Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Andreas Ladurner och Frank Schnorrer för generöst stöd. Vi tackar Sandra Esser för utmärkt teknisk assistans och Akanksha Roy för att generera masspektrometri data. Vi erkänner Bloomington och Wien lager centra för att tillhandahålla flugor. Vi tackar Core facility bioimaging för hjälp med konfokalmikroskopi Imaging och zentrallabor für proteinanalytik för analys av masspektrometriprover, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, de). Vårt arbete stöddes av Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), centrum för Integrated protein Science Munich (CIPSM) vid Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) och International Max Planck-Forskningsskolan (EN).

1. iscensätta puppor
<ol><li>Höj flugor av önskad genotyp i flaskor (figur 1E). Antingen göra en ny flip av dissektion beståndet eller ställa ett kors med minst 20 kvinnliga jungfru flugor. Underhålla flaskor tills flugorna börjar pupate.</li>
	<li>Samla upp pre-puppor med en fuktad pensel och överför till fuktat filtrerpapper i en 60 mm petriskål (figur 1F).</li>
	<li>Kön puppan, samla lämpligt kön för experimentet (figur 1G). Hanar identifieras genom närvaron av testiklarna, som visas som genomskinliga bollar i den annars ogenomskinliga puppan.</li>
	<li>Märk petriskål med tid, datum och genotyp, sedan åldras puppor till önskat skede (figur 1H). Anmärkning: Upprätthålla kors/lager och ålders puppor i en temperaturkontrollerad inkubator (dvs., 25 ° c eller 27 ° c för RNAi korsar, eftersom ökad Gal4 aktivitet vid högre temperaturer ökar knock-down effektivitet40). Se till att luftfuktigheten är tillräckligt hög så puppor inte torkar ut när åldrande flera dagar.</li>
</ol>2. IFM dissektion före 48 h APF
<ol><li>Montera den utrustning som behövs, inklusive två #5 biogradig tång, en pipett, pipettspetsar, torris och (för RNA-prov) isoleringsreagens (se tabell över material). Dessutom Chill svart dissekera rätter (se tabell över material), 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert, och 1,5 ml microcentrifug rör på is.</li>
	<li>Med hjälp av en fuktad pensel, överför iscensatta puppor till en svart dissekationskål fylld ungefär två tredjedelar med kallt 1x PBS (figur 2a, B). Flytta till en fluorescerande dissekera Mikroskop. Anmärkning: Använd så många puppor som kan dissekeras inom en 30 min tid fönster. Beroende på erfarenhet, detta varierar från 3-15 puppor. Se kompletterande metoder för diskussion av alternativ till svart dissekera rätter.</li>
	<li>Med hjälp av #5 pincett, skjut en av puppor till botten av en svart dissekera skålen och justera mikroskopet zoom och fokus för att tydligt se puppan (figur 2C).</li>
	<li>Ta tag i främre av puppan med en pinpett (figur 2D), sedan peta puppor med en enda spets på andra tång något off-Center i buken, precis bakom bröstkorgen. Detta håller Pupa på plats och förhindrar IFMs från att flytta in i buken (figur 2E). Anmärkning: Börja timing längden på dissektion från denna punkt, så snart Pupp integritet störs. Använd en definierad längd av dissektion (till exempel 20 – 30 min) för att minimera muskel döden och associerade transcriptomic och proteomiska förändringar. Dissekera så många flugor som möjligt under denna tidsperiod.</li>
	<li>Använd den första pinpett, ta bort den främre halvan av Pupp fallet (figur 2F).</li>
	<li>Använd samma pinpett för att nypa de exponerade puppor precis bakom bröstkorgen, och separera buken från bröstkorgen (figur 2G).</li>
	<li>Med hjälp av tång, pressa försiktigt den främre delen av bröstkorgen (för < 35 h APF) eller rippa öppna bröstkorgen för att exponera fluorescerande märkta IFMs (figur 2h). IFMs kommer lätt lossna från överhuden, som sena bilagor vid tidiga tidpunkter är bräckliga. Kassera resterande slaktkropp med hjälp av pinuper för att pressa den till den motsatta sidan av skålen.</li>
	<li>Upprepa steg 2.3 – 2.7, dissekera ytterligare puppor.</li>
	<li>Samla in IFM-fibrerna med pinps och organisera dem i en stapel i botten av den svarta dissekera skålen (figur 2I, J). Ta bort skräp genom att trycka ut den ur synfältet med hjälp av tång. Anmärkning: Med övning kan pinps tips föras in i närheten utan att röra varandra. Denna teknik kan användas för att löst greppa IFMs utan att förstöra dem. Alternativa metoder inkluderar försiktigt trycka eller lyfta IFMs med en enda spets eller helt slutna tång, eller ta lite fett eller annan vävnad med IFM och ta bort fettet som beskrivs i steg 2,10.</li>
