Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Agradecemos a Andreas Ladurner y Frank Schnorrer el generoso apoyo. Agradecemos a Sandra Esser por su excelente asistencia técnica y a Akanksha Roy por generar los datos de espectrometría de masas. Reconocemos los centros de valores de Bloomington y Viena por proporcionar moscas. Agradecemos a la Bioimagen de Core Facility por su ayuda con la imagen confocal y el Zentrallabor f'r Proteinanalytik para el análisis de muestras de espectrometría de masas, ambos en el Centro Biomédico LMU (Martinsried, DE). Nuestro trabajo contó con el apoyo de la Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), el Centro de Ciencia Integrada de Proteínas de Múnich (CIPSM) en la Ludwig-Maximilians-University de Múnich (MLS), el Frederich-Bauer Stiftung (MLS) y el International Max Max Escuela de Investigación De Planck (ES).

1. Escenificación de las puas
<ol><li>Levante moscas del genotipo deseado en botellas(Figura 1E). Haga un nuevo tirón de la sección o establezca una cruz con al menos 20 moscas vírgenes femeninas. Mantener las botellas hasta que las moscas comiencen a pupar.</li>
	<li>Recoger las capas previas con un pincel humedecido y transferirlo al papel de filtro humedecido en una placa Petri de 60 mm(Figura 1F).</li>
	<li>Sexo las pupupas, recogiendo el género adecuado para el experimento(Figura 1G). Los machos se identifican por la presencia de testículos, que aparecen como bolas translúcidas en la pupa de otro modo opaca.</li>
	<li>Etiquete el plato Petri con la hora, la fecha y el genotipo y, a continuación, envejezque las puas hasta la etapa deseada(Figura 1H). NOTA: Mantener cruces/stocks y pueuras de edad en una incubadora de temperatura controlada (es decir, 25 o C o 27 oC para cruces RNAi, ya que el aumento de la actividad de Gal4 a temperaturas más altas aumenta la eficiencia de derribo40). Asegúrese de que la humedad es lo suficientemente alta para que las pupalas no se sequen cuando envejecen varios días.</li>
</ol>2. Disección IFM Antes de 48 h APF
<ol><li>Montar el equipo necesario, incluidos dos fórceps de grado de biología #5, una pipeta, puntas de pipeta, hielo seco y (para muestras de ARN) reactivo de aislamiento (ver Tabla de Materiales). Además, platos de disección negros fríos (ver Tabla de Materiales),1 tampón de solución salina con fosfato (PBS) y tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo.</li>
	<li>Usando un pincel humedecido, transfiera pudeas escenificadas a un plato de diselación negro lleno de aproximadamente dos tercios con 1PBS frío(Figura 2A,B). Pasar a un microscopio de disección fluorescente. NOTA: Utilice tantas pudas como se puedan diseccionar en una ventana de tiempo de 30 minutos. Dependiendo de la experiencia, esto oscila entre 3 y 15 puyae. Consulte Métodos suplementarios para la discusión de alternativas a los platos de diselación negros.</li>
	<li>Usando #5 fórceps, empuje una de las pupas hacia la parte inferior de una placa de disección negra y ajuste el zoom y el enfoque del microscopio para ver claramente la pupa(Figura 2C).</li>
	<li>Agarre la anterior de la pupa con un fórceps(Figura 2D)y, a continuación, empuje las pupas con una sola punta de los otros fórceps ligeramente descentrado en el abdomen, justo detrás del tórax. Esto mantiene la pupa en su lugar y evita que las EMM se muevan hacia el abdomen(Figura 2E). NOTA: Comience a cronometrar la longitud de la disección desde este punto, tan pronto como se interrumpa la integridad pupal. Utilice una longitud definida de disección (por ejemplo, de 20 a 30 min) para minimizar la muerte muscular y los cambios transcriptomicos y proteómicos asociados. Diseccionar tantas moscas como sea posible en este período de tiempo.</li>
	<li>Con los primeros fórceps, quite la mitad anterior del estuche pupal(Figura 2F).</li>
	<li>Usa los mismos fórceps para pellizcar las pupas expuestas justo detrás del tórax, y separa el abdomen del tórax(Figura 2G).</li>
	<li>Con los fórceps, apriete suavemente la parte anterior del tórax (para <35 h APF) o abra el tórax para exponer las EMM con etiqueta fluorescente(Figura 2H). Las EFI se separarán fácilmente de la epidermis, ya que los accesorios de tendón en los primeros momentos son frágiles. Deseche el cadáver restante usando fórceps para empujarlo al lado opuesto de la placa.</li>
	<li>Repitiendo los pasos 2.3–2.7, diseccionar pupupas adicionales.</li>
	<li>Recoger las fibras IFM con fórceps y organizarlas en una pila en la parte inferior de la placa de diseción negra(Figura 2I, J). Elimine los restos expulsándolos del campo de visión con fórceps. NOTA: Con la práctica, las puntas de fórceps se pueden acercar sin tocarse entre sí. Esta técnica se puede utilizar para agarrar libremente las EMF sin destruirlas. Los métodos alternativos incluyen empujar o levantar suavemente las MFI con una sola punta o fórceps completamente cerrados, o tomar algo de grasa u otro tejido con el IFM y eliminar la grasa como se describe en el paso 2.10.</li>
