Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Мы благодарны Андреасу Ладурнеру и Франку Шноррере за щедрую поддержку. Мы благодарим Сандра Эссер за отличную техническую помощь и Akanksha Roy для генерации данных масс-спектрометрии. Мы признаем Блумингтон и Венский фондовые центры для обеспечения мух. Мы благодарим Bioimaging Core Facility за помощь в конфокальной визуализации и Зантраллабор фюрер Протеинаналитик для анализа образцов масс-спектрометрии, как в Биомедицинском Центре ЛМУ (Martinsried, DE). Наша работа была поддержана Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Центром интегрированных белковых наук Мюнхена (CIPSM) в Людвиг-Максимилианс-Университет Мюнхен (MLS), Фредерик-Бауэр Stiftung (MLS), и Международный Макс Научно-исследовательская школа Планка (EN).

Авторам нечего раскрывать.

В этом протоколе мы представляем основную методику вскрытия Дрософила IFMs от ранних и поздних стадиях куски для ниже по течению изоляции белка, ДНК, РНК или других макромолекул. Протокол можно легко адаптировать для вскрытия IFM от взрослых мух. Мы демонстрируем полезность нашего протокола вскрытия для приложений mRNA-Seq, протеомики и RT-PCR. С непрерывным совершенствованием омичных технологий, позволяющих анализировать образцы с меньшим исходным материалом и более низкими концентрациями входных данных, эти вскрытия, вероятно, станут ценными для многих дополнительных применений. Как IFMs являются установленной моделью для человеческих миопатий4,24 и мышцного типа конкретного развития9,12, мы представляем, например, IFM-обогащенных метаболомики, исследования хроматина конформации через 3C или 4C, сращивание оценки сети через CLiP взаимодействий или фосфо-протеомики миофибрилломании.
Важно учитывать, что эти вскрытия производят образец, обогащенный для ИФМ, а не чистый образец IFM. Это неизбежно из-за иннервации моторных нейронов, сухожилия вложения и трахеи вторжения мышечных волокон. Анализ биоинформатики может быть использован для выявления обогащенных ифом генов или белков, но необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы продемонстрировать, что они на самом деле являются специфическими ДЛЯ IFM. Образец чистоты можно анализировать с помощью опубликованных тканей конкретных маркеров, таких как полоса45 (тендон), Act79B4,44 (трубчатая мышца), Act88F15 (IFM), или сиб46 (нейрональный конкретных). Возможно, можно использовать такие маркеры для нормализации наборов данных в специфическом содержании IFM, однако пользователи предупреждают, что временные изменения в экспрессии генов, используемых для нормализации, например генов, специфичных иФМ, или тубулина, могут привести к смещению такого подхода.
Генетически закодированные ткани конкретных методов маркировки, например, EC-теги47,48 или PABP-маркировки49,50 для изоляции РНК были разработаны в последние годы, которые могут помочь получить действительно ткань-специфический образец РНК. Тем не менее, EC-tagging требует постоянного кормления мух47 и, таким образом, не применяется во время pupal этапов. Чувствительность и полнота транскриптомов с маркировкой PABP может иметь ограничения51. Подходы FACS к изоляции отдельных мышечных волокон осложняются большим и синцитиальным характером ИФМ. INTACT52,53 стиль подходы могут быть применены для изоляции конкретных субклеточных отсеков от IFMs, которые могут оказаться полезными для изоляции чистых популяций ядер IFM или митохондрий. Ручные вскрытия по-прежнему являются текущим стандартом для получения нетронутой ткани IFM для большинства приложений вниз по течению.
Качество образца зависит от нескольких важных шагов в процессе вскрытия. Вскрытия технически требовательны, со скоростью вскрытия и чистотой образца увеличивается с опытом. Вскрытие в течение коротких периодов времени (20-30 мин) в охлажденный буфер без моющего средства и немедленное замораживание помогает сохранить целостность образца, как это наблюдалось ранее для изоляции сухожилий мыши54. IFMs могут быть успешно заморожены после удаления всех буферов из гранул, но специально для изоляции РНК, замораживание образцов в изоляционном буфере, как правило, дают лучшие результаты. IFMs от до 20 отдельных вскрытий объединяются до РНК или белковой изоляции, что позволяет масштабирования и сбора достаточного количества материала, даже с ранних точек времени или мутантов16,32, для анализа вниз по течению.
