Name: dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Andreas Ladurner ve Frank Schnorrer'a cömert destekleri için minnettarız. Sandra Esser'e mükemmel teknik yardım için ve Akanksha Roy'a kütle spektrometresi verilerini ürettiği için teşekkür ederiz. Biz sinek sağlamak için Bloomington ve Viyana stok merkezleri kabul ediyoruz. Her ikisi de LMU Biyomedikal Merkezi'nde (Martinsried, DE) kütle spektrometresi örneklerinin analizi için konfokal görüntüleme ve Zentrallabor für Proteinanalytik ile ilgili yardımları için Core Facility Bioimaging'e teşekkür ederiz. Çalışmalarımız Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) ve International Max entegre protein bilimi merkezi (CIPSM) tarafından desteklendi. Planck Araştırma Okulu (EN).

1. Pupa evreleme
<ol><li>Şişelerde istenilen genotipin uçlarını yükseltmek(Şekil 1E). Ya diseksiyon stok taze bir flip yapmak ya da en az 20 kadın bakire sinekler ile bir haç ayarlayın. Sinekler pupate başlayana kadar şişe leri koruyun.</li>
	<li>Isledilmiş bir fırça ile pre-pupa toplayın ve 60 mm Petri kabında ıslak filtre kağıdına aktarın(Şekil 1F).</li>
	<li>Seks pupa, deney için uygun cinsiyet toplama (Şekil 1G). Erkekler, aksi takdirde opak pupa yarı saydam topları olarak görünür testisler, varlığı ile tanımlanır.</li>
	<li>Petri kabını saat, tarih ve genotip ile etiketleyin, ardından pupayı istenilen aşamaya kadar yaşlayın(Şekil 1H). NOT: Daha yüksek sıcaklıklarda artan Gal4 aktivitesi devir verimi40artırdığı için, haçları/stokları ve yaş pupalarını sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesinde muhafaza edin (örneğin, RNAi haçlar için 25 °C veya 27 °C). Birkaç gün yaşlanırken pupaların kurumaması için nem oranının yeterince yüksek olduğundan emin olun.</li>
</ol>2. IFM Diseksiyon Önce 48 h APF
<ol><li>İki #5 biyoloji sınıf forsepsi, pipet, pipet uçları, kuru buz ve (RNA örnekleri için) izolasyon reaktifi dahil olmak üzere gerekli ekipmanı bir araya getirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Buna ek olarak, soğuk siyah diseksiyon yemekleri (Malzeme Tablosubakınız), 1x fosfat-tamponlu salin (PBS) tampon, ve buz üzerinde 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri.</li>
	<li>Islak bir fırça kullanarak, sahnelenmiş pupayı soğuk 1x PBS ile yaklaşık üçte ikisi dolu siyah bir kesişen tabağa aktarın(Şekil 2A,B). Floresan diseksiyon mikroskobuna geçin. NOT: 30 dk'lık bir zaman dilimi içinde kesilebildiği kadar pupa kullanın. Deneyime bağlı olarak, bu 3-15 pupa arasında değişmektedir. Siyah diseksiyon yemekleri alternatifleri tartışmak için Ek Yöntemler bakın.</li>
	<li>#5 forceps kullanarak, siyah bir diseksiyon çanak altına pupa birini itin ve açıkça pupa görmek için mikroskop zoom ve odak ayarlayın(Şekil 2C).</li>
	<li>Bir forceps ile pupa ön kavramak(Şekil 2D),sonra diğer forceps tek bir ucu ile pupa dürtmek biraz karın içinde merkezi kapalı, toraks hemen arkasında. Bu, pupayı yerinde tutar ve IFM'lerin karın içine girmesini önler(Şekil 2E). NOT: Pupal bütünlüğü bozulur bozulmaz, bu noktadan itibaren diseksiyon uzunluğunu zamanlamaya başlayın. Kas ölümünü ve buna bağlı transkripsiyon ve proteomik değişiklikleri en aza indirmek için tanımlanmış bir diseksiyon uzunluğu (örneğin 20-30 dakika) kullanın. Bu süre içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinek inceleyin.</li>
	<li>İlk çömleçleri kullanarak, pupal kılıfın ön yarısını çıkarın (Şekil 2F).</li>