	<li>Control de calidad de la muestra muscular IFM, utilizando los fórceps para eliminar los músculos no IFM, grasa, cutícula, etc. de la muestra(Figura 2K,L). NOTA: Con Mef2-Gal4, IFM está etiquetado con más fuerza que otros tipos de músculo en los primeros momentos(Figura 2K,K'),lo que permite la eliminación de músculo de salto y músculos larvales basados en la intensidad de la fluorescencia y la forma muscular. El tejido graso y de la cutícula se ve diferente y no está etiquetado por una etiqueta de fluorescencia específica del músculo(Figura 2K,K'). Consulte la sección de discusión para otras líneas Gal4 que etiquetan IFM.</li>
	<li>Usando una punta de pipeta recortada, transfiera la pila de EMM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de 250 ml de 1x PBS refrigerado(figura 2M-O). Proceda inmediatamente a la sección 4. NOTA: Las muestras de IFM pueden perderse simplemente adiéndose al lado de la punta de la pipeta. El tampón de pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de recoger las MFI puede hacer que las puntas estándar sean menos pegajosas, y las puntas siliconizadas o perfluoroalkoxi (PFA) (ver Tabla de materiales)con tensiones superficiales más bajas pueden ayudar a prevenir la pérdida de muestras.</li>
</ol>3. Disección IFM Después de 48 h APF
<ol><li>Montar el equipo necesario, incluidos dos fórceps de grado de biología #5, tijeras finas, portaobjetos de microscopio de vidrio estándar, cinta de doble palo, pipeta, puntas de pipeta, hielo seco y (para aplicaciones de ARN) reactivo de aislamiento (ver Tabla de materiales). Enfríe los 1x TUBOS PBS y microcentrífugos en hielo.</li>
	<li>Con un pincel ligeramente humedecido, transfiera las pupalas escenificadas a una tira de cinta adhesiva de doble cara montada en una diapositiva de microscopio(Figura 3A). Coloque las puas en una línea orientada en la misma orientación (ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior de la diapositiva). NOTA: Tenga cuidado de no usar demasiada agua en el pincel o filtro, o las puas no se pegarán bien. Si las puas no se pegan, séquelas primero transfiriéndolas a un filtro seco o a papel tisú. Montar tantas pusias como se puedan diseccionar dentro de una ventana de tiempo de 30 minutos, idealmente 10 pupae.</li>
	<li>Retire la pupa de la funda pupal. Utilice fórceps para burlarse y abrir el estuche pupal por encima de los espiráculos anteriores(Figura 3B).</li>
	<li>Deslice suavemente un par de fórceps dorsalmente hacia la parte posterior, cortando la caja pupal a medida que los fórceps se mueven(Figura 3B'). Tenga cuidado de no romper la pupa subyacente. Liberar la pupa de la caja abierta y transferirla inmediatamente a una gota de 1x PBS en una segunda diapositiva del microscopio(Figura 3B",C).</li>
	<li>Repita los pasos 3.3 y 3.4 para todas las puas en la línea y, a continuación, deje a un lado la diapositiva de cinta de doble palo.</li>
	<li>Con las tijeras finas, corte el abdomen de la pupa lejos del tórax y empújelo en una pila separada(Figura 3D,D'). Repita el procedimiento para las puas restantes. NOTA: Comience a cronometrar la duración de la disección con el paso 3.6, tan pronto como se interrumpa la integridad del pupal. Diseccionar tantas moscas como sea posible en 20-30 minutos para prevenir la muerte celular y los cambios transcriptomicos y proteómicos asociados. Al disección 1 d adultos o >90 h pupae, a menudo es conveniente para pasos posteriores para quitar adicionalmente la cabeza con las tijeras finas.</li>
	<li>Usando un papel tisú, retire la mayoría de los 1x PBS (generalmente turbio con grasa suspendida) así como la pila de abdomen(Figura 3E). Añade una gota de 1x PBS fresco y frío a los thoraxes restantes.</li>
	<li>Utilice las tijeras para cortar el tórax por la mitad(Figura 3F, F')cortando desde la cabeza hacia abajo el eje longitudinal del cuerpo en un solo movimiento. Alternativamente, si se ha quitado la cabeza, primero inserte las tijeras donde se unificó la cabeza y corte la mitad superior del tórax longitudinalmente entre las EMB. A continuación, corte el lado ventral del tórax con un segundo corte en la misma orientación.</li>
	<li>Repita los pasos 3.7 y 3.8 para que todas las pupuas se diseccionen, generando una pila de hemisecciones del tórax cerca del centro de la diapositiva. Asegúrese de que haya suficiente 1 PBS refrigerado en la diapositiva para que las hemisecciones no se sequen. NOTA: Después de 48 h APF, las IfM son lo suficientemente grandes como para ser visibles bajo un microscopio de disección estándar al ojo entrenado. En este punto del protocolo, los músculos con una etiqueta fluorescente se pueden mover a un alcance de disección fluorescente para ayudar en la identificación de IFM o con fines de entrenamiento, pero esto no es necesario.</li>