Для РНК-приложений наиболее важным шагом может быть изоляция самой РНК. Guanidinium thiocyanate-фенол-хлороформ изоляции (метод 1 выше) превосходит большинство коммерческих комплектов испытания и, как отмечалось ранее, значительно дешевле55. Вариабельность наблюдаемых в изоляции РНК дает с коммерческими комплектами в согласии с предыдущими наблюдениями56,57. Мы также добавляем гликоген во время изопропанола осадков, чтобы помочь восстановить все РНК. Помимо выхода РНК, важно проверить целостность РНК, чтобы убедиться, что образец не был фрагментирован или деградирован во время процессов вскрытия и изоляции. Важно также работать Без RNase. Наконец, выбор RT-комплектможет повлиять на чувствительность процесса обратной транскрипции. Хотя все эти моменты не часто обсуждаются подробно, они влияют на качество выборки IFM и данные, полученные из приложений ниже по течению.
Несколько важных изменений отличают протокол от существующих протоколов вскрытия IFM. Хотя подробный протокол вскрытия для иммунофлуоресценции IFM существует19, этот протокол представляет собой другой подход к pupal вскрытий, что позволяет более быструю изоляцию ткани IFM. Это позволяет сбор большого количества ткани IFM (относительно говоря) с ограниченным временем вскрытия, чтобы предотвратить изменения протеома или транскриптома. Другие протоколы описывают вскрытие взрослых IFM для визуализации GFP окрашивания в отдельных миофибрильсов39 или для окрашивания личинок тела стены мышц58, но они не касаются вскрытия на стадии pupal или для изоляции РНК или белка. Этот подход также отличается от существующего протокола для микрорассечения pupal IFMs от криосекций38, которые могут генерировать более чистый образец IFM, но является более трудоемким и производит меньше материала. По сравнению с другими быстрыми взрослыми протоколами вскрытия IFM38,39, IFMs изолированы в буфере PBS без моющего средства, чтобы ограничить индукцию стресса и другие основные изменения выражения.
Ключевым достижением в этом протоколе является включение живого флуоресцентного репортера, позволяющего изоляцию МФМ на ранних стадиях. Мы стандартно используем Mef2-GAL459 за рулем либо UAS-CD8::GFP или UAS-GFP::Gma60. Это позволяет дифференциальной маркировки IFM (полет мышцы более сильно помечены и по-разному формы, чем другие мышцы pupal), а также выполнение GAL4-UAS основе манипуляций, например, спасательные или РНК экспериментов. Также можно комбинировать Mef2-GAL4 с ванной-GAL80ts, чтобы избежать РАНК-связанных ранней летальности или с UAS-Dcr2 для повышения эффективности РНК40.
Есть дополнительные драйверы GAL4 или GFP-линии доступны, которые различаются по специфике мышечного типа, височное выражение шаблона, и сила водителя19,61, которые могут быть использованы вместо Mef2-GAL4. Например, Act88F-GAL4 сначала выражается около 24 ч APF, поэтому он не может быть использован для более ранних временных точек; однако, он сильно маркирует IFM и может быть полезн для того чтобы во избежание RNAi-связанные ранняя летальность. Он-GFP или Act88F-GFP этикетке IFM, опять же с временными ограничениями, но они избегают GAL4 зависимость маркера выражения и может быть полезным в сочетании с мутантным фоном интереса. Списки других возможных линий маркера доступны19. Следует также отметить, что использование трансгенов и системы GAL4/UAS может вызвать артефакты экспрессии генов, поэтому важно использовать соответствующие элементы управления, например, линию водителя, пересекаемую с фоновым штаммом дикого типа, так что такие артефакты предположительно же во всех образцах.
С сопроводительным видео, этот подробный протокол направлен на то, чтобы сделать pupal IFM вскрытие более доступным и содействовать использованию омиков подходы для изучения развития мышц. Соединение силы генетики дрозофилы и клеточной биологии с биохимией и омиками, доступными через расчлененные ИФМ, имеет потенциал для продвижения механистического понимания миогенеза и мышечной функции. Будущие исследования, связывающие системные наблюдения транскриптома и регуляции протеома с метаболическими и функциональными выходами, обеспечат более глубокое понимание специфического развития мышечного типа и патогенеза мышечных расстройств.