	<li>Thorax'ın hemen arkasında maruz kalan pupayı çimdiklemek ve karnı torakstan ayırmak için aynı çömetüleri kullanın (Şekil 2G).</li>
	<li>Forsepsleri kullanarak, toraksın ön kısmını hafifçe sıkın (<35 h APF için) veya floresan olarak etiketlenmiş IFM'leri ortaya çıkarmak için toraksı açın (Şekil 2H). IFM'ler epidermisten kolayca uzaklaşacaktır, çünkü erken zaman noktalarındaki tendon ekleri kırılgandır. Kalan karkas çanak karşı tarafına itmek için forceps kullanarak atın.</li>
	<li>Yinelenen adımları 2.3-2.7, ek pupa incelemek.</li>
	<li>IFM liflerini forceps ile toplayın ve siyah kesme kabının altındaki bir yığın halinde düzenleyin(Şekil 2I,J). Forceps kullanarak görüş alanı dışına iterek herhangi bir enkaz kaldırın. NOT: Uygulama ile, forceps ipuçları birbirine dokunmadan yakın bir yakına getirilebilir. Bu teknik gevşek onları yok etmeden IFMs kapmak için kullanılabilir. Alternatif yöntemler, IFM'leri tek bir ucu veya tamamen kapalı forsepsle hafifçe itme veya kaldırmayı veya IFM ile yağ veya başka bir doku almayı ve 2.10 adımda açıklandığı gibi yağın çıkarılmasını içerir.</li>
	<li>IFM olmayan kasları, yağ, miğfiz, vb. çıkarmak için çerkesleri kullanarak IFM kas örneğini kalite kontrolü(Şekil 2K,L). NOT: Mef2-Gal4 ile IFM, floresan yoğunluğu na ve kas şekline göre atlama kası ve larva kaslarının çıkarılmasına olanak sağlayan erken zaman noktalarındaki diğer kas tiplerine göre daha güçlü bir şekilde etiketlenir (Şekil 2K,K' Yağ ve miğfer dokusu farklı görünür ve kasa özgü floresan etiketi ile etiketlenmez (Şekil 2K,K'). IFM etiketini alan diğer Gal4 satırlarının tartışma bölümüne bakın.</li>
	<li>Kırpılmış pipet ucu kullanarak IFM yığınını 250 μL soğutulmuş 1x PBS(Şekil 2M-O)ile dolu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Hemen bölüm 4'e gidin. NOT: IFM örnekleri sadece pipet ucunun yan tarafına yapışarak kaybedilebilir. IFM'leri toplamadan önce tamponu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme standart ipuçlarını daha az yapışkan hale getirebilir ve silikonlu veya perfluoroalkoxy (PFA) uçları (Bkz. Malzeme Tablosu)ile daha düşük yüzey gerilimleri numune kaybını önlemeye yardımcı olabilir.</li>
</ol>3. IFM Diseksiyon 48 h APF sonra
<ol><li>İki #5 biyoloji sınıf forseps, ince makas, standart cam mikroskop slaytlar, çift sopa bant, pipet, pipet uçları, kuru buz ve (RNA uygulamaları için) izolasyon reaktifi dahil olmak üzere gerekli ekipmanları bir araya getirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Buz üzerinde 1x PBS ve mikrosantrifüj tüpler chill.</li>
	<li>Hafifçe ıslak bir fırça kullanarak, sahnelenen pupayı mikroskop kaydıranınüzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bantşeridine aktarın(Şekil 3A). Pupayı aynı yönde (ventral aşağı ve ön salığın altına doğru) yönlendirilmiş bir çizgiye yerleştirin. NOT: Boya fırçası veya filtre üzerinde çok fazla su kullanmamaya dikkat edin, yoksa pupa iyi yapışmaz. Pupa yapışmaz, ilk kuru filtre veya doku kağıt aktararak kuru. 30 dk'lık bir zaman dilimi içinde, ideal olarak ~10 pupa olarak birçok pupa monte edilebildiği gibi.</li>
	<li>Pupal kılıfından pupa çıkarın. Ayrı kızdırmak ve ön spiracles üzerinde pupal durumda açmak için forceps kullanın(Şekil 3B).</li>
	<li>Bir çift forceps'ü arka ya doğru yavaşça kaydırArak, püreler hareket ettikçe pupal kılıfı keserek(Şekil 3B'). Altta yatan pupa yırtılmamaya dikkat edin. Pupayı açılan kasadan kurtarın ve hemen ikinci bir mikroskop slaytında 1x PBS'ye aktarın(Şekil 3B",C).</li>