	<li>Diseccionar las EFI fuera del tórax. Aísle una de las hemisecciones utilizando el #5 fórceps(Figura 3G,H). Inserte suavemente las puntas de un fórceps por encima y por debajo de la mitad de las MFI(Figura 3G', H'). Mientras mantiene los primeros fórceps todavía, utilice tijeras finas para cortar un extremo de la IFM lejos de la cutícula y los tendones. A continuación, corte el otro extremo de la IfM libre de la cutícula(Figura 3G'', H''). NOTA: Dependiendo de la orientación del tórax después del primer corte IFM, es útil girar el tórax 180o para que el segundo corte IFM sea más fácil de realizar.</li>
	<li>Retire el haz IFM del tórax con fórceps(Figura 3G''', H'''), transfiriéndolo al borde de la burbuja PBS para utilizar la tensión de agua para mantenerlo en su lugar(Figura 3I). Empuje el cadáver hacia el lado opuesto de la diapositiva. Repita para las hemisecciones restantes del tórax, generando una colección de EFI diseccionadas. NOTA: Si las EFI no permanecen en una pila ordenada, retire algunos de los 1o PBS con un tejido. Tenga cuidado de no dejar que todos los PBS se evaporen y asegúrese de que las EFI y los hemitóreos diseccionados permanezcan cubiertos por el tampón.</li>
	<li>Después de diseccionar todos los MFI, realice rápidamente un control de calidad en el músculo diseccionado. Usando #5 fórceps, eliminar cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber encontrado su camino en la muestra(Figura 3J-K''). NOTA: El músculo de salto parece diferente del IFM. Si disección Mef2-Gal4 etiquetado músculo bajo fluorescencia, el músculo de salto tiene una fluorescencia más débil y una forma y textura diferente. Bajo la luz normal, parece casi translúcido, mientras que las HFI son de amarillo opaco y lechoso(Figura 3J-J'',K).</li>
	<li>Usando la tensión del agua, capture (pero no agite) las EMM diseccionadas entre un par de fórceps(Figura 3L). Transfiera las HFI a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml precargado con 250 ml de 1x PBS refrigerado(Figura 3M). Proceda inmediatamente con la sección 4. NOTA: Cuando las puntas de fórceps se elevan entre sí y se levantan de una solución tampón, la tensión del agua hace que se capture una burbuja de amortiguación entre las puntas de los fórceps. Si las MFI también están presentes en esta burbuja, pueden ser sacadas de la solución y transferidas fácilmente a otro recipiente lleno de tampón. Es importante apretar los fórceps para acercar las puntas entre sí sin tocarse entre sí, para evitar macerar el tejido capturado en la burbuja tampón.</li>
</ol>4. Pellet y Conservar la muestra IFM
<ol><li>Pellet las HFI mediante centrifugación del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 3-5 min a 2.000 x g en una centrífuga de mesa(Figura 4A,B).</li>
	<li>Retire el búfer con una punta de pipeta (Figura 4C).
</li>
	<li>Para aplicaciones de ARN, resuspenda el pellet IFM en 50–100 l del búfer de aislamiento de ARN deseado (consulte Tabla de materiales, Figura 4D). De lo contrario, continúe con el paso 4.4. NOTA: Las EMM se pueden congelar en seco después del paso 4.2 para preparaciones de espectrometría de masas o aislamiento de ARN con kits comerciales (ver resultados representativos). Para aplicaciones de ARN, se obtienen mejores resultados reemplazando y congelando inmediatamente el pellet IFM en el búfer de aislamiento.</li>
	<li>Congele la muestra en hielo seco o congele a presión en nitrógeno líquido (Figura 4E). Conservar a -80oC hasta que esté listo para los pasos posteriores en la preparación de la muestra para el análisis posterior. NOTA: Después de la criopreservación, las muestras se pueden almacenar durante varios meses antes de su procesamiento para la investigación posterior.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, presentamos la técnica básica para diseccionar las IfM drosofílicas de pupas tempranas y tardías para el aislamiento posterior de proteínas, ADN, ARN u otras macromoléculas. El protocolo se puede adaptar fácilmente para diseccionar IFM de moscas adultas. Demostramos la utilidad de nuestro protocolo de disección para aplicaciones mRNA-Seq, proteómica y RT-PCR. Con la mejora continua de las tecnologías omics para permitir el análisis de muestras con menos material de partida y menores concentraciones de entrada, estas disecciones probablemente se volverán valiosas para muchas aplicaciones adicionales. Como las MFI son un modelo establecido para las miopatías humanas4,24 y desarrollo específico de tipo muscular9,12, imaginamos, por ejemplo, metabolómica enriquecida con IFM, investigaciones de conformación de cromatina a través de 3C o 4C, analizando la evaluación de la red a través de interacciones CLiP o fosfo-proteómica de miofibrillogénesis.