	<li>Kvalitetskontrollera IFM-muskelprovet med hjälp av tång för att ta bort icke-IFM-muskler, fett, nagelband etc. från provet (figur 2K, L). Anmärkning: Med Mef2-Gal4 är IFM märkt starkare än andra muskel typer vid tidiga tidpunkter (figur 2k, k '), vilket gör att man kan avlägsna hopp muskler och larv muskler baserat på fluorescensintensitet och muskel form. Fett och nagelband vävnad ser olika ut och är inte märkta med en muskelspecifik fluorescens etikett (figur 2k, k). Se diskussionsavsnittet för andra Gal4 rader som etiketten IFM.</li>
	<li>Med hjälp av en klippt pipettspets överför du högen av IFMs till ett 1,5 mL microcentrifugerör fyllt med 250 μL kyld 1x PBS (figur 2M-O). Fortsätt omedelbart till avsnitt 4. Anmärkning: IFM-proverna kan försvinna helt enkelt genom att fastna på sidan av pipettspetsen. Pipettering buffert upp och ner flera gånger innan du samlar IFMs kan göra standard tips mindre klibbiga, och silikoniserad eller perfluoroalkoxy (PFA) tips (se tabell över material) med lägre yta spänningar kan bidra till att förhindra prov förlust.</li>
</ol>3. IFM dissektion efter 48 h APF
<ol><li>Montera nödvändig utrustning inklusive två #5 biologi grade forceps, fin sax, standardglas Mikroskop diabilder, dubbel-stick tejp, pipett, pipettspetsar, torris, och (för RNA-applikationer) isoleringsreagens (se tabell över material). Kyla 1x PBS och microcentrifug rören på isen.</li>
	<li>Använd en lätt fuktad pensel och överför den mellanlagrade puppan till en remsa av dubbelhäftande tejp monterad på en Mikroskop bild (figur 3a). Placera puppor i en linje orienterad i samma orientering (ventral ner och främre mot botten av bilden). Anmärkning: Var noga med att inte använda för mycket vatten på pensel eller filter, eller puppor kommer inte att sticka bra. Om puppor inte fastnar, torka dem genom att först överföra till ett torrt filter eller mjukpapper. Montera så många puppor som kan dissekeras inom en 30 min tid fönster, helst ~ 10 puppor.</li>
	<li>Ta bort Pupa från Pupp-fodralet. Använd pinpett att retas isär och öppna Pupp fallet ovanför de främre trakeer (figur 3B).</li>
	<li>Skjut försiktigt ett par tång dorsalt mot den bakre, skära Pupp fallet som pincett flytta (figur 3B). Var noga med att inte brista den underliggande Pupa. Befria pupan från det öppnade fodralet och överför den omedelbart till en droppe 1x PBS på en andra Mikroskop bild (figur 3B ", C).</li>
	<li>Upprepa steg 3,3 och 3,4 för alla puppor i linjen, sedan ställa in dubbel-stick band glida åt sidan.</li>
	<li>Med hjälp av den fina saxen, skär buken av puppan bort från bröstkorgen och skjut in den i en separat stapel (figur 3d, d). Upprepa för återstående puppor. Anmärkning: Börja timing längden på dissektion med steg 3,6, så snart Pupp integritet störs. Dissekera så många flugor som möjligt i 20 – 30 min för att förhindra celldöd och tillhörande transkriptomiska och proteomiska förändringar. När dissekera 1 d vuxna eller > 90 h puppor, är det ofta bekvämt för senare steg för att dessutom ta bort huvudet med fin sax.</li>
	<li>Med hjälp av ett mjukpapper, ta bort majoriteten av 1x PBS (allmänt grumlig med suspenderat fett) samt högen av abdomens (figur 3E). Tillsätt en droppe färsk, kyld 1x PBS till de kvarvarande bröst axlarna.</li>
	<li>Använd saxen för att skära bröstkorgen i hälften (figur 3f, f) genom att skära från huvudet nedåt den längsgående kropps axeln i en enda rörelse. Växelvis, om huvudet har tagits bort, först in saxen där huvudet var fäst och skär den övre halvan av bröstkorgen längsled mellan IFMs. Skär sedan den ventrala sidan av bröstkorgen med en andra skära i samma orientering.</li>
	<li>Upprepa steg 3,7 och 3,8 för alla puppor att dissekeras, generera en hög med bröstkorgen hemisections nära mitten av bilden. Se till att det finns tillräckligt med kyld 1x PBS på bilden så att hemisektionerna inte torkar ut. Anmärkning: Efter 48 h APF, IFMs är tillräckligt stora för att vara synlig under en standard dissekera Mikroskop till tränade ögat. Vid denna punkt i protokollet, kan muskler med en fluorescerande etikett flyttas till en fluorescerande dissekera utrymme till stöd i IFM identifiering eller för utbildningsändamål, men detta är inte nödvändigt.</li>
