressão em nitrogênio líquido (Figura 4E). Armazene em-80 ° c até que apronte para etapas subseqüentes na preparação da amostra para a análise a jusante. Nota: Após a criopreservação, as amostras podem ser armazenadas por vários meses antes do processamento para investigação a jusante.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, nós apresentamos a técnica básica para dissecar o ifms de Drosophila dos puppae adiantados e do tarde-estágio para a isolação a jusante da proteína, do ADN, do RNA ou das outras macromoléculas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para dissecar IFM de moscas adultas. Demonstramos a utilidade de nosso protocolo de dissecção para aplicações de mRNA-Seq, proteômica e RT-PCR. Com a melhoria contínua das tecnologias de Ômicas para permitir a análise das amostras com menos material de partida e umas mais baixas concentrações da entrada, estas dissecções tornar-se-ão provavelmente valiosas para muitas aplicações adicionais. Como ifms são um modelo estabelecido para miopatias humanas4,24 e desenvolvimento específico do músculo-tipo9,12, nós imaginamos, por exemplo, Metabolomics IFM-enriquecidos, investigações da conformação da cromatina via 3C ou 4C, avaliação da rede de emenda através das interações do grampo ou phospho-Proteomics do myofibrillogenesis.
É importante considerar que estas dissecções produzem uma amostra enriquecida para IFM em vez de uma amostra pura de IFM. Isto é inevitável devido à inervação do neurônio do motor, aos acessórios do tendão e à invasão tracheal de fibras de músculo. A análise de Bioinformática pode ser usada para identificar genes ou proteínas IFM enriquecidas, mas são necessárias novas experiências para demonstrar que elas são de fato IFM-específicas. A pureza da amostra pode ser ensaiada usando marcadores específicos do tecido publicados, como a listra45 (tendão), Act79B,4,44 (músculo tubular), Act88F15 (IFM) ou Syb46 (específico neuronal). Pode ser possível usar esses marcadores para normalizar conjuntos de dados para o conteúdo específico do IFM, mas os usuários são advertidos de que as alterações temporais na expressão de genes usados para normalização, por exemplo, genes ou tubulina específicos de IFM, podem viés tal abordagem.
Os métodos de rotulagem específicos do tecido genetically codificados, por exemplo EC-etiquetar47,48 ou PABP-etiquetando49,50 para isolar o RNA foram desenvolvidos nos últimos anos, que podem ajudar a obter verdadeiramente amostra de RNA específica do tecido. No entanto, a marcação CE requer alimentação constante de moscas47 e, portanto, não é aplicável durante os estágios pupais. A sensibilidade e a completude dos transcriptoma rotulados por PABP podem ter limitações51. As aproximações de FACS para isolar fibras de músculo individuais são complicadas pelo tamanho grande e pela natureza sincicial de ifms. INTACT52,as aproximações do estilo53 podem ser aplicadas para isolar subcellular-compartimentos específicos de ifms, que podem provar útil para isolar populações puras de núcleos ou de mitocôndria de IFM. As dissecções manuais são ainda o padrão atual para obter o tecido intacto de IFM para a maioria de aplicações downstream.
A qualidade da amostra depende de várias etapas críticas no processo de dissecção. As dissecções são tecnicamente exigentes, com velocidade de dissecção e pureza da amostra aumentando com a experiência. A dissecação por curtos períodos de tempo (20 – 30 min) em tampão refrigerado sem detergente e o congelamento imediato ajuda a preservar a integridade da amostra, como já foi observado anteriormente para o isolamento do tendão do rato54. IFMs pode com sucesso secar-congelado após ter removido todo o amortecedor da pelota, mas especificamente para o isolamento do RNA, as amostras de congelação no amortecedor da isolação tendem a produzir melhores resultados. Os ifms de até 20 dissecções separadas são combinados antes do isolamento do RNA ou da proteína, permitindo escalar acima e coletar bastante material, mesmo dos temporais adiantados ou dos mutantes16,32, para a análise a jusante.