Es importante tener en cuenta que estas disecciones producen una muestra enriquecida para IFM en lugar de una muestra de IFM pura. Esto es inevitable debido a la inervación de la neurona motora, apegos tendinosos y invasión traqueal de las fibras musculares. El análisis bioinformático se puede utilizar para identificar genes o proteínas enriquecidos con IFM, pero se requieren más experimentos para demostrar que en realidad son específicos de IFM. La pureza de la muestra se puede analizar utilizando marcadores específicos de tejido publicados como Stripe45 (tendón), Act79B4,44 (músculo tubular), Act88F15 (IFM) o syb46 (específico neuronal). Puede ser posible utilizar estos marcadores para normalizar conjuntos de datos en el contenido específico de IFM, pero se advierte a los usuarios que los cambios temporales en la expresión de genes utilizados para la normalización, por ejemplo de genes específicos de IFM o tubulina, pueden sesgar tal enfoque.
En los últimos años se han desarrollado métodos de etiquetado específicos de tejidos genéticamente codificados, por ejemplo, el etiquetado CE47,48 o el etiquetado PABP49,50 para el ARN aislante, lo que puede ayudar a obtener una muestra de ARN específico del tejido. Sin embargo, el etiquetado EC requiere una alimentación constante de las moscas47 y, por lo tanto, no es aplicable durante las etapas pupal. La sensibilidad y la integridad de los transcriptomas etiquetados con PABP pueden tener limitaciones51. Los enfoques FACS para aislar las fibras musculares individuales se complican por el gran tamaño y la naturaleza sincitial de las MFI. INTACT52,53 enfoques de estilo se pueden aplicar para aislar compartimentos subcelulares específicos de las MFI, lo que puede resultar útil para aislar poblaciones puras de núcleos o mitocondrias IFM. Las disecciones manuales siguen siendo el estándar actual para obtener tejido IFM intacto para la mayoría de las aplicaciones posteriores.
La calidad de la muestra depende de varios pasos críticos en el proceso de disección. Las disecciones son técnicamente exigentes, con la velocidad de disección y la pureza de la muestra aumentando con la experiencia. La disección durante períodos cortos de tiempo (20-30 min) en tampón refrigerado sin detergente y la congelación inmediata ayuda a preservar la integridad de la muestra, como se ha observado anteriormente para el aislamiento del tendón del ratón54. Las EFI se pueden congelar con éxito después de eliminar todo el tampón del pellet, pero específicamente para el aislamiento de ARN, la congelación de muestras en búfer de aislamiento tiende a producir mejores resultados. Las IfM de hasta 20 disecciones separadas se combinan antes del aislamiento de ARN o proteínas, lo que permite escalar y recolectar suficiente material, incluso desde los primeros horarios o mutantes16,32,para el análisis posterior.
Para las aplicaciones de ARN, el paso más crítico puede ser el aislamiento del propio ARN. Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform isolation (método 1 arriba) supera a la mayoría de los kits comerciales probados y, como se ha señalado anteriormente, es considerablemente menos costoso55. La variabilidad observada en los rendimientos de aislamiento de ARN con kits comerciales está de acuerdo con las observaciones anteriores56,57. Añadimos glucógeno durante la precipitación de isopropanol para ayudar a recuperar todo el ARN. Más allá del rendimiento del ARN, es importante verificar la integridad del ARN para asegurarse de que la muestra no se ha fragmentado o degradado durante los procesos de disección y aislamiento. También es esencial trabajar sin RNase. Por último, la elección del RT-kit puede afectar la sensibilidad del proceso de transcripción inversa. Aunque no se discuten a menudo en detalle, todos estos puntos influyen en la calidad de la muestra IFM y los datos obtenidos de aplicaciones posteriores.
Varias modificaciones importantes diferencian el protocolo de los protocolos de disección IFM existentes. Aunque existe un protocolo de disección detallada para la inmunofluorescencia IFM19,este protocolo presenta un enfoque diferente a las disecciones pupal que permite un aislamiento más rápido del tejido IFM. Esto permite la recolección de grandes cantidades de tejido IFM (relativamente hablando) con tiempos de disección limitados para prevenir cambios de proteome o transcriptoma. Otros protocolos describen la disección de IFM para adultos para visualizar la tinción GFP en miofifines individuales39 o para la tinción de los músculos larvales de la pared del cuerpo58,pero no abordan la disección en etapas pupal o para el aislamiento de ARN o proteína. Este enfoque también es distinto del protocolo existente para la microdisección de las IfM pupal de las criosecciones38,que pueden generar una muestra de IFM más pura pero requiere más mano de obra y produce menos material. En comparación con otros protocolos de disección IFM para adultos rápidos38,39, las EIF se aíslan en el tampón PBS sin detergente para limitar la inducción de tensión y otros cambios importantes en las expresiones.