	<li>Satırdaki tüm pupalar için 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın, ardından çift yapışkanlı bant kaydırasını bir kenara koyun.</li>
	<li>İnce makas kullanarak, pupanın karnını torakstan kesip ayrı bir yığına itin(Şekil 3D,D'). Kalan pupa için tekrarlayın. NOT: Pupal bütünlüğü bozulur bozulmaz, 3.6 adımla diseksiyon un uzunluğunu zamanlamaya başlayın. Hücre ölümünü ve buna bağlı transkripsiyonve proteomik değişiklikleri önlemek için 20-30 dakika içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinek inceleyin. 1 d yetişkin veya >90 h pupa diseksiyon yaparken, daha sonraki adımların başını ince makasla çıkarmak genellikle uygundur.</li>
	<li>Bir kağıt parçası kullanarak, 1x PBS çoğunluğu kaldırmak (genellikle askıda yağ ile bulutlu) yanı sıra karın yığını(Şekil 3E). Kalan torakslar taze, soğutulmuş 1x PBS bir damla ekleyin.</li>
	<li>Tek bir hareketle uzunlamasına vücut ekseninden aşağı yaslayarak toraksı ikiye(Şekil 3F,F') kesmek için makası kullanın. Alternatif olarak, kafa çıkarılmışsa, önce başın bağlı olduğu makası takın ve IFM'ler arasında toraksın üst yarısını uzunlamasına kesin. Sonra, aynı yönde ikinci bir kesim ile toraks ventral tarafı kesti.</li>
	<li>Tüm pupaların kesilmesi için 3.7 ve 3.8 adımlarını tekrarlayın ve kaydıraktan merkezine yakın toraks hemisleri yığını oluşturur. Hemisections kurumasın böylece slayt üzerinde yeterli soğutulmuş 1x PBS olduğundan emin olun. NOT: 48 saat APF'den sonra IFM'ler, eğitimli göze standart bir kesme mikroskobu altında görülebilecek kadar büyüktür. Protokolün bu noktasında, floresan etiketli kaslar IFM tanımlamasına veya eğitim amaçlarına yardımcı olmak için floresan diseksiyon kapsamına taşınabilir, ancak bu gerekli değildir.</li>
	<li>IFM'leri göğüs kafesinde niçin parçalara ayırın. #5 forceps kullanarak hemikesitlerden birini izole edin (Şekil 3G,H). IFM'lerin ortasına ve altına bir çözgünün uçlarını yavaşça yerleştirin (Şekil 3G',H'). İlk çifenleri hareketsiz tutarken, IFM'nin bir ucunu mite ve tendondan kesmek için ince makas kullanın. Daha sonra IFM'in diğer ucunu kesip teptiz edin (Şekil 3G'',H''). NOT: İlk IFM kesildikten sonra toraksın oryantasyonuna bağlı olarak, ikinci IFM kesiminin daha kolay olması için toraks180° döndürmek yararlıdır.</li>
	<li>IFM demetini torakstan forceplarla çıkarın (Şekil 3G''',H'''), su gerilimini yerinde tutmak için PBS kabarcığının kenarına aktarır (Şekil 3I). Karkas'ı kaydıranın karşı tarafına doğru itin. Kalan toraks hemisleri için tekrarlayın, diseksiyon lu IFM'ler koleksiyonu oluşturur. NOT: IFM'ler düzgün bir yığında kalmazsa, 1x PBS'nin bir kısmını bir dokuyla çıkarın. Tüm PBS'nin buharlaşmasına izin vermemeye ve parçalanmış IFM'lerin ve hemithoraxe'lerin tampon la kaplı kalmasını sağlamaya dikkat edin.</li>
	<li>Tüm IFM'leri inceledikten sonra, incelenmiş kas üzerinde hızlı bir kalite kontrolü yapın. #5 forceps kullanarak, örnek içine kendi yolunu bulmuş olabilir herhangi bir atlama kas veya mitirkül parçaları kaldırmak(Şekil 3J-K''). NOT: Atlama kası IFM'den farklı görünür. Floresan altında Mef2-Gal4 etiketli kas diseksiyon varsa, atlama kas zayıf bir floresan ve farklı bir şekil ve doku vardır. Normal ışık altında, IFM'ler opak, sütlü sarı iken neredeyse yarı saydam görünür(Şekil 3J-J'',K).</li>