Para aplicações de RNA, o passo mais crítico pode ser o isolamento do próprio RNA. O isolamento de guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio (método 1 acima) supera a maioria dos kits comerciais testados e, como observado anteriormente, é consideravelmente menos caro55. A variabilidade observada nos rendimentos de isolamento de RNA com kits comerciais está de acordo com as observações anteriores56,57. Nós adicionamos mais o glicogênio durante a precipitação do isopropanol para ajudar a recuperar todo o RNA. Além do rendimento de RNA, é importante verificar a integridade do RNA para garantir que a amostra não tenha sido fragmentada ou degradado durante os processos de dissecção e isolamento. Também é essencial para o trabalho RNase-livre. Por último, a escolha do RT-kit pode impactar a sensibilidade do processo de transcrição reversa. Embora não muitas vezes discutido em detalhes, todos estes pontos influenciam a qualidade da amostra IFM e os dados obtidos a partir de aplicações a jusante.
Diversas modificações importantes ajustaram o protocolo aparte dos protocolos existentes da dissecção de IFM. Embora um protocolo detalhado da dissecção para a imunofluorescência de IFM exista19, este protocolo apresenta uma aproximação diferente às dissecções pupal que permite uma isolação mais rápida do tecido de IFM. Isso permite a coleta de grandes quantidades de tecido IFM (relativamente falando) com tempos de dissecção limitados para evitar alterações de proteoma ou transcriptoma. Outros protocolos descrevem a dissecção do adulto IFM para visualizar a mancha de GFP em miofibrilas individuais39 ou para a mancha de músculos larval da corpo-parede58, mas não endereçam a dissecção em estágios do pupal ou para a isolação do RNA ou da proteína. Esta aproximação é igualmente distinta do protocolo existente para a microdissecção de ifms pupal dos Cryosections38, que pode gerar uma amostra mais mais puro de IFM mas é mais labor intensivo e produz menos material. Em comparação com outros protocolos adultos rápidos da dissecção de IFM38,39, ifms são isolados no amortecedor de PBS sem detergente para limitar a indução do esforço e outras mudanças principais da expressão.
O avanço chave neste protocolo é a inclusão de um repórter ao vivo, fluorescente, permitindo o isolamento das IFMs em estágios iniciais pupais. Nós usamos Standardly Mef2-GAL459 dirigindo ou UAS-CD8:: GFP ou UAS-GFP:: GMA60. Isto permite a rotulagem diferencial de IFM (os músculos do vôo são etiquetados mais fortemente e diferentemente dados forma do que outros músculos do pupal) assim como o desempenho de GAL4-UAS-baseou manipulações, por exemplo salvamento ou experiências de RNAi. Também é possível combinar Mef2-GAL4 com Tub-GAL80TS para evitar a letalidade precoce associada ao RNAI ou com o UAS-Dcr2 para aumentar a eficiência de RNAi40.
Há outros drivers GAL4 ou GFP-Lines disponíveis que variam em especificidade do tipo músculo, padrão de expressão temporal e força do driver19,61 que podem ser usados em vez de Mef2-GAL4. Por exemplo, Act88F-GAL4 é expressado pela primeira vez em torno de 24 h APF, portanto, ele não pode ser usado para timepoints anteriores; Entretanto, etiqueta fortemente IFM e pode ser útil evitar o Lethality adiantado RNAi-associado. Ele-GFP ou Act88F-GFP etiqueta IFM, novamente com restrições temporais, mas eles evitam GAL4 dependência de expressão de marcador e pode ser útil em combinação com um fundo mutante de interesse. As listas de outras linhas de marcador possíveis estão disponíveis19. Deve-se também notar que o uso de transgenes e o sistema GAL4/UAS pode causar artefatos de expressão gênica, por isso é importante usar controles apropriados, por exemplo, a linha de motorista cruzou para a estirpe de fundo do tipo selvagem, de modo que esses artefatos são presumivelmente o mesmo em todas as amostras.
Com o vídeo que o acompanha, este protocolo detalhado visa tornar a dissecção pupal IFM mais acessível e promover o uso de abordagens Ômicas para estudar o desenvolvimento muscular. Acoplando o poder da genética de Drosophila e da biologia de pilha com os ensaios da bioquímica e do Ômicas acessíveis através de IFM dissecado tem o potencial para avançar a compreensão mecanicista da miogênese e da função do músculo. Estudos futuros que ligam as observações de nível de sistema do transcriptoma e do Regulamento do proteoma às saídas metabólicas e funcionais fornecerão uma compreensão mais profunda do músculo-tipo desenvolvimento específico e da patogénese de desordens do músculo.