El avance clave en este protocolo es la inclusión de un reportero fluorescente en vivo, que permite el aislamiento de las EFI en las primeras etapas pupal. Utilizamos estándarme2-GAL459 conduciendo ya sea UAS-CD8::GFP o UAS-GFP::Gma60. Esto permite el etiquetado diferencial de IFM (los músculos de vuelo están más fuertemente etiquetados y con una forma diferente que otros músculos pupales), así como el rendimiento de las manipulaciones basadas en GAL4-UAS, por ejemplo, experimentos de rescate o RNAi. También es posible combinar Mef2-GAL4 con bañera-GAL80ts para evitar la letalidad temprana asociada al ARNi o con UAS-Dcr2 para aumentar la eficiencia de RNAi40.
Hay controladores GAL4 adicionales o líneas GFP disponibles que varían en especificidad de tipo muscular, patrón de expresión temporal y fuerza del controlador19,61 que se pueden utilizar en lugar de Mef2-GAL4. Por ejemplo, Act88F-GAL4 se expresa primero alrededor de 24 h APF, por lo que no se puede utilizar para puntos de tiempo anteriores; sin embargo, etiqueta fuertemente IFM y puede ser útil para evitar la letalidad temprana asociada al ARNi. El-GFP o Act88F-GFP etiqueta IFM, de nuevo con restricciones temporales, pero evitan la dependencia GAL4 de la expresión de marcador y pueden ser útiles en combinación con un fondo mutante de interés. Las listas de otras líneas de marcadores posibles están disponibles19. También debe tenerse en cuenta que el uso de transgenes y el sistema GAL4/UAS puede causar artefactos de expresión génica, por lo que es importante utilizar controles adecuados, por ejemplo, la línea del conductor cruzada a la cepa de fondo de tipo salvaje, de modo que dichos artefactos son presumiblemente lo mismo en todas las muestras.
Con el vídeo adjunto, este protocolo detallado tiene como objetivo hacer que la disección PUpal IFM sea más accesible y promover el uso de enfoques omics para estudiar el desarrollo muscular. El acoplamiento del poder de la genética Drosophila y la biología celular con los ensayos de bioquímica y omics accesibles a través de IFM diseccionado tiene el potencial de avanzar en la comprensión mecanicista de la miogénesis y la función muscular. Estudios futuros que vinculan las observaciones a nivel de sistemas del transcriptoma y la regulación del proteome con los resultados metabólicos y funcionales proporcionarán una comprensión más profunda del desarrollo específico de tipo muscular y la patogénesis de los trastornos musculares.

Las tecnologías modernas de la omica proporcionan información importante sobre el desarrollo muscular y los mecanismos subyacentes a los trastornos musculares humanos. Por ejemplo, el análisis de datos de transcriptómica combinados con la verificación genética y bioquímica en modelos animales ha revelado que la pérdida del factor de empalme RBM20 causa miocardiopatía dilatada debido a su regulación de una red objetivo de más de 30 sarcomeres genes previamente asociados con enfermedades del corazón, incluyendo la titina1,2,3.
En un segundo ejemplo, estudios del cultivo celular, modelos animales y pacientes humanos han demostrado que la distrofia miotónica es causada por una interrupción en la regulación del ARN debido al secuestro de muscleblind (MBNL) y a la regulación ascendente de CELF14,5. La dinámica transversal y temporal entre MBNL y CELF1 (también llamada CUGBP1 o Bruno-Like 2) ayuda a explicar los patrones de empalme embrionario persistente en pacientes con distrofia miotónica. Además, la gran red de objetivos mal regulados ayuda a explicar la naturaleza compleja de la enfermedad4,6,7,8. La mayoría de estos estudios utilizan enfoques omics en organismos modelo genéticos para entender los mecanismos subyacentes a la enfermedad muscular humana. Además, destacan la importancia de entender primero la expresión génica específica de tipo temporal y tisular, la modificación de proteínas y los patrones metabólicos en el músculo sano para comprender las alteraciones en el músculo enfermo o envejecido.
Drosophila melanogaster es otro organismo modelo genético bien establecido. La estructura del sarcomere, así como los componentes individuales del sarcomere se conservan altamente de las moscas a los vertebrados4,9,10,y los músculos de vuelo indirectos (IfM) se han convertido en un modelo poderoso para estudiar múltiples aspectos del desarrollo muscular11,12. En primer lugar, los músculos de vuelo fibrilar son funcional y morfológicamente distintos de los músculos tubulares del cuerpo11,13, lo que permite la investigación de mecanismos de desarrollo específicos de tipo muscular. Los factores de transcripción, incluidos Spalt major (Salm)14,Extradenticle (Exd) y Homothorax (Hth)15, han sido identificados como reguladores del destino fibrilar. Además, aguas abajo de Salm, el homólogo CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programa de empalme específico de la fibrilar16,17.