Современные омичи технологии обеспечивают важное понимание развития мышц и механизмов, лежащих в основе нарушений мышц человека. Например, анализ данных транскриптомики в сочетании с генетической и биохимической проверкой в моделях животных показал, что потеря сращивания фактора RBM20 вызывает расширенную кардиомиопатию из-за его регулирования целевой сети из более чем 30 саркоме гены, ранее связанные с сердечными заболеваниями, в том числе титин1,2,3.
Во втором примере, исследования, проведенные из клеточной культуры, животных моделей и пациентов с людьми показали, что миотоническая дистрофия вызвана нарушением регулирования РНК из-за секвестра Muscleblind (MBNL) и upregulation CELF14,5. Кросс-регуляторная и височная динамика между MBNL и CELF1 (также называемый CUGBP1 или Bruno-Like 2) помогает объяснить стойкие эмбриональные модели сращивания у пациентов с миотонической дистрофией. Кроме того, большая сеть нерегулируемых целей помогает объяснить сложный характер заболевания4,6,7,8. Большинство таких исследований используют омичные подходы в генетических модельных организмах, чтобы понять механизмы, лежащие в основе заболеваний мышц человека. Кроме того, они подчеркивают важность первого понимания временного и тканевого типа специфической экспрессии генов, изменения белка и метаболических моделей в здоровых мышцах, чтобы понять изменения в больной или стареющей мышце.
Drosophila melanogaster является еще одной устоявшейся генетической модели организма. Структура саркомера, а также отдельных компонентов саркомера высоко сохраняется от мух до позвоночных4,9,10,и косвенные мышцы полета (IFMs) стали мощной моделью для изучения несколько аспектов развития мышц11,12. Во-первых, фибриллярные летные мышцы функционально и морфологически отличаются от трубчатых мышц тела11,13,что позволяет исследовать мышцы типа конкретных механизмов развития. Транскрипция факторов, включая Spalt основных (Salm)14, Extradenticle (Exd), и Homothorax (Hth)15 были определены как фибриллярной судьбы регуляторов. Кроме того, вниз по течению Салм, CELF1 омолог Бруно1 (Bru1, Aret) направляет фибриллярной конкретной программы сращивания16,17.
Во-вторых, IFMs являются важной моделью для понимания процесса миогенеза себя, от миобласт слияния и миотубины привязанности к миофибрилломанез и саркомере созревания9,18,19. В-третьих, drosophila генетики позволяет исследования вклада отдельных белков, белковых доменов и изоформ овеков для формирования саркомера, функции, и биофизические свойства20,21,22 ,23. Наконец, ifM модели были разработаны для изучения нескольких человеческих мышечных расстройств, таких как миотоническая дистрофия, миофибриллярные миопатии, мышечные дегенеративные расстройства, актинопатии и т.д.24,25,26 ,27, и предоставили важные идеи в механизмах болезни и потенциальных методов лечения28,29,30. Таким образом, Drosophila является полезной моделью для решения многих открытых вопросов в области миогенеза, в том числе механизмов мышечного типа конкретной транскрипции, сплайсинга и регулирования хроматина, а также роли метаболизма в развитии мышц. Применение современных омичных технологий, в частности в сочетании с широким спектром генетических, биохимических и клеточных биологических анализов, доступных в Дрозофиле,имеет потенциал для резкого продвижения понимания мышц развития, старения и болезней.
IFMs являются крупнейшими мышцы в лету, охватывающих почти 1 мм по всей длине грудной клетки у взрослых31,32. Тем не менее, этот небольшой размер создает проблему получения достаточного количества выборки для применения технологий омики в Drosophila в ткани типа конкретного образом. Кроме того, IFMs являются частью взрослой мускулатуры, которая образуется во время pupal этапов. Myoblasts предохранитель для формирования миотубевей, которые прикрепляются к сухожилиям около 24 ч после формирования пупария (APF) и проходят шаг уплотнения, необходимые для инициирования миофибрилломаниса около 30 ч APF(Рисунок 1A-D)18,33, 34.