As tecnologias modernas do Ômicas fornecem introspecções importantes no desenvolvimento do músculo e nos mecanismos que subjacentes desordens humanas do músculo. Por exemplo, a análise dos dados de transcriptomicina combinada com a verificação genética e bioquímica em modelos animais revelou que a perda do fator de emenda RBM20 provoca cardiomiopatia dilatada devido à sua regulação de uma rede alvo de mais de 30 sarcômeros genes previamente associados à doença cardíaca, incluindo Titina1,2,3.
Em um segundo exemplo, os estudos da cultura de pilha, dos modelos animais, e dos pacientes humanos mostraram que a distrofia Myotonic está causada por um rompimento no Regulamento do RNA devido ao sequestro de muscleblind (mbnl) e do upregulation de CELF1,4,5. A dinâmica interregulatória e temporal entre MBNL e CELF1 (também chamada de CUGBP1 ou Bruno-like 2) ajuda a explicar os padrões persistentes de splicing embrionário em pacientes com distrofia miotônica. Além disso, a grande rede de alvos mal regulamentados ajuda a explicar a natureza complexa da doença4,6,7,8. A maioria desses estudos utiliza abordagens Ômicas em organismos modelo genético para compreender os mecanismos subjacentes à doença muscular humana. Além disso, destacam a importância da primeira compreensão da expressão gênica específica temporal e tecidual, modificação protéica e padrões metabólicos no músculo saudável para compreender as alterações no músculo doente ou no envelhecimento.
A Drosophila melanogaster é outro organismo modelo genético bem estabelecido. A estrutura do sarcômero, bem como componentes individuais sarcômeros são altamente conservados de moscas para vertebrados4,9,10, e os músculos de vôo indireto (ifms) tornaram-se um modelo poderoso para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento muscular11,12. Primeiramente, os músculos do vôo fibrilar são funcionalmente e morfològica distintos dos músculos tubulares do corpo11,13, permitindo a investigação de mecanismos de desenvolvimento específicos do músculo-tipo. Fatores de transcrição incluindo spalt Major (Salm)14, extradenticle (Exd) e homothorax (HTH)15 foram identificados como reguladores do destino fibrilar. Adicionalmente, a jusante de Salm, o CELF1 homólogo Bruno1 (Bru1, aret) dirige um programa de emenda fibrillar-específico16,17.
Em segundo lugar, o ifms é um modelo importante para a compreensão do processo de miogênese, da fusão mioblástica e do apego formação à miofibrilogênese e à maturação do sarcômero9,18,19. Em terceiro lugar, a genética da Drosophila permite a investigação de contribuições por proteínas individuais, domínios proteicos e isoformas proteicos para a formação, função e propriedades biofísicas do sarcômero20,21,22 ,23. Por fim, foram desenvolvidos modelos IFM para o estudo de múltiplos distúrbios musculares humanos, como a distrofia miotônica, miopatias miofibrilares, distúrbios degenerativos musculares, actinopatias, etc.24,25,26 ,27, e forneceram importantes insights sobre mecanismos de doenças e terapias potenciais28,29,30. Assim, a Drosophila é um modelo útil para abordar muitas questões abertas no campo da miogênese, incluindo mecanismos de transcrição específica do músculo-tipo, emenda e regulação da cromatina, bem como ao papel do metabolismo no desenvolvimento muscular. A aplicação de tecnologias Ômicas modernas, em particular em combinação com a grande variedade de genética, bioquímico e os ensaios biológicos da pilha disponíveis em Drosophila, tem o potencial para avançar dramàtica a compreensão do músculo desenvolvimento, envelhecimento e doença.
Ifms são os músculos os maiores na mosca, medindo quase 1 milímetro através do comprimento inteiro do tórax nos adultos31,32. No entanto, este pequeno tamanho gera o desafio de obter amostra suficiente para aplicar tecnologias Ômicas na Drosophila de uma forma específica do tipo tissue. Além disso, os IFMs fazem parte da musculatura adulta que é formada durante os estágios pupais. Mioblasts fundem-se para formar miotubos, que se unem aos tendões em torno de 24 h após a formação de pupário (APF) e passam por uma etapa de compactação necessária para iniciar a miofibrilogênese em torno de 30 h APF (Figura 1a-D)18,33, 34.