	<li>Dissekera IFMs ur bröstkorgen. Isolera en av hemisektionerna med hjälp av #5 tång (figur 3G, H). Sätt försiktigt i spetsarna på en tång ovanför och under mitten av IFMs (figur 3G ', H '). Medan du håller den första tång fortfarande, Använd fin sax för att skära ena änden av IFM bort från nagelbanden och senor. Skär sedan den andra änden av IFM fritt från nagelbanden (figur 3G ' ', H ' '). Anmärkning: Beroende på riktningen av bröstkorgen efter den första IFM skära, är det lämpligt att rotera bröstkorgen 180 ° så att den andra IFM skära är lättare att utföra.</li>
	<li>Ta bort IFM-paketet från bröstkorgen med pintippar (figur 3G ' ', H ' ' '), och överför det till kanten av PBS-bubblan för att använda vatten spänningen för att hålla den på plats (figur 3i). Skjut kadaver till motsatt sida av bilden. Upprepa för de återstående bröstkorgen-hemisektionerna, vilket genererar en samling dissekerade ifms. Anmärkning: Om IFMs inte stanna i en snygg hög, ta bort några av 1x PBS med en vävnad. Var noga med att inte låta alla PBS avdungra, och se till att dissekerade IFMs och hemithoraxes fortfarande omfattas av buffert.</li>
	<li>Efter dissekera alla IFMs, snabbt utföra en kvalitetskontroll på dissekerade muskler. Med hjälp av #5 tång, ta bort alla hoppa muskler eller nagelband fragment som kan ha funnit sin väg in i provet (figur 3J-K ' '). Anmärkning: Hoppa muskler verkar skilja från IFM. Om dissekera Mef2-Gal4 märkt muskler under fluorescens, Jump muskel har en svagare fluorescens och en annan form och textur. Under normalt ljus, verkar det nästan genomskinligt medan IFMs är en ogenomskinlig, mjölkig gul (figur 3j-j ' ', K).</li>
	<li>Använda vatten spänning, fånga (men inte squish) dissekerade IFMs mellan ett par tång (figur 3L). Överför IFMs till ett 1,5 mL microcentrifugerör som är förfylld med 250 μL kyld 1x PBS (figur 3M). Fortsätt omedelbart med avsnitt 4. Anmärkning: När tång tips tas i närheten av varandra och lyfts ut ur en buffertlösning, orsakar vatten spänningar en bubbla av buffert som skall fångas mellan pinps tips. Om IFMs finns också i denna bubbla, kan de lyftas ut ur lösningen och lätt överföras till en annan buffert fyllda kärlet. Det är viktigt att pressa tång för att få tips nära varandra utan att röra varandra, för att undvika lakats vävnaden fångas i bufferten bubblan.</li>
</ol>4. pellets och bevara IFM-provet
<ol><li>Pellets den IFMs genom centrifugering av 1,5 mL microcentrifug röret för 3 – 5 min vid 2 000 x g i en bordsskiva centrifug (figur 4a, B).</li>
	<li>Ta bort bufferten med pipettspetsen (figur 4C).
</li>
	<li>För RNA-tillämpningar, Omsuspendera IFM-pelleten i 50 – 100 μL av den önskade RNA-isoleringsbufferten (se tabell över material, figur 4D). Annars går du vidare till steg 4,4. Anmärkning: IFMs kan frysas efter steg 4,2 för masspektrometri preparat eller isolering av RNA med kommersiella Kit (se representativa resultat). För RNA-tillämpningar erhålls bättre resultat genom att omedelbart omlägga och frysa IFM-pelleten i isoleringsbufferten.</li>
	<li>Frys provet på torris eller tryck frysning i flytande kväve (figur 4E). Förvara vid-80 ° c till klar för efterföljande steg i provberedning för nedströms analys. Anmärkning: Efter frysförvaring kan prover lagras i flera månader före bearbetningen för nedströmsundersökningar.</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

I detta protokoll presenterar vi den grundläggande tekniken för att dissekera Drosophila ifms från tidiga och sena stadier av puppor för nedströms isolering av protein, DNA, RNA eller andra makromolekyler. Protokollet kan enkelt anpassas för att dissekera IFM från vuxna flugor. Vi visar nyttan med vårt dissekeringsprotokoll för mRNA-SEQ, proteomik och RT-PCR-program. Med kontinuerlig förbättring av omics-teknik för att möjliggöra analys av prover med mindre utgångsmaterial och lägre ingångs koncentrationer kommer dessa dissektioner sannolikt att bli värdefulla för många ytterligare tillämpningar. Som ifms är en etablerad modell för mänskliga myopatier4,24 och muskel-typ specifik utveckling9,12, vi föreställa, till exempel, IFM-berikad metabolomics, undersökningar av kromatin konformation via 3C eller 4C, skarvning nätverks utvärdering via CLiP interaktioner eller Phospho-proteomik av myofibrillogenes.