	<li>Su gerilimi kullanarak, bir çift forceps(Şekil 3L)arasında parçalanmış IFM'leri yakalayın (ancak ezmeyin). IFM'leri önceden 250 μL soğutulmuş 1x PBS(Şekil 3M)ile doldurulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Bölüm 4 ile hemen devam edin. NOT: Forseps uçları birbirine yakın bir yere getirildiğinde ve bir tampon çözeltisi dışına kaldırıldığında, su gerilimi forseps uçları arasında bir tampon kabarcığı yakalanmasına neden olur. IFM'ler de bu baloncukta mevcutsa, çözeltiden çıkarılabilir ve kolayca başka bir tampon dolu hazneye aktarılabilir. Tampon baloncuktan yakalanan dokunun bükülmesini önlemek için, uçları birbirine dokunmadan birbirine yaklaştırmak için püreleri sıkmak önemlidir.</li>
</ol>4. Pelet ve IFM Örneğini Koruyun
<ol><li>1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü 3-5 dk 2.000 x g'de bir masa üstü santrifüjde santrifüj ederek IFM'leri peletleyin(Şekil 4A,B).</li>
	<li>Pipet ucu(Şekil 4C) kullanarak arabelleğiçıkarın.
</li>
	<li>RNA uygulamaları için, IFM peletini istenilen RNA izolasyon tamponunun 50-100 μL'inde yeniden askıya alın (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 4D). Aksi takdirde, adım 4.4'e geçin. NOT: IFM'ler kütle spektrometresi preparatları veya RNA'nın ticari kitlerle izole edilmesi için 4.2. RNA uygulamaları için, IFM peletinin izolasyon tamponu içinde derhal yeniden dondurulması ve dondurulması ile daha iyi sonuçlar elde edilir.</li>
	<li>Numuneyi kuru buzda dondurma veya sıvı nitrojende çabuk dondurma(Şekil 4E). -80 °C'de, aşağı akım analizi için numune hazırlığıiçin sonraki adımlara hazır olana kadar saklayın. NOT: Kriyopreservation sonra, örnekler downstream soruşturma için işleme önce birkaç ay saklanabilir.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, Drosophila IFM'leri erken ve geç evre pupalardan protein, DNA, RNA veya diğer makromoleküllerin aşağı izole edilmesi için incelemek için temel tekniği sıyoruz. Protokol, YETIŞKIN sineklerden IFM'i incelemek için kolayca uyarlanabilir. MRNA-Seq, proteomik ve RT-PCR uygulamaları için diseksiyon protokolümüzün yardımcı programını gösteriyoruz. Daha az başlangıç malzemesi ve daha düşük girdi konsantrasyonlarına sahip numunelerin analizine olanak sağlayacak omik teknolojilerinsürekli iyileştirilmesi ile bu diseksiyonlar büyük olasılıkla birçok ek uygulama için değerli hale gelecektir. IFM'ler insan miyopatileri için kurulmuş bir model olduğundan4,24 ve kas tipi spesifik gelişim9,12, örneğin, IFM ile zenginleştirilmiş metabolomikler, kromatin konformasyonu araştırmaları 3C veya 4C ile, CLiP etkileşimleri veya miofibrillogenez fosfo-proteomik yoluyla ağ değerlendirmesi birleştirme.
Bu diseksiyonlarsaf ifm numunesi yerine IFM için zenginleştirilmiş bir numune ürettiği göz önünde bulundurulması önemlidir. Bu motor nöron innervasyonu nedeniyle kaçınılmazdır, tendon ekleri ve kas liflerinin trakeal invazyonu. Biyoinformatik analizi IFM zenginleştirilmiş gen veya proteinleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak daha fazla deney aslında IFM özgü olduğunu göstermek için gereklidir. Örnek saflık Stripe45 (tendon), Act79B4,44 (tübüler kas), Act88F15 (IFM) veya syb46 (nöronal spesifik) gibi yayınlanmış dokuya özgü belirteçler kullanılarak test edilebilir. Veri kümelerini IFM'ye özgü içeriğe normalleştirmek için bu tür belirteçleri kullanmak mümkün olabilir, ancak kullanıcılar, normalleşme için kullanılan genlerin ekspresyonundaki zamansal değişikliklerin , örneğin IFM'ye özgü genler veya tubulin gibi, böyle bir yaklaşımı saptırabileceği konusunda uyarılır.