As miofibras, em seguida, crescem para abranger todo o comprimento do tórax, com miofibrilas submetidas a uma fase de crescimento inicial focada na adição de sarcômero até cerca de 48 h APF e, em seguida, transição para uma fase de maturação, em que os sarcômeros crescem em comprimento e largura e são remodelado para estabelecer estiramento-ativação por 72 h APF (Figura 1a-D)32,35. O início da maturação da fibra é pelo menos parcialmente controlado por Salm e E2F32,36,37, e isoformas IFM-específicas múltiplas da proteína de sarcômero cujo o splicing é controlado por Bru1 é incorporado durante este fase16,17. Maduro voa Eclose de 90 – 100 h APF. Isto significa que para estudar o desenvolvimento muscular, IFM tem de ser isolado com quantidade suficiente, qualidade e pureza de vários temporais pupal para facilitar a análise usando abordagens Ômicas.
Diversos protocolos para a dissecção de IFM foram publicados. Enquanto esses protocolos funcionam bem para suas aplicações pretendidas, nenhum é ideal para abordagens Ômicas. Os protocolos que preservam a morfologia de IFM para a imunofluorescência dos IFMs19pupal e adultos, isolam fibras de IFM para a avaliação mecânica31, ou utilizam a microdissecção do IFM pupal dos Cryosections38 são demasiado especializados e tempo e trabalho intensivo para obter razoavelmente quantidades suficientes de tecido IFM para aplicações Ômicas. Outros protocolos foram desenvolvidos para a dissecção rápida de IFM especificamente adulto38,39, assim não são aplicáveis aos estágios pupal, e usam os bufferes que não são ideais ou podem ser incompatíveis com, por exemplo, isolação do RNA. Assim, há uma necessidade de desenvolver novas abordagens para isolar o IFM pupal para aplicações de bioquímica ou Ômicas.
Aqui nós apresentamos um protocolo para a dissecção de IFM durante estágios do pupal que tem sido usado com sucesso para a análise de mRNA-Seq de 16 h APF através dos estágios adultos16,32. O protocolo emprega um rótulo de proteína verde fluorescente (GFP) para identificar IFMs em todas as fases do desenvolvimento pupal e adulto, permitindo a dissecção ao vivo um microscópio de dissecação fluorescente. A aproximação é menos labor-intensiva, com uma taxa de transferência mais elevada do que protocolos existentes da dissecção de IFM. Isso permite a rápida isolação e criopreservação de amostras, gerando material suficiente após várias rodadas de dissecção para abordagens Ômicas, bem como para a reacção em cadeia de transcrição reversa padrão (RT-PCR) ou western blotting.
Nós apresentamos o protocolo em duas porções, demonstrando como dissecar ràpida IFMs ambos antes de 48 h APF (durante o Metamorphosis adiantado, quando os acessórios de IFM são mais ténues) e após 48 h APF (quando a planta do corpo do pupal e os anexos de IFM são bem definidos). Nós demonstramos que nós podemos isolar o RNA da alta qualidade dos ifms dissecados em todos os temporais e apresentar dados em aproximações diferentes ao isolamento do RNA e à transcrição reversa. Por fim, demonstramos a aplicação do protocolo de dissecção a mRNA-Seq, espectrometria de massas e RT-PCR usando o homólogo CELF1 Bruno1 como exemplo. Nós mostramos o misexpression de isoformas da proteína do sarcômero em dados do proteômica do mutante Bruno1 IFM e examinamos a regulação Bruno1 do evento da tala do C-terminal da corrente pesada de myosin (MHC). Esses resultados ilustram como os dados omônicos podem proporcionar uma compreensão mais profunda dos fenômenos biológicos, complementando experimentos genéticos e bioquímicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

O músculo de vôo de Drosophila é um modelo poderoso para estudar diversos processos, como regulação transcricional, splicing alternativo, metabolismo e mecanobiologia, que influenciam o desenvolvimento muscular e a miofibrilogênese. Os dados Omics, como os gerados por espectrometria de massas ou sequenciamento profundo, podem fornecer importantes insights mecanísticos sobre esses processos biológicos. Para tais abordagens, é benéfico analisar amostras específicas do tecido para aumentar a seletividade e a especificidade das impressões digitais Ômicas. Aqui nós apresentamos um protocolo para a dissecção do músculo fluorescente-etiquetado do vôo das pupas vivos para gerar amostras altamente enriquecidas do músculo para aplicações dos Ômicas. Nós descrevemos primeiramente como dissecar os músculos do vôo em estágios pupal adiantados (< 48 h após a formação do pupário [APF]), quando os músculos são discernable pela rotulagem fluorescente verde da proteína (GFP). Nós descrevemos então como dissecar os músculos das pupas atrasadas (> 48 h APF) ou os adultos, quando os músculos são distinguíveis um microscópio de dissecação. O protocolo de vídeo que acompanha vai fazer essas dissecções tecnicamente exigentes mais amplamente acessíveis para as comunidades de pesquisa muscular e Drosophila . Para aplicações do RNA, nós ensaio a quantidade e a qualidade do RNA que pode ser isolado em pontos diferentes do tempo e com aproximações diferentes. Nós mostramos mais que Bruno1 (Bru1) é necessário para um deslocamento temporal na cadeia pesada da miosina (MHC) que emenda, demonstrando que os músculos dissecados podem ser usados para mRNA-Seq, espectrometria maciça, e reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição (RT-PCR) Aplicativos. Este protocolo de dissecção ajudará a promover análises Ômicas tecido-específicas e pode geralmente ser aplicado para estudar aspectos biológicos múltiplos do myogenesis.