Det är viktigt att tänka på att dessa dissektioner producerar ett prov berikat för IFM i stället för ett rent IFM-prov. Detta är oundvikligt på grund av motoriska neuron innervation, senor bilagor och luftrör invasion av muskelfibrer. Bioinformatik analys kan användas för att identifiera IFM berikade gener eller proteiner, men ytterligare experiment krävs för att visa att de är i själva verket IFM-specifika. Prov renhet kan analyseras med hjälp av publicerade vävnadsspecifika markörer som stripe45 (senan), Act79B4,44 (tubulär muskel), Act88F15 (IFM) eller SYB46 (neuronala specifika). Det kan vara möjligt att använda sådana markörer för att normalisera datauppsättningar till IFM-specifikt innehåll, men användarna varnas för att temporala förändringar i uttrycket av gener som används för normalisering, till exempel av IFM-specifika gener eller tubulin, kan bias ett sådant tillvägagångssätt.
Genetiskt kodade vävnadsspecifika märkningsmetoder, till exempel EC-märkning47,48 eller pabp-märkning49,50 för att isolera RNA har utvecklats under de senaste åren, vilket kan bidra till att få en verkligt vävnadspecifikt RNA-prov. Men EG-märkning kräver konstant utfodring av flugor47 och därmed är inte tillämplig under Pupp stadier. Känsligheten och fullständigheten hos PABP-märkta transkriptomer kan ha begränsningar51. FACS metoder för att isolera enskilda muskelfibrer kompliceras av den stora storleken och syncytial natur av IFMs. Intakt52,53 stil metoder kan tillämpas för att isolera specifika subcellulära-avdelningar från ifms, vilket kan visa sig användbart för att isolera rena populationer av IFM kärnor eller mitokonen. Manuella dissektioner är fortfarande den nuvarande standarden för att få intakt IFM vävnad för de flesta nedströms applikationer.
Prov kvaliteten beror på flera kritiska steg i dissekeringsprocessen. Dissektioner är tekniskt krävande, med dissektionshastighet och prov renhet ökar med erfarenhet. Dissekera för korta tidsperioder (20 – 30 min) i kyld buffert utan rengöringsmedel och omedelbart frysning hjälper till att bevara prov integriteten, som har observerats tidigare för mus senan isolering54. IFMs kan framgångsrikt frysas efter avlägsnande av alla buffert från pelleten, men specifikt för RNA isolering, frysning prover i isolering buffert tenderar att ge bättre resultat. Ifms från upp till 20 separata dissektioner kombineras före RNA eller protein isolering, vilket gör att skala upp och samla tillräckligt med material, även från tidiga tidpunkter eller mutanter16,32, för nedströms analys.
För RNA-tillämpningar kan det mest kritiska steget vara isoleringen av RNA självt. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform isolering (metod 1 ovan) överträffar de flesta kommersiella kit testade och, som tidigare nämnts, är betydligt billigare55. Variationen som observerades i RNA-isolationsavkastningar med kommersiella Kits är i samförstånd med tidigare observationer56,57. Vi lägger ytterligare glykogen under isopropanol nederbörd att hjälpa till att återvinna alla RNA. Bortom RNA avkastning, är det viktigt att kontrollera RNA integritet för att säkerställa att provet inte har fragmenterats eller försämrats under dissektion och isolerings processer. Det är också viktigt att arbeta RNase-fri. Slutligen kan valet av RT-kit påverka känsligheten för omvänd Transkription processen. Även om de inte ofta diskuteras i detalj, påverkar alla dessa punkter kvaliteten på IFM-provet och de data som erhålls från nedströmsprogram.
Flera viktiga ändringar ställer in protokollet bortsett från befintliga IFM dissekeringsprotokoll. Även om en detaljerad dissekeringsprotokoll för IFM immunofluorescens finns19, presenterar detta protokoll en annan metod för Pupp dissektioner som möjliggör en snabbare isolering av IFM vävnad. Detta möjliggör insamling av stora mängder IFM vävnad (relativt sett) med begränsad dissekera gånger för att förhindra proteomet eller transkriptome förändringar. Andra protokoll beskriver dissektion av vuxna IFM för att visualisera GFP färgning i enskilda myofibriller39 eller för färgning av larv Body-Wall muskler58, men de inte adress dissektion vid Pupp stadier eller för isolering av RNA eller protein. Denna metod skiljer sig också från det befintliga protokollet för microdissektion av Pupp ifms från kryosections38, som kan generera en renare IFM prov men är mer arbetsintensiva och producerar mindre material. Jämfört med andra Rapid Adult IFM dissektion protokoll38,39, ifms isoleras i PBS buffert utan rengöringsmedel för att begränsa stress induktion och andra stora förändringar uttryck.