Genetik olarak kodlanmış dokuya özgü etiketleme yöntemleri, örneğin EC etiketleme47,48 veya PABP etiketleme49,RNA izole etmek için50 son yıllarda geliştirilmiştir, hangi gerçekten elde yardımcı olabilir dokuya özgü RNA örneği. Ancak, EC-etiketlemesinekler sürekli besleme gerektirir 47 ve bu nedenle pupal aşamalarında geçerli değildir. PABP etiketli transkripsiyonların duyarlılığı ve bütünlüğü51sınırlaması olabilir. Bireysel kas liflerini izole etmek için FACS yaklaşımları IFM'lerin büyük boyutu ve sinital doğası ile karmaşık. INTACT52,53 tarzı yaklaşımlar IFM'lerden belirli hücre altı bölmeleri izole etmek için uygulanabilir, ifm çekirdekleri veya mitokondri saf popülasyonları izole etmek için yararlı olabilir. Manuel diseksiyonlar, çoğu aşağı uygulama için sağlam IFM dokusu elde etmek için hala geçerli standarttır.
Numune kalitesi, diseksiyon işlemindeki birkaç kritik adıma bağlıdır. Diseksiyonlar teknik olarak zorludur, diseksiyon hızı ve numune saflığı deneyimle artmaktadır. Deterjansız soğutulmuş tamponda kısa süreler (20-30 dk) diseksiyon ve hemen donma, fare tendon izolasyonu için daha önce de görüldüğü gibi numune bütünlüğünükorumaya yardımcı olur54. IFM'ler peletteki tüm arabelleği çıkardıktan sonra başarılı bir şekilde kurumaya biçilebilir, ancak özellikle RNA izolasyonu için, izolasyon arabelleğindeki dondurucu numuneler daha iyi sonuçlar verme eğilimindedir. 20 ayrı diseksiyondan ifm'ler RNA veya protein izolasyonundan önce birleştirilir, bu da ölçeklendirmeye ve yeterli malzemenin toplanmasına izin verir, hatta erken zaman noktalarından veya mutantlardan16,32, downstream analizi için.
RNA uygulamaları için en kritik adım RNA'nın kendisinin yalıtımı olabilir. Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform izolasyon (yukarıdaki yöntem 1) en ticari kitleri test daha iyi performans ve, daha önce belirtildiği gibi, önemli ölçüde daha az pahalı55. Ticari kitleri ile RNA izolasyon verimleri gözlenen değişkenlik önceki gözlemler ilerle aynı fikirde56,57. Biz daha fazla tüm RNA kurtarmak için izopropanol yağış sırasında glikojen ekleyin. RNA veriminin ötesinde, numunenin diseksiyon ve izolasyon işlemleri sırasında parçalanmadığından veya bozulmadığından emin olmak için RNA bütünlüğünü doğrulamak önemlidir. Ayrıca RNase-free çalışmak esastır. Son olarak, RT-kit seçimi ters transkripsiyon sürecinin hassasiyetini etkileyebilir. Sık sık ayrıntılı olarak tartışılmamakla birlikte, tüm bu noktalar IFM örneğinin kalitesini ve akış aşağı uygulamalarından elde edilen verileri etkiler.
Birçok önemli değişiklik protokolü mevcut IFM diseksiyon protokollerinden ayırıyor. IFM immünoresans için ayrıntılı bir diseksiyon protokolü19mevcut olmasına rağmen, bu protokol IFM dokusunun daha hızlı izolasyonsağlayan pupal diseksiyonlar için farklı bir yaklaşım sunar. Bu proteom veya transkripsiyon değişiklikleri önlemek için sınırlı diseksiyon süreleri ile IFM doku (nispeten konuşma) büyük miktarlarda toplanması sağlar. Diğer protokoller bireysel miyofibrils39 GFP boyama görselleştirmek için yetişkin IFM diseksiyon veya larva vücut duvarı kasları nın boyanması için58, ama pupal aşamalarında diseksiyon adresi veya RNA veya protein izolasyonu için. Bu yaklaşım aynı zamanda pupal IFM'lerin kriyos38'den mikrodisseksi için mevcut protokolden farklıdır , bu daha saf bir IFM örneği oluşturabilir, ancak daha fazla emek yoğundur ve daha az malzeme üretir. Diğer hızlı yetişkin IFM diseksiyon protokolleri ile karşılaştırıldığında38,39, IFM'ler stres indüksiyonve diğer önemli ifade değişiklikleri sınırlamak için deterjan olmadan PBS tampon izole edilir.