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

O músculo de vôo de Drosophila é um modelo poderoso para estudar a regulação transcricional, splicing alternativo, metabolismo e mecanobiologia. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção do músculo fluorescente-etiquetado do vôo das pupas vivos para gerar amostras altamente enriquecidas ideais para o proteômica e profundamente-arranjar em seqüência. Essas amostras podem oferecer importantes insights mecanísticos em diversos aspectos do desenvolvimento muscular.

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

O protocolo facilita a dissecção do músculo de voo indireto rotulado por GFP de Drosophila em vários momentos durante o desenvolvimento de pupas para avaliar mudanças na expressão genética e proteica. Usando essas técnicas, pode-se alcançar uma amostra muscular de voo ricamente enriquecida com degradação mínima da proteína RNA que seja adequada para rt-PCR, mancha ocidental ou abordagens omicinas. Essas dissecções especializadas exigem prática e habilidade, mas o número de pupas que podem ser dissecadas e a qualidade das amostras melhoram com a experiência.A demonstração visual desta dissecção é fundamental para determinar como distinguir os músculos de voo dos tecidos não musculares e facilitar o rápido isolamento dos músculos de voo dos espécimes pupais. Para encenar a pupae, use um pincel molhado para coletar e transferir pré-pupae para uma placa de Petri de 60 milímetros, e sexo com a pupa sob um microscópio binóculo. Os machos são identificados pela presença de testículos, que aparecem como globos translúcidos na pupae opaca.Depois de rotular o prato com a hora, data e genótipo das moscas, aduque a pupae em uma incubadora Celsius de 25 a 27 graus até o estágio apropriado. Para dissecção IFM antes de 48 H APF, use um pincel molhado para transferir a pupae adequadamente encenada para um prato de dissecação preto cerca de 2/3 cheio de PBS refrigerado. Sob o microscópio de dissecação fluorescente, use um 5 fórceps para empurrar uma das pupas para o fundo do prato de dissecação preto.Ajuste o zoom do microscópio e foque até que a pupae possa ser claramente visualizada. Usando um par de fórceps para agarrar o anterior da pupae, cutuque a pupa com uma única ponta de um segundo par de fórceps, ligeiramente fora do centro no abdômen, logo atrás do tórax. Use o primeiro par de fórceps para remover a metade anterior da caixa pupal, e para beliscar a pupae exposta logo atrás do tórax para separar o abdômen do tórax.Em seguida, aperte suavemente a parte anterior do tórax para expor os IFMs rotulados fluorescentemente. Em seguida, use os fórceps para descartar a carcaça restante para o lado oposto do prato, e dissecar a pupae subsequente da mesma maneira. Quando todas as pupas forem dissecadas, use os fórceps para coletar as fibras IFM e organize as fibras em uma pilha no fundo do prato de dissecação preto.Use os fórceps para empurrar quaisquer detritos para fora do campo de visão, e remover quaisquer músculos não IFM, gordura, cutículas ou outro tecido indesejado das amostras. Em seguida, use uma ponta de pipeta cortada para transferir a pilha de IFMs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS refrigerado. Para dissecção IFM após 48 H APF, use um pincel levemente molhado para transferir o pupae encenado para uma tira de fita adesiva de dois lados montada em um slide de microscópio.Oriente a pupae em uma linha, lado ventral para baixo, e anterior em direção ao fundo do slide. Quando todas as pupas tiverem sido colocadas, use fórceps para provocar à parte e abrir o primeiro caso pupal acima dos espirros anteriores, e deslize suavemente um par de fórceps dormentes, em direção ao posterior, cortando a caixa de pupal à medida