Den viktigaste förskott i detta protokoll är införandet av en levande, fluorescerande reporter, vilket gör isolering av ifms vid tidiga Pupp stadier. Vi använder standardmässigt Mef2-GAL459 köra antingen UAS-CD8:: GFP eller UAS-GFP:: GMA60. Detta möjliggör differentiell märkning av IFM (flygmuskler är starkare märkta och annorlunda formade än andra Pupp muskler) samt prestanda GAL4-UAS-baserade manipulationer, till exempel Rescue eller RNAi experiment. Det är också möjligt att kombinera Mef2-GAL4 med tub-GAL80TS för att undvika RNAi-associerad tidig dödlighet eller med UAS-Dcr2 för att öka RNAi Efficiency40.
Det finns ytterligare GAL4 drivrutiner eller GFP-linjer tillgängliga som varierar i muskel-typ specificitet, temporal uttryck mönster och föraren styrka19,61 som kan användas i stället för Mef2-GAL4. Till exempel, Act88F-GAL4 uttrycks först runt 24 h APF, så det kan inte användas för tidigare tidpunkter; Det är dock starkt etiketter IFM och kan vara användbart för att undvika RNAi-associerad tidig dödlighet. Honom-GFP eller Act88F-GFP Label IFM, återigen med temporala restriktioner, men de undviker GAL4 beroende av markör uttryck och kan vara användbara i kombination med en mutant bakgrund av intresse. Listor över andra möjliga markör linjer finns tillgängliga19. Det bör också noteras att användning av transgener och GAL4/UAS systemet kan orsaka gener Expression artefakter, så det är viktigt att använda lämpliga kontroller, till exempel föraren linje korsas till Wild-typ bakgrund stam, så att sådana artefakter är förmodligen samma i alla prover.
Med den medföljande videon syftar detta detaljerade protokoll till att göra Pupp IFM dissektion mer tillgänglig och främja användningen av omics metoder för att studera muskelutveckling. Koppling kraften i Drosophila genetik och cellbiologi med biokemi och omics analyser tillgängliga genom DISSEKERADE IFM har potential att avancera mekanistisk förståelse av myogenes och muskelfunktion. Framtidsstudier länka system-nivå observationer av transkriptome och proteomet reglering till metaboliska och funktionella utgångar kommer att ge en djupare förståelse av muskel-typ specifik utveckling och patogenesen av muskelsjukdomar.

Moderna omics Technologies ger viktiga insikter i muskelutveckling och mekanismerna bakom mänskliga muskelsjukdomar. Till exempel har analys av transkriptomics data kombinerat med genetisk och biokemisk verifiering i djurmodeller visat att förlust av skarvning faktor RBM20 orsakar dilaterad kardiomyopati på grund av dess reglering av ett mål nätverk av mer än 30 sarcomere gener som tidigare förknippats med hjärtsjukdom, inklusive Titin1,2,3.
I ett andra exempel, studier från cellkultur, djurmodeller, och mänskliga patienter har visat att internationellt dystrofi orsakas av en störning i RNA-reglering på grund av kvarstad på muscleblind (MBNL) och uppreglering av CELF14,5. Den tvär reglerande och temporala dynamiken mellan MBNL och CELF1 (även kallad CUGBP1 eller Bruno-like 2) bidra till att förklara de ihållande embryonala skarvning mönster i internationellt dystrofi patienter. Dessutom bidrar det stora nätverket av felreglerade mål till att förklara sjukdomens komplexa natur4,6,7,8. En majoritet av sådana studier utnyttjar omics metoder i genetiska modellorganismer för att förstå mekanismerna bakom människans muskelsjukdom. Dessutom, de belyser vikten av att först förstå temporala och vävnads-typ specifika genuttryck, protein modifiering, och metabola mönster i friska muskler att förstå förändringar i sjuka eller åldrande muskler.
Drosophila melanogaster är en annan väletablerad genetisk modellorganism. Strukturen i sarcomere samt enskilda sarcomere komponenter är mycket bevaras från flugor till ryggradsdjur4,9,10, och indirekta flyg musklerna (ifms) har blivit en kraftfull modell för att studera flera aspekter av muskelutveckling11,12. Först, fibrillar flygmuskler är funktionellt och morfologiskt skiljer sig från tubulär kroppens muskler11,13, vilket möjliggör utredning av muskel-typ specifika utvecklingsmekanismer. Transkriptionsfaktorer inklusive spalt Major (Salm)14, extradenticle (EXD), och Homothorax (HTH)15 har identifierats som fibrillar öde regulatorer. Dessutom, nedströms i Salm, den CELF1 homolog Bruno1 (Bru1, aret) leder en fibrillar-specifika skarvning program16,17.