Bu protokoldeki en önemli ilerleme, ifm'lerin erken pupal aşamalarında izole edilmesine olanak sağlayan canlı, floresan bir muhabirin dahil edilmesidir. Biz standart olarak Mef2-GAL459 sürüş ya UAS-CD8:::GFP veya UAS-GFP::Gma60kullanın. Bu, IFM'nin diferansiyel etiketlemesini (uçuş kasları diğer pupal kaslara göre daha güçlü bir şekilde etiketlenmiş ve farklı biçimlidir) ve örneğin kurtarma veya RNAi deneyleri gibi GAL4-UAS tabanlı manipülasyonların performansına olanak tanır. RNAi ile ilişkili erken öldürücülüğü önlemek için mef2-GAL4'ü küvet-GAL80ts ile veya RNAi verimliliğini40artırmak için UAS-Dcr2 ile birleştirmek de mümkündür.
Ek GAL4 sürücüleri veya GFP-hatları kas tipi özgüllük, zamansal ifade deseni değişir ve sürücü gücü19,61 yerine Mef2-GAL4 kullanılabilir kullanılabilir. Örneğin, Act88F-GAL4 ilk olarak 24 saat APF civarında ifade edilir, bu nedenle önceki zaman dilimleri için kullanılamaz; ancak IFM'yi güçlü bir şekilde etiketler ve RNAi ile ilişkili erken öldürücülüğü önlemek yararlı olabilir. Onu-GFP veya Act88F-GFP etiket IFM, yine zamansal kısıtlamalar ile, ama marker ifade GAL4 bağımlılığı önlemek ve ilgi bir mutant arka plan ile birlikte yararlı olabilir. Diğer olası işaret satırlarının listeleri mevcuttur19. Ayrıca transgenlerin ve GAL4/UAS sisteminin kullanımının gen ekspresyonu eserlerine neden olabileceği de unutulmamalıdır, bu nedenle uygun kontrollerin kullanılması önemlidir, örneğin sürücü çizgisi vahşi tip arka plan gerilimine geçilir, böylece bu tür yapılar muhtemelen tüm örneklerde aynı.
Eşlik eden video ile, Bu ayrıntılı protokol pupal IFM diseksiyonu daha erişilebilir hale getirmek ve kas gelişimi çalışma omik yaklaşımların kullanımını teşvik amaçlamaktadır. Drosophila genetiğinin ve hücre biyolojisinin gücünü, parçalanmış IFM ile erişilebilen biyokimya ve omik tahlillerle biriktirmek miyogenez ve kas fonksiyonunun mekanistik anlayışını ilerletme potansiyeline sahiptir. Transkripsiyon ve proteom regülasyonunun sistem düzeyindeki gözlemlerini metabolik ve fonksiyonel çıktılara bağlayan gelecekteki çalışmalar, kas tipi spesifik gelişim ve kas bozukluklarının patogenezi hakkında daha derin bir anlayış sağlayacaktır.

Modern omics teknolojileri kas gelişimi ve insan kas bozuklukları nın altında yatan mekanizmalar hakkında önemli bilgiler sağlar. Örneğin, hayvan modellerinde genetik ve biyokimyasal doğrulama ile birlikte transkripsiyon verilerinin analizi, rbm20 birleştirme faktörü kaybının 30'dan fazla sarcomere hedef ağı düzenlemesi nedeniyle dilate kardiyomiyopatiye neden olduğunu ortaya koymuştur. daha önce kalp hastalığı ile ilişkili genler, titindahil 1,2,3.