que as fórceps se movem. Liberte a pupa da caixa aberta, e transfira imediatamente a pupae para uma gota de PBS em um segundo slide de microscópio.Quando todas as pupas forem libertadas, use uma tesoura fina para cortar o abdômen da pupa para longe do tórax, e empurre os abdômens para uma pilha separada. Quando todos os tóraxs tiverem sido removidos, use um pedaço de papel de tecido para remover a maioria da PBS e a pilha de abdômens. Adicione uma gota de PBS fresco e refrigerado aos tóraxs restantes, antes de usar a tesoura para cortar da cabeça ao longo do eixo longitudinal do corpo em um único movimento para dividir o tórax ao meio.Quando todas as pupas tiverem sido dissecadas, use os 5 fórceps para selecionar uma das hemiseções e insira suavemente as pontas de um fórceps acima e abaixo do meio dos IFMs. Segurando o primeiro par de fórceps parados, use uma tesoura fina para cortar uma extremidade do IFM longe da cutícula e dos tendões, antes de girar a pupae de 180 graus, para permitir que a outra extremidade do IFM seja cortada livre da cutícula e dos tendões. Use fórceps para transferir o feixe IFM do tórax para a borda da bolha PBS, usando tensão de água para manter o feixe no lugar.Em seguida, empurre a carcaça para o lado oposto do slide e disseca o resto dos IFMs da mesma maneira. Quando todos os IFMs tiverem sido coletados, use os 5 fórceps para remover qualquer músculo de salto ou fragmentos de cutícula que possam ter encontrado seu caminho para as amostras. Em seguida, use a tensão da água para capturar suavemente os IFMs dissecados entre um par de fórceps e coloque os IFMs em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS refrigerado.os dados de sequenciamento mRNA do BRUNO1 IR IFMs mostram alterações na expressão no nível da unidade genética em comparação com os dados de sequenciamento do tipo selvagem. Utilizando espectrometria de massa proteome inteira em IFMs dissecados, uma regulação semelhante é observada nos níveis de isoforme de proteína e proteína. Após a inserção de uma linha de armadilha de proteína no intron final do MHC, a incorporação da proteína rotulada por GFP pode ser observada em IFM como dois pontos em ambos os lados da linha M a 90 H APF, enquanto no tecido muscular da perna o sinal GFP pode ser observado uniformemente através da linha M sarcomere.Ao usar o RT-PCR no IFM dissecado, um interruptor isoforme mhc do evento de exon rotulado gfp 34 para 37 para o evento exon não rotulado 34 a 35, pode ser detectado entre 30 e 48 horas após a formação do pupário a 27 graus Celsius. A partir de dados de sequenciamento mRNA, os tecidos musculares de perna e salto expressam todos os três isoformes de Mhc, mantendo a expressão do isoforme rotulado gfp em músculo maduro. Tanto o mutante maior de Spalt quanto o BRUNO1 IR-IFM, não conseguiram desligar a expressão do isoform mhc rotulado por GFP à medida que se desenvolvem, resultando em um perfil de expressão isoforme semelhante ao do tecido muscular da perna e do salto.Lembre-se que as dissecções devem ser realizadas em menos de 30 minutos para evitar a degradação do RNA. E, tomar cuidado para limitar a contaminação por outros tipos de células. Este método gera amostras enriquecidas pelo IFM adequadas para abordagens bioquímicas como RT-PCR, ou manchas ocidentais, bem como abordagens de estilo omica, como espectrometria de massa, sequenciamento de alta produtividade, captura de conformidade de cromatina e metabolômica.Essas dissecções podem complementar as poderosas abordagens genéticas em Drosophila com dados de nível de sistemas para investigar os mecanismos fundamentais de desenvolvimento e regulação genética.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Genética

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