För det andra, ifms är en viktig modell för att förstå processen för myogenes själv, från myoblast fusion och myotube fastsättning till myofibrillogenes och sarcomere mognad9,18,19. För det tredje tillåter Drosophila Genetics utredning av bidrag från enskilda proteiner, protein domäner och proteinisoformer till sarcomere formation, funktion och biofysiska egenskaper20,21,22 ,23. Slutligen har IFM modeller utvecklats för studier av flera mänskliga muskelsjukdomar, såsom internationellt dystrofi, myofibrillar myopatier, muskel degenerativa sjukdomar, actinopatier, etc.24,25,26 ,27, och har gett viktiga insikter om sjukdomsmekanismer och potentiella terapier28,29,30. Således är Drosophila en användbar modell för att ta itu med många öppna frågor i myogenes fältet, inklusive mekanismer för muskel-typ specifik transkription, skarvning, och kromatin reglering, samt till den roll som metabolism i muskelutveckling. Tillämpningen av modern omics-teknik, i synnerhet i kombination med det breda utbudet av genetiska, biokemiska och cellbiologiska analyser som finns i Drosophila, har potential att dramatiskt främja förståelsen av muskel utveckling, åldrande och sjukdom.
Ifms är de största musklerna i farten, som spänner över nästan 1 mm över hela längden av bröstkorgen hos vuxna31,32. Men denna lilla storlek genererar utmaningen att få tillräckligt med prov för att tillämpa omics teknik i Drosophila i ett vävnads-typ specifikt sätt. Dessutom, ifms är en del av den vuxna muskulatur som bildas under Pupp stadier. Myoblasts säkring för att bilda myotubes, som fäster på senor runt 24 h efter puparium formation (APF) och genomgå en Kompaktion steg som krävs för att initiera myofibrillogenes runt 30 h APF (figur 1a-D)18,33, 34.
Den myofibers sedan växa för att spänna över hela längden av bröstkorgen, med myofibriller genomgår en initial tillväxtfas fokuserat på sarcomere tillägg fram till ca 48 h APF, och sedan övergår till en mogning fas, där sarkomeres växa i längd och bredd och är remodeled att etablera stretch-aktivering av 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Uppkomsten av fiber mognad är åtminstone delvis kontrolleras av Salm och E2F32,36,37, och flera IFM-specifika sarcomere protein isoformer vars skarvning styrs av Bru1 införlivas under denna fas16,17. Mogna flugor eclose från 90 – 100 h APF. Detta innebär att för att studera muskelutveckling, IFM måste isoleras med tillräcklig kvantitet, kvalitet och renhet från flera Pupp tidpunkter att underlätta analys med hjälp av omics metoder.
Flera protokoll för IFM dissektion har publicerats. Även om dessa protokoll fungerar bra för deras avsedda tillämpningar, är ingen idealisk för omics metoder. Protokoll som bevarar IFM morfologi för immunofluorescens av Pupp och vuxna ifms19, isolera IFM fibrer för mekanisk utvärdering31, eller utnyttja microdissection av Pupp IFM från kryosections38 är för specialiserade och tid och arbetsintensiva att rimligen få tillräckliga mängder av IFM vävnad för omics applikationer. Andra protokoll har utvecklats för snabb dissektion av specifikt vuxen IFM38,39, alltså inte är tillämpliga på Pupp stadier, och använda buffertar som inte är idealiska eller kan vara oförenliga med, till exempel, RNA-isolering. Därför finns det ett behov av att utveckla nya metoder för att isolera Pupp IFM för biokemi eller omics applikationer.
Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av IFM under Pupp stadier som har använts framgångsrikt för mRNA-SEQ analys från 16 h APF genom vuxna stadier16,32. Protokollet sysselsätter en grön fluorescerande protein (GFP) etikett för att identifiera ifms i alla stadier av Pupp och vuxen utveckling, vilket möjliggör levande dissektion under en fluorescerande dissekera Mikroskop. Metoden är mindre arbetsintensiva, med ett högre dataflöde än befintliga IFM dissektion-protokoll. Detta möjliggör snabb isolering och kryopreservation av prover, genererar tillräckligt med material efter flera omgångar av dissektion för omics metoder samt för standard omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) eller Western blotting.