Myofibers затем расти, чтобы охватить всю длину грудной клетки, с myofibrils проходит начальную фазу роста сосредоточены на саркомере дополнение примерно до 48 ч APF, а затем переход к фазе созревания, в котором саркомеры растут в длину и ширину и реконструирован, чтобы установить растяжение активации на 72 ч APF(рисунок 1A-D)32,35. Начало созревания волокна, по крайней мере частично контролируется Salm и E2F32,36,37, и несколько IFM-специфических изоформ овеющего белка саркомера, сплайсинг которых контролируется Bru1, включены в течение этого фаза16,17. Зрелые мухи пристыковываются от 90-100 ч APF. Это означает, что для изучения развития мышц, IFM должна быть изолирована с достаточным количеством, качеством и чистотой от нескольких кваранских точек времени для облегчения анализа с использованием подходов омичей.
Было опубликовано несколько протоколов для вскрытия МФМ. Хотя эти протоколы хорошо работают для их предполагаемых приложений, ни один из них не подходит для омиков подходов. Протоколы, которые сохраняют морфологию IFM для иммунофлюоресценции pupal и взрослых IFMs19, изолировать волокна IFM для механической оценки31, или использовать микрорассеификацию pupal IFM из криосекций38 слишком специализированы и времени и трудоемкие для разумного получения достаточного количества ткани IFM для применения омики. Другие протоколы были разработаны для быстрого вскрытия специально для взрослых IFM38,39, таким образом, не применяются к pupal этапов, и использовать буферы, которые не являются идеальными или могут быть несовместимы с, например, изоляции РНК. Таким образом, необходимо разработать новые подходы к изоляции pupal IFM для биохимии или омики приложений.
Здесь мы представляем протокол для вскрытия IFM во время pupal этапов, который был успешно использован для анализа мРНК-Seq от 16 ч APF через взрослых этапов16,32. Протокол использует зеленый флуоресцентный белок (GFP) этикетку для выявления IFMs на всех стадиях развития PUpal и взрослых, что позволяет живой вскрытия под флуоресцентным рассеивающим микроскопом. Этот подход менее трудоемкий, с более высокой пропускной емкостью, чем существующие протоколы вскрытия IFM. Это позволяет быстро йозолировать и криоконсервацию образцов, генерируя достаточно материала после нескольких раундов вскрытия для подходов омичей, а также для стандартной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) или западного промотирования.
Мы представляем протокол в двух частях, демонстрируя, как быстро вскрыть IFMs как до 48 ч APF (во время ранней метаморфозы, когда вложения IFM являются более разжитыми) и после 48 ч APF (когда pupal план тела и IFM вложения четко определены). Мы демонстрируем, что можем изолировать высококачественную РНК от вскрытых МФМ в любой момент времени и представить данные о различных подходах к изоляции РНК и обратной транскрипции. Наконец, мы демонстрируем применение протокола вскрытия к mRNA-Seq, масс-спектрометрии и RT-PCR с использованием гомолога CELF1 Bruno1 в качестве примера. Мы показываем непровержим саркомере белка изоформы в протеомики данных от Bruno1 мутант IFM и изучить Bruno1 регулирование C-терминал аспилк событие Myosin тяжелой цепи (Mhc). Эти результаты иллюстрируют, как данные омичи могут обеспечить более глубокое понимание биологических явлений, дополняя генетические и биохимические эксперименты.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Дрозофила полет мышцявляется мощная модель для изучения различных процессов, таких как транскрипционная регуляция, альтернативное сращивание, обмен веществ, и механобиологии, которые все влияют на развитие мышц и миофибрилломанис. Данные омичей, такие как данные, генерируемые масс-спектрометрией или глубоким секвенированием, могут обеспечить важное механистическое понимание этих биологических процессов. Для таких подходов полезно анализировать образцы тканей для повышения как избирательности, так и специфичности отпечатков пальцев омичков. Здесь мы представляем протокол для вскрытия флуоресцентных помечены полет мышцы от живых кукулак для создания высокообогащенных образцов мышц для омики приложений. Сначала мы описываем, как вскрыть летные мышцы на ранних стадиях pupal (lt;48 h после формирования пупария »APF), когда мышцы различимы по маркировке зеленого флуоресцентного белка (GFP). Затем мы описываем, как вскрыть мышцы от поздних кукол (No gt;48 h APF) или взрослых, когда мышцы различимы под рассекающим микроскопом. Сопровождающий видеопротокол сделает эти технически требовательные вскрытия более доступными для исследований мышц и дрозофилы. Для РНК-приложений мы просаим количество и качество РНК, которые могут быть изолированы в разные моменты времени и с различными подходами. Мы также показываем, что Bruno1 (Bru1) необходим для временного сдвига в миозиновой тяжелой цепи(Mhc)сращивания, демонстрируя, что расчлененные мышцы могут быть использованы для мРНК-Сек, масс-спектрометрии и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) Приложений. Этот протокол вскрытия поможет продвинуть анализ ыткоми и может быть в целом применен для изучения многочисленных биологических аспектов миогенеза.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Дрозофила полет мышцы является мощной моделью для изучения транскрипционной регуляции, альтернативные сращивания, метаболизм, и механобиологии. Мы представляем протокол для вскрытия флуоресцентных маркировки полет ноймышци от живых кусков для создания высокообогащенных образцов идеально подходит для протеомики и глубокого секвенирования. Эти образцы могут предложить важные механистические идеи в различных аспектах развития мышц.