En segundo lugar, las HFI son un modelo importante para entender el proceso de miogénesis en sí, desde la fusión de mioblastos y el apego miotubo a la miofibrillogénesis y la maduración del sarcomere9,18,19. En tercer lugar, la genética Drosophila permite investigar las contribuciones de proteínas individuales, dominios de proteínas e isoformas de proteínas a la formación, función y propiedades biofísicas de sarcomere20,21,22 ,23. Por último, se han desarrollado modelos IFM para el estudio de múltiples trastornos musculares humanos, como distrofia miotónica, miopatías miofibrilares, trastornos degenerativos musculares, actinopatías, etc.24,25,26 ,27, y han proporcionado información importante sobre los mecanismos de la enfermedad y las posibles terapias28,29,30. Por lo tanto, Drosophila es un modelo útil para abordar muchas preguntas abiertas en el campo de la miogénesis, incluyendo mecanismos de transcripción específica de tipo muscular, empalme, y regulación de la cromatina, así como el papel del metabolismo en el desarrollo muscular. La aplicación de tecnologías omicas modernas, en particular en combinación con la amplia variedad de ensayos biológicos genéticos, bioquímicos y celulares disponibles en Drosophila,tiene el potencial de avanzar dramáticamente en la comprensión de los desarrollo, envejecimiento y enfermedades.
Las EMM son los músculos más grandes de la mosca, abarcando casi 1 mm a lo largo de toda la longitud del tórax en adultos31,32. Sin embargo, este pequeño tamaño genera el desafío de obtener suficiente muestra para aplicar tecnologías omicas en Drosophila de una manera específica de tipo de tejido. Además, las EFI son parte de la musculatura adulta que se forma durante las etapas pupal. Los mióblastos se fusionan para formar miotubos, que se unen a los tendones alrededor de 24 h después de la formación del puparium (APF) y se someten a un paso de compactación necesario para iniciar la miofibrillogénesis alrededor de 30 h APF(Figura 1A-D)18,33, 34.
Las miofibers crecen hasta entonces crecer hasta abarcar toda la longitud del tórax, con miofibrils sometidos a una fase de crecimiento inicial centrada en la adición de sarcomere hasta alrededor de 48 h APF, y luego la transición a una fase de maduración, en la que los sarvenes crecen en longitud y anchura y son remodelado para establecer la activación de estiramiento por 72 h APF(Figura 1A-D)32,35. La aparición de la maduración de la fibra está controlada al menos parcialmente por Salm y E2F32,36,37,y múltiples isoformas de proteína de sarcomere específicas de IFM cuya empalpedura es controlada por Bru1 se incorporan durante este fase16,17. Las moscas maduras cierran de 90-100 h APF. Esto significa que para estudiar el desarrollo muscular, IFM tiene que ser aislado con suficiente cantidad, calidad y pureza de múltiples puntos de tiempo pupal para facilitar el análisis utilizando enfoques omics.
Se han publicado varios protocolos para la disección IFM. Si bien estos protocolos funcionan bien para sus aplicaciones previstas, ninguno es ideal para enfoques omics. Los protocolos que preservan la morfología IFM para la inmunofluorescencia de las IFM19pupales y adultas, aíslan las fibras IFM para la evaluación mecánica31,o utilizan microdisección de IFM pupal de las criosecciones38 son demasiado especializados y el tiempo y mano de obra para obtener razonablemente cantidades suficientes de tejido IFM para aplicaciones de omics. Otros protocolos se han desarrollado para la disección rápida de IFM38específicamente adultos,39, por lo tanto no son aplicables a las etapas pupal, y utilizan buffers que no son ideales o pueden ser incompatibles con, por ejemplo, el aislamiento de ARN. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos enfoques para aislar la IFM pupal para aplicaciones de bioquímica u omics.
Aquí presentamos un protocolo para la disección de IFM durante las etapas pupal que se ha utilizado con éxito para el análisis mRNA-Seq desde 16 h APF a través de etapas adultas16,32. El protocolo emplea una etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP) para identificar las MFI en todas las etapas del desarrollo pupal y adulto, permitiendo la disección en vivo bajo un microscopio de disección fluorescente. El enfoque es menos intensivo en mano de obra, con un mayor rendimiento que los protocolos de disección IFM existentes. Esto permite el aislamiento rápido y la criopreservación de muestras, generando suficiente material después de varias rondas de disección para enfoques omics, así como para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa estándar (RT-PCR) o la hincha occidental.