Vi presenterar protokollet i två delar, visar hur man snabbt dissekera ifms både före 48 h APF (under tidig metamorfos, när IFM bilagor är mer tenuous) och efter 48 h APF (när Pupp Body plan och IFM bilagor är väldefinierade). Vi visar att vi kan isolera högkvalitativa RNA från dissekerade IFMs vid alla tidpunkter och presentera data om olika metoder för att RNA-isolering och omvänd Transkription. Slutligen demonstrerar vi tillämpningen av dissekeringsprotokollet till mRNA-SEQ, masspektrometri och RT-PCR med hjälp av CELF1 homolog Bruno1 som exempel. Vi visar misexpression av sarcomere protein isoformer i proteomik data från Bruno1 Mutant IFM och undersöka Bruno1 reglering av C-terminalen splice händelse av myosin tung kedja (MHC). Dessa resultat illustrerar hur omics data kan ge en djupare förståelse för biologiska fenomen, som komplement till genetiska och biokemiska experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila Flight Muscle är en kraftfull modell för att studera olika processer såsom transkriptionella reglering, alternativa skarvning, metabolism, och mechanobiology, som alla påverkar muskelutveckling och myofibrillogenes. Omics-data, till exempel de som genereras av masspektrometri eller djupsekvensering, kan ge viktiga mekanistiska insikter i dessa biologiska processer. För sådana metoder är det fördelaktigt att analysera vävnadsspecifika prover för att öka både selektivitet och specificitet hos omics fingeravtryck. Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av fluorescerande-märkta flygning muskler från levande puppor att generera höganrikade muskel prover för omics applikationer. Vi beskriver först hur man dissekera flygmuskler vid tidig Pupp stadier (< 48 h efter puparium formation [APF]), när musklerna är urskiljbara av grönt fluorescerande protein (GFP) märkning. Vi beskriver sedan hur man dissekera muskler från sena puppor (> 48 h APF) eller vuxna, när musklerna är distinguishable under en dissekera Mikroskop. Det medföljande video protokollet kommer att göra dessa tekniskt krävande dissektioner mer lättillgängliga för forskarsamhällena i muskler och Drosophila . För RNA-tillämpningar, vi assay kvantitet och kvalitet av RNA som kan isoleras vid olika tidpunkter och med olika metoder. Vi visar vidare att Bruno1 (Bru1) är nödvändigt för en temporal förskjutning i myosin heavy chain (MHC) skarvning, visar att dissekerade muskler kan användas för mRNA-SEQ, masspektrometri, och omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) Program. Denna dissekeringsprotokoll kommer att bidra till att främja vävnads-specifika omics analyser och kan allmänt tillämpas för att studera flera biologiska aspekter av myogenes.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila Flight Muscle är en kraftfull modell för att studera transkriptionell reglering, alternativa skarvning, metabolism och mechanobiologi. Vi presenterar ett protokoll för dissektion av fluorescerande-märkta flygning muskler från levande puppor att generera höganrikade prover idealisk för proteomik och djup-sekvensering. Dessa prover kan erbjuda viktiga mekanistiska insikter i olika aspekter av muskelutveckling.

Dissektion av Drosophila melanogaster flygmuskler för omics närmar sig

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Protokollet underlätta dissekering av GFP-märkt indirekt flygmuskel från Drosophila vid olika tidpunkter under puppor utveckling för att bedöma förändringar i gen och protein uttryck. Med hjälp av dessa tekniker kan ett högberikat flygmuskelprov med minimal RNA-proteinnedbrytning uppnås som är lämplig för RT-PCR, western blot, eller omic-tillvägagångssätt. Dessa specialiserade dissektioner kräver övning och skicklighet, men antalet puppor som kan dissekeras och kvaliteten på proverna förbättras med erfarenhet.Visuell demonstration av denna dissekering är avgörande för att avgöra hur man skiljer flygmuskler från icke-muskelvävnader och underlättar snabb isolering av flygmuskler från pupal exemplar. För att iscensätta puppor, använd en fuktad pensel för att samla in och överföra pre-puppor till en 60 millimeter petriskål, och kön puppor under ett kikärt mikroskop. Hanar identifieras genom förekomst av testikör, som visas som genomskinliga jordklot på de annars ogenomskinliga pupporna.Efter märkning av skålen med tid, datum och genotyp av flugorna, ålder puppor i en 25 till 27 grader Celsius inkubator tills det lämpliga skedet. För IFM dissekering före 48 H APF, använd en fuktad pensel för att överföra lämpligt iscensatt puppor till en svart dissekering skålen ca 2 / 3 fylld med kyld PBS. Under fluorescerande dissekerande mikroskop, använd en 5 tlyckop för att driva en av puppor till botten av den svarta dissekering skålen.Justera mikroskop zoom och fokus tills puppor kan vara tydligt visualiseras. Med hjälp av ett par tåtaningar för att greppa poppens främre, peta pupporna med en enda spets av ett andra par tåten, något off-center i buken, precis bakom bröstkorgen. Använd det första paren av tofter för att ta bort den främre halvan av pupal-fodralet, och för att nypa de exponerade pupporna precis bakom bröstkorgen för att separera buken från bröstkorgen.Därefter försiktigt pressa den främre delen av bröstkorgen för att exponera fluorescerande märkta IFMs. Använd sedan tärnorna för