İkinci bir örnekte, hücre kültürü, hayvan modelleri ve insan hastalardan yapılan çalışmalar, kas körünün (MBNL) ve CELF14,5'inyükseltisini nedeniyle RNA regülasyonunda bir bozulmadan miyotonik distrofi olduğunu göstermiştir. MBNL ve CELF1 arasındaki çapraz düzenleyici ve zamansal dinamikler (CUGBP1 veya Bruno Benzeri 2 olarak da adlandırılır) miyotonik distrofi hastalarında kalıcı embriyonik birleştirme paternlerini açıklamaya yardımcı olur. Ayrıca, yanlış düzenlenmiş hedeflerin büyük ağ hastalığın karmaşık doğasını açıklamak için yardımcı olur4,6,7,8. Bu çalışmaların çoğu insan kas hastalığının altında yatan mekanizmaları anlamak için genetik model organizmalarda omik yaklaşımlar kullanır. Ayrıca, hastalıklı veya yaşlanan kas değişiklikleri anlamak için sağlıklı kas temporal ve doku tipi özel gen ekspresyonu, protein modifikasyonu ve metabolik desenler ilk anlamanın önemini vurgulamak.
Drosophila melanogaster başka köklü genetik model organizmadır. Sarcomere yapısı yanı sıra bireysel sarcomere bileşenleri yüksek omurgalılar4,9,10sinekler korunmuş ve dolaylı uçuş kasları (IFM) çalışma için güçlü bir model haline gelmiştir kas gelişiminin birden fazla yönü11,12. İlk olarak, fibriller uçuş kasları fonksiyonel ve morfolojik olarak tübüler vücut kaslarından farklıdır11,13, kas tipi spesifik gelişimsel mekanizmaların araştırılmasına izin. Spalt majör (Salm)14,Ekstradentisle (Exd) ve Homotoraks (Hth)15 gibi transkripsiyon faktörleri fibriller kader düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır. Ayrıca, Salm downstream, CELF1 homolog Bruno1 (Bru1, Aret) bir fibrillar özgü yapıştırma programı16,17yönlendirir.
İkinci olarak, IFM'ler miyoblast füzyonu ve miyotube eki miofibrillogenez ve sarcomere olgunlaşma9,18,19miyobez kendisi sürecini anlamak için önemli bir modeldir. Üçüncü olarak, Drosophila genetik bireysel proteinler, protein etki alanları ve protein izoformlar sarcomere oluşumu, fonksiyon ve biyofiziksel özellikleri20,21,22 katkıları nın araştırılmasına izin verir ,23. Son olarak, IFM modelleri miyotonik distrofi, miyofibriller miyopatiler, kas dejeneratif bozuklukları, aktinopatiler, vb24,25,26 gibi birden fazla insan kas bozuklukları, çalışma için geliştirilmiştir ,27, ve hastalık mekanizmaları ve potansiyel tedaviler28,29,30 içine önemli bilgilersağlamıştır. Böylece, Drosophila kas tipi spesifik transkripsiyon mekanizmaları da dahil olmak üzere miyogenez alanında birçok açık soruları ele almak için yararlı bir modeldir, splicing, ve kromatin düzenleme, kas gelişiminde metabolizmarolü gibi. Modern omics teknolojilerinin uygulanması, drosophilamevcut genetik, biyokimyasal ve hücre biyolojik tahliller geniş bir yelpazede özellikle birlikte , önemli ölçüde kas anlayışını ilerletmek için potansiyele sahiptir gelişme, yaşlanma ve hastalık.
IFM'ler sinekteki en büyük kaslardır, yetişkinlerde toraksın tüm uzunluğu boyunca yaklaşık 1 mm'ye yayılan31,32. Ancak, bu küçük boyut doku tipi özel bir şekilde Drosophila omics teknolojileri uygulamak için yeterli örnek elde etme zorluğu oluşturur. Ayrıca, IFM'ler pupal evrelerinde oluşan erişkin kasların bir parçasıdır. Miyoblastlar, puparium oluşumundan (APF) sonra 24 saat civarında tendlere bağlanan ve 30 h APF(Şekil 1A-D)18,33civarında miyofibrillogenezi başlatmak için gerekli bir sıkıştırma adımından geçilen miyotüpler oluşturmak için birleşirler, 34'e kadar.