Рассечение Drosophila меланогастер полет мышц для омичи подходы

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Протокол облегчает вскрытие GFP помечены косвенные мышцы полета из Drosophila в разное время во время развития куколки для оценки изменений в гене и экспрессии белка. Используя эти методы, высокий обогащенный образец мышц полета с минимальной деградацией белка РНК может быть достигнут, что подходит для RT-PCR, западные помарки, или омические подходы. Эти специализированные вскрытия требуют практики и мастерства, но количество куколок, которые могут быть вскрыты и качество образцов улучшить с опытом.Визуальная демонстрация этого вскрытия имеет решающее значение для определения того, как отличить летные мышцы от немишечных тканей и облегчения быстрой изоляции летных мышц от щенков. Для того чтобы повесять куколки, используйте смоченные кисти для того чтобы собрать и перенести pre-pupae в тарелку Петри 60 миллиметров, и секс куколки под бинокулярным микроскопом. Самцы идентифицируются по наличию яицы, которые появляются как полупрозрачные глобусы на в противном случае непрозрачные куколки.После маркировки блюдо со временем, датой и генотипом мух, возраст куколок в 25 до 27 градусов по Цельсию инкубатор до соответствующей стадии. Для вскрытия IFM до 48 H APF используйте смоченную кисть, чтобы передать надлежащим образом поставленные куколки в черное рассеченное блюдо около 2/3, наполненное охлажденным PBS. Под флуоресцентным рассечением микроскопа используйте 5 типсов, чтобы подтолкнуть одну из куколок к нижней части черного рассечения.Отрегулируйте масштаб микроскопа и сосредоточьтесь до тех пор, пока куколки не будут четко визуализированы. Используя одну пару типсов, чтобы схватить переднюю часть куколки, ткните куколок одним кончиком второй пары типсов, слегка вне центра живота, сразу за грудной клеткой. Используйте первую пару щипец, чтобы удалить переднюю половину куколки случае, и ущипнуть подвергаются куколки сразу за грудной клеткой, чтобы отделить живот от грудной клетки.Затем аккуратно сожмите переднюю часть грудной клетки, чтобы разоблачить флуоресцентно помеченные IFM. Затем используйте типсы, чтобы выбросить оставшуюся тушу на противоположную сторону блюда и таким же образом вскрыть последующие куколки. Когда все куколки были вскрыты, используйте типсы для сбора волокон IFM, и организовать волокна в кучу на дне черного рассечения блюдо.Используйте типсы, чтобы вытолкнуть любой мусор из поля зрения, и удалить любые не-IFM мышцы, жир, кутикулы, или другие нежелательные ткани из образцов. Затем используйте обрезанный наконечник пипетки для переноса груды IFMs в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 250 микролитров охлажденного PBS. Для вскрытия IFM после 48 H APF используйте слегка смочеченную кисть для переноса постановочных куколок на полосу двусторонних липких лент, установленных на слайде микроскопа.Ориентация куколок в линию, брюшной стороне вниз, и передней к нижней части слайда. Когда все куколки были помещены, использовать миппы, чтобы дразнить друг от друга и открыть первый корпус куколки над передней spiracles, и осторожно слайд пару типсов dorsally, к задней, резки куколки случае, как миппы двигаться. Освободите куколки из открытого корпуса и немедленно перенесите куколки на каплю PBS на втором слайде микроскопа.Когда все куколки освобождаются, используйте тонкие ножницы, чтобы сократить живот куколок от грудной клетки, и нажмите животы в отдельную кучу. Когда все грудной клетки были удалены, использовать кусок бумаги, чтобы удалить большинство PBS и кучу животов. Добавьте каплю свежего, охлажденного PBS к оставшимся грудной клетке, прежде чем использовать ножницы, чтобы вырезать из головы вдоль продольной оси тела в одном движении, чтобы разделить грудную клетку пополам.