Presentamos el protocolo en dos partes, demostrando cómo diseccionar rápidamente las IfM tanto antes de 48 h APF (durante la metamorfosis temprana, cuando los accesorios de IFM son más tenues) como después de 48 h APF (cuando el plan corporal pupal y los accesorios de IFM están bien definidos). Demostramos que podemos aislar el ARN de alta calidad de las IfM diseccionadas en todos los puntos de tiempo y presentar datos sobre diferentes enfoques para el aislamiento del ARN y la transcripción inversa. Por último, demostramos la aplicación del protocolo de disección a mRNA-Seq, espectrometría de masas y RT-PCR utilizando el homólogo CELF1 Bruno1 como ejemplo. Mostramos la expresión errónea de isoformas de proteínasar en datos proteómicos de la IFM mutante Bruno1 y examinamos la regulación Bruno1 del evento de empalme C-terminal de la cadena pesada de Myosin (Mhc). Estos resultados ilustran cómo los datos de omics pueden proporcionar una comprensión más profunda de los fenómenos biológicos, complementando los experimentos genéticos y bioquímicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

El músculo de vuelo drosofilia es un modelo potente para estudiar diversos procesos como la regulación transcripcional, el empalme alternativo, el metabolismo y la mecanobiología, que influyen en el desarrollo muscular y la miofibrillogénesis. Los datos de omics, como los generados por espectrometría de masas o secuenciación profunda, pueden proporcionar información mecanicista importante sobre estos procesos biológicos. Para estos enfoques, es beneficioso analizar muestras específicas de tejido para aumentar la selectividad y la especificidad de las huellas dactilares omicas. Aquí presentamos un protocolo para la disección de músculo de vuelo con etiqueta fluorescente de pupas vivas para generar muestras musculares altamente enriquecidas para aplicaciones de omics. Primero describimos cómo diseccionar los músculos de vuelo en las primeras etapas pupal (<48 h después de la formación de puparium [APF]), cuando los músculos son discernibles por el etiquetado de proteína fluorescente verde (GFP). A continuación, describimos cómo diseccionar los músculos de las pupupas tardías (>48 h APF) o adultos, cuando los músculos son distinguibles bajo un microscopio de disección. El protocolo de vídeo que lo acompaña hará que estas disecciones técnicamente exigentes sean más accesibles para las comunidades de investigación de músculo y Drosophila. Para aplicaciones de ARN, se asayuna la cantidad y calidad del ARN que se puede aislar en diferentes puntos de tiempo y con diferentes enfoques. Demostramos además que Bruno1 (Bru1) es necesario para un cambio temporal en el empalme de la cadena pesada de miosina(Mhc),lo que demuestra que los músculos diseccionados se pueden utilizar para mRNA-Seq, espectrometría de masas y reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) Aplicaciones. Este protocolo de disección ayudará a promover análisis de omics específicos del tejido y se puede aplicar generalmente para estudiar múltiples aspectos biológicos de la miogénesis.

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

El músculo de vuelo drosofífia es un modelo potente para estudiar la regulación transcripcional, el empalme alternativo, el metabolismo y la mecanobiología. Presentamos un protocolo para la disección del músculo de vuelo con etiqueta fluorescente a partir de pupas vivas para generar muestras altamente enriquecidas ideales para la proteómica y la secuenciación profunda. Estas muestras pueden ofrecer importantes perspectivas mecanicistas sobre diversos aspectos del desarrollo muscular.

Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

El protocolo facilita la disección del músculo de vuelo indirecto con etiqueta GFP de Drosophila en varios momentos durante el desarrollo de las pupas para evaluar los cambios en la expresión genética y proteica. Usando estas técnicas, se puede lograr una muestra muscular de vuelo altamente enriquecida con una degradación mínima de la proteína de ARN que es adecuada para RT-PCR, mancha occidental o enfoques omicos. Estas disecciones especializadas requieren práctica y habilidad, pero el número de pupas que se pueden diseccionar y la calidad de las muestras mejora con experiencia.La demostración visual de esta disección es fundamental para determinar cómo distinguir los músculos de vuelo de los tejidos no musculares y facilitar el aislamiento rápido de los músculos de vuelo de los especímenes pupales. Para escenificar las pupas, usa un pincel mojado para recolectar y transferir pre-pupas a un plato petri de 60 milímetros, y sexa las pupas bajo un microscopio binocular. Los machos se identifican por la presencia de testículos, que aparecen como globos translúcidos en las pupas de otro modo opacas.Después de etiquetar el plato con la hora, la fecha y el genotipo de las moscas, envejecer las pupas en una incubadora de 25 a 27 grados Celsius hasta la etapa apropiada. Para la disección de IFM antes de 48 H APF, utilice un pincel mojado para transferir las pupas adecuadamente escenificadas a un plato de disección negro sobre 2/3 lleno de PBS frío. Bajo el microscopio de disección fluorescente, usa 5 fórceps para empujar una de las pupas al fondo de la placa negra diseccionante.Ajuste el zoom y el enfoque del microscopio hasta que las pupas se puedan visualizar claramente. Usando un par de fórceps para agarrar la anterior de las pupas, pincha las pupas con una sola punta de un segundo par de fórceps, ligeramente descentramente en el abdomen, justo detrás del tórax. Usa