att kasta det återstående kadavret till motsatt sida av skålen och dissekera de efterföljande pupporna på samma sätt. När alla puppor har dissekeras, använd tärna för att samla IFM fibrer, och organisera fibrerna i en hög längst ner på den svarta dissekera skålen.Använd tänjas för att driva något skräp ur synfältet, och ta bort alla icke-IFM muskler, fett, nagelband, eller annan oönskad vävnad från proverna. Använd sedan en klippt pipettspets för att överföra högen av IFM-datorer till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör som innehåller 250 mikroliter av kyld PBS. För IFM-dissektion efter 48 H APF, använd en lätt fuktad pensel för att överföra de iscensatta pupporna på en remsa av dubbelsidig tejp monterad på ett mikroskopglas.Orientera puppor i en linje, ventrala sidan ner, och främre mot botten av bilden. När alla puppor har placerats, använd tuppar för att retas isär och öppna det första pupalfallet ovanför de främre spiraclesna, och försiktigt glida ett par tärpar dorsally, mot den bakre, skära pupal fallet som tärnorna flytta. Befria puppor från det öppnade fallet, och omedelbart överföra puppor till en droppe PBS på en andra mikroskop glida.När alla puppor är befriade, använd fin sax för att skära buken av puppor bort från bröstkorgen, och tryck buken i en separat hög. När alla bröstkorgar har tagits bort, använd en bit av mjukpapper för att ta bort majoriteten av PBS och högen av buken. Tillsätt en droppe färsk, kyld PBS till de återstående bröstkorgarna, innan du använder saxen för att skära från huvudet längs den längsgående kroppsaxeln i en enda rörelse för att dela bröstkorgen på mitten.När alla puppor har dissekerats, använd de 5 tlykorna för att välja en av hemisections, och försiktigt sätta in spetsarna på en tärna ovanför och under mitten av IFMs. Hålla första par trikåer fortfarande, använd fin sax för att skära ena änden av IFM bort från nagelband och senor, innan roterande puppor 180 grader, så att den andra änden av IFM att skäras fri från nagelband och senor. Använd forceps för att överföra IFM-bunten från bröstkorgen till kanten av PBS-bubblan, med hjälp av vattenspänning för att hålla bunten på plats.Tryck sedan kadavret till motsatt sida av bilden och dissekera resten av IFM:erna på samma sätt. När alla IFM har samlats in, använd 5-forceps för att ta bort eventuella hoppmuskel eller nagelbandsfragment som kan ha hittat in i proverna. Använd sedan vattenspänning för att försiktigt fånga de dissekerade IFM:erna mellan ett par tövråkar, och placera IFM:erna i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör som innehåller 250 mikroliter av kyld PBS.mRNA-sekvenseringsdata från BRUNO1 IR IFMs visar förändringar i uttryck på gen-enhetsnivå jämfört med wildtype-sekvenseringsdata. Med hjälp av hela proteom masspektrometri på dissekerade IFM-filer, observeras en liknande förordning vid protein- och proteinisoformnivåerna. Efter införandet av en proteinfällstreck i den slutliga intron av Mhc kan införlivandet av det GFP-märkta proteinet observeras i IFM som två prickar på vardera sidan av M-linjen vid 90 H APF, medan GFP-signalen i benmuskelvävnaden kan observeras enhetligt över sarkomere M-linjen.När du använder RT-PCR på dissekeras IFM, en Mhc isoform switch från GFP-märkta exon 34 till 37 händelse till omärkta exon 34 till 35 händelse, kan detekteras mellan 30 och 48 timmar efter puparium bildas vid 27 grader Celsius. Från mRNA sekvensering data, ben och hoppa muskel vävnader uttrycka alla tre Mhc isoforms, upprätthålla uttryck för den GFP-märkta isoform i mogna muskler. Både Spalt större mutant och BRUNO1 IR-IFM, misslyckades med att stänga av uttryck för GFP-märkta Mhc isoform som de utvecklar, vilket resulterar i en isoform uttrycksprofil som liknar den i benet och hoppa muskelvävnad.Kom ihåg att dissektionerna ska utföras på under 30 minuter för att förhindra RNA-nedbrytning. Och, att ta hand för att begränsa kontaminering av andra celltyper. Denna metod genererar IFM-berikade prover som lämpar sig för biokemiska metoder som RT-PCR, eller västra blotting, samt omic stil metoder, som masspektrometri, hög genomströmning sekvensering, kromatin konformation fånga, och metabolomik.Dessa dissektioner kan komplettera de kraftfulla genetiska tillvägagångssätten i Drosophila med data på systemnivå för att undersöka de grundläggande mekanismerna för utveckling och genreglering.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantifiering av bukpigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet utfodring och hög genomströmning Triacylglyceride test på Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Mäta motion nivåer i Drosophila melanogaster använder den roterande motion kvantifiering systemet (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

Motionsredskap: Intervall träning protokoll för försiktigt inducerad övning i Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo framåt genetisk skärm för att identifiera nya neuroprotektiva gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Användning av Drosophila S2-celler för levande avbildning av cell delning

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

En screeningmetod för identifiering av heterokromatinfrämjande läkemedel med drosofila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...