Когда все куколки были вскрыты, используйте 5 типсов, чтобы выбрать один из полушарий, и аккуратно вставьте кончики одного типса выше и ниже середины МФМ. Холдинг первой пары типсов еще, использовать тонкие ножницы, чтобы сократить один конец IFM от кутикулы и сухожилий, прежде чем вращать куколки 180 градусов, чтобы другой конец IFM быть вырезаны из кутикулы и сухожилий. Используйте типсы для передачи пучка IFM от грудной клетки к краю пузыря PBS, используя натяжение воды, чтобы держать пучок на месте.Затем нажмите тушу на противоположную сторону слайда, и вскрыть остальные IFMs таким же образом. Когда все IFMs были собраны, используйте 5 типсов, чтобы удалить любые мышцы прыжка или кутикулы фрагменты, которые, возможно, нашли свой путь в образцах. Затем используйте натяжение воды, чтобы аккуратно захватить вскрытые МФМ между парой типсов, и поместите МФМ в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 250 микролитров охлажденного PBS.данные секвенирования мРНК от BRUNO1 IR IFM показывают изменения в экспрессии на уровне генной единицы по сравнению с данными секвенирования дикоготипа. Используя всю спектрометрию массы протеома на вскрытых МФМ, аналогичная регуляции наблюдается на уровнях белка и белка изоформа. После вставки линии белковой ловушки в окончательный интрон Mhc, включение GFP помечены белка можно наблюдать в IFM как две точки по обе стороны от M-линии на 90 H APF, в то время как в мышечной ткани ног сигнал GFP можно наблюдать равномерно через саркомер M-линии.При использовании RT-PCR на вскрытом IFM, Mhc изоформный переключатель от GFP помечены exon 34 до 37 событие неописуемого exon 34 до 35 событие, могут быть обнаружены между 30 и 48 часов после образования пупариума при 27 градусов по Цельсию. Из данных по секвенированию мРНК, тканей мышц ног и скачков выражают все три изоформы MHC, поддерживая экспрессию изоформы с маркировкой GFP в зрелых мышцах. Оба Spalt основных мутантов и BRUNO1 IR-IFM, не удалось отключить выражение GFP помечены MHC isoform, как они развиваются, в результате чего изоформный профиль выражения напоминающие ноги и прыгать мышечной ткани.Помните, что вскрытия должны быть выполнены менее чем за 30 минут, чтобы предотвратить деградацию РНК. И, чтобы заботиться, чтобы ограничить загрязнение другими типами клеток. Этот метод генерирует IFM-обогащенные образцы, пригодные для биохимических подходов, таких как RT-PCR, или западные blotting, а также подходы к омическому стилю, такие как масс-спектрометрия, секвенирование высокой пропускной способности, улавливание конформации хроматина и метаболомика.Эти вскрытия могут дополнять мощные генетические подходы в Дрозофиле системными данными для изучения фундаментальных механизмов развития и регуляции генов.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Количественное определение пигментации брюшной полости в<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Высоким содержанием жиров питание и высокая пропускная способность Triacylglyceride Assay в Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Поколение генома общесистемной Chromatin конформации захвата библиотек из плотно поставил раннего дрозофилы эмбрионов

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Измерение уровня осуществления в Drosophila melanogaster , с использованием системы количественной оценки вращающихся упражнения (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

TreadWheel: Интервал подготовки протокола для нежно индуцированной упражнения в Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Рассечение Enhancer функции мультиплексной основанный ТРИФОСФАТЫ Enhancer вмешательства в клеточных линиях

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Использование Дрозофилы S2 клетки для живой визуализации клеточного отдела

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Метод скрининга для выявления гетерохроматина-пропагандирующих наркотиков с использованием дрозофилы

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...