el primer par de fórceps para eliminar la mitad anterior del caso pupal, y para pellizcar las pupas expuestas justo detrás del tórax para separar el abdomen del tórax.A continuación, apriete suavemente la parte anterior del tórax para exponer las IFM con etiqueta fluorescente. Luego, usa los fórceps para desechar el cadáver restante en el lado opuesto de la antena, y disecciona las pupas subsiguientes de la misma manera. Cuando todas las pupas hayan sido diseccionadas, usa los fórceps para recoger las fibras de IFM, y organiza las fibras en una pila en la parte inferior del plato de disección negro.Utilice los fórceps para expulsar cualquier residuo del campo de visión y eliminar los músculos, la grasa, las cutículas u otro tejido no deseado de las muestras. A continuación, utilice una punta de pipeta recortada para transferir la pila de IFM a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS refrigerado. Para la disección ifM después de 48 H APF, utilice un pincel ligeramente humedecido para transferir las pupas escenificadas a una tira de cinta adhesiva de doble cara montada en una diapositiva de microscopio.Oriente las pupas en una línea, el lado ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior de la diapositiva. Cuando se hayan colocado todas las pupas, utilice fórceps para separarse y abrir el primer caso pupal por encima de los espiráculos anteriores, y deslice suavemente un par de fórceps dorsalmente, hacia la parte posterior, cortando el caso pupal a medida que los fórceps se mueven. Libere a las pupas de la caja abierta e inmediatamente transfiera las pupas a una gota de PBS en una segunda diapositiva del microscopio.Cuando todas las pupas estén liberadas, usa tijeras finas para cortar el abdomen de las pupas lejos del tórax, y empuja los abdomens en una pila separada. Cuando se hayan extraído todos los tórax, utilice un pedazo de papel tisú para extraer la mayoría del PBS y la pila de abdomens. Agregue una gota de PBS fresco y frío a los tórax restantes, antes de usar las tijeras para cortar desde la cabeza a lo largo del eje longitudinal del cuerpo en un solo movimiento para dividir el tórax por la mitad.Cuando todas las pupas hayan sido diseccionadas, utilice los 5 fórceps para seleccionar una de las hemisecciones, e inserte suavemente las puntas de un fórceps por encima y por debajo de la mitad de las IFM. Sosteniendo el primer par de fórceps quietos, utilice tijeras finas para cortar un extremo del IFM lejos de la cutícula y los tendones, antes de girar las pupas 180 grados, para permitir que el otro extremo de la IFM se corte libre de la cutícula y los tendones. Utilice fórceps para transferir el haz IFM desde el tórax hasta el borde de la burbuja PBS, utilizando la tensión del agua para mantener el haz en su lugar.A continuación, empuje la carcasa hacia el lado opuesto de la diapositiva y disecciona el resto de las IFM de la misma manera. Cuando se hayan recogido todas las IFM, utilice los 5 fórceps para eliminar cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber encontrado su camino en las muestras. A continuación, utilice la tensión de agua para capturar suavemente las IFM diseccionadas entre un par de fórceps, y coloque las IFM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS refrigerado.Los datos de secuenciación de ARNm de las SIMM IR de BRUNO1 muestran cambios en la expresión en el nivel de unidad genética en comparación con los datos de secuenciación de tipos salvajes. Utilizando espectrometría de masas de proteoma completo en IFM diseccionadas, se observa una regulación similar a niveles de isoforma de proteínas y proteínas. Después de la inserción de una línea de trampa de proteína en el intrón final de Mhc, la incorporación de la proteína etiquetada por GFP se puede observar en IFM como dos puntos a cada lado de la línea M a 90 H APF, mientras que en el tejido muscular de la pierna la señal GFP se puede observar uniformemente a través de la línea M de sarcomere.Cuando se utiliza RT-PCR en IFM diseccionado, se puede detectar un interruptor de isoforma Mhc del exón 34 a 37 etiquetado por GFP al evento exon 34 a 35 sin etiquetar, entre 30 y 48 horas después de la formación de puparium a 27 grados centígrados. A partir de los datos de secuenciación de ARNm, los tejidos musculares de pierna y salto expresan las tres isoformas Mhc, manteniendo la expresión de la isoforma etiquetada por GFP en el músculo maduro. Tanto Spalt mutante principal como BRUNO1 IR-IFM, no lograron desactivar la expresión de la isoforma Mhc etiquetada por GFP a medida que se desarrollan, lo que resultó en un perfil de expresión isóforma que se asemeja al del tejido muscular de pierna y salto.Recuerde que las disecciones deben realizarse en menos de 30 minutos para evitar la degradación del ARN. Y, para tener cuidado de limitar la contaminación por otros tipos de células. Este método genera muestras enriquecidas con IFM adecuadas para enfoques bioquímicos como RT-PCR, o hinchazón occidental, así como enfoques de estilo omic, como espectrometría de masas, secuenciación de alto rendimiento, captura de conformación de cromatina y metabolómica.Estas disecciones pueden complementar los poderosos enfoques genéticos de Drosophila con datos a nivel de sistemas para investigar los mecanismos fundamentales de desarrollo y regulación genética.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Investigación

Genética

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In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

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