Miyofiberler daha sonra toraksın tüm uzunluğuna kadar uzanır, miyofibriller yaklaşık 48 saat APF'ye kadar sarcomere ilavesine odaklanmış bir başlangıç büyüme evresinden geçer ve daha sonra sarcomerelerin uzunluk ve genişlikte uzadığı bir olgunlaşma aşamasına geçerler ve 72 h APF (Şekil 1A-D)32,35tarafından streç aktivasyon kurmak için remodeled . Lif olgunlaşmabaşlangıcı en azından kısmen Salm ve E2F32,36,37tarafından kontrol edilir ve birden fazla IFM özgü sarcomere protein izoformları olan birleştirme Bru1 tarafından kontrol edilir bu sırasında dahil edilir faz16,17. Olgun uçar 90-100 h APF eclose. Bu kas gelişimi çalışma için, IFM yeterli miktarda izole edilmesi gerektiği anlamına gelir, kalite, ve birden fazla pupal zaman noktalarından saflık omik yaklaşımlar kullanarak analizi kolaylaştırmak için.
IFM diseksiyonu için çeşitli protokoller yayınlanmıştır. Bu protokoller amaçlanan uygulamalar için iyi çalışır, ancak hiçbiri omics yaklaşımlar için idealdir. Pupal ve erişkin IFM'lerin immünorfülolojisi için IFM morfolojisini koruyan protokoller19, mekanik değerlendirme için IFM liflerini izole31, veya kriyokesilerden pupal IFM mikrodisyonu kullanan38 çok özel ve zaman ve omik uygulamaları için yeterli miktarda IFM dokusu elde etmek için emek yoğun. Diğer protokoller özellikle yetişkin IFM38hızlı diseksiyon için geliştirilmiştir,39, bu nedenle pupal aşamaları için geçerli değildir, ve ideal olmayan veya uyumsuz olabilir tamponlar kullanın, örneğin, RNA izolasyon. Bu nedenle, biyokimya veya omik uygulamaları için pupal IFM izole etmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Burada 16 h APF'den yetişkin evrelerine kadar mRNA-Seq analizinde başarıyla kullanılan pupal evrelerinde IFM diseksiyonu için bir protokol salıyoruz16,32. Protokol, pupal ve yetişkin gelişiminin tüm aşamalarında IFM'leri tanımlamak için yeşil floresan protein (GFP) etiketi kullanır ve floresan diseksiyon mikroskobu altında canlı diseksiyonun alabını sağlar. Bu yaklaşım, mevcut IFM diseksiyon protokollerinden daha yüksek bir iş gücüyle daha az emek yoğundur. Bu, numunelerin hızlı izolasyonve kriyopreservation sağlar, omics yaklaşımlar yanı sıra standart ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için birkaç tur diseksiyon sonra yeterli malzeme üreten (RT-PCR) veya batı lekeleme.
Protokolü, 48 saat APF'den önce (IFM ekleri daha ince olduğunda) ve 48 saat APF'den sonra (pupal vücut planı ve IFM ekleri iyi tanımlandığında) ifmlerin nasıl hızla kesiştiğini gösteren iki bölümhalinde sıyoruz. Yüksek kaliteli RNA'yı tüm zaman noktalarında parçalanmış IFM'lerden izole edebileceğimizi ve RNA yalıtımı ve ters transkripsiyona yönelik farklı yaklaşımlar hakkında veri sunabileceğimizi gösteriyoruz. Son olarak, celf1 homolog Bruno1'i kullanarak mRNA-Seq, kütle spektrometresi ve RT-PCR'ye diseksiyon protokolünün uygulanmasını örnek olarak gösteriyoruz. Biz Bruno1 mutant IFM proteomics verilerinde sarcomere protein izoformlarının yanlış ekspresyonu göstermek ve Myosin ağır zincir C-terminal splice olay Bruno1 düzenleme incelemek(Mhc). Bu sonuçlar, omik verilerin genetik ve biyokimyasal deneyleri tamamlayarak biyolojik fenomenlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını nasıl sağlayabileceğini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1552px;" width="1550">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">5x High Fidelity (HF) buffer</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:175px;">F518L</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">60 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z643084-600EA</td>
			<td style="width:607px;">Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black dissecting dish (glass)</td>
			<td>Augusta Laborbedarf</td>
			<td>42021010</td>
			<td style="width:607px;">Lymphbecken, black glass, 4x4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9157</td>
			<td style="width:607px;">Also available from most pharmacies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">black silicon dissecting dishes: Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td style="width:607px;">Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">blue pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359947-100EA</td>
			<td style="width:607px;">Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">cell phone camera, Samsung Galaxy S9</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SM-G960F/DS</td>
			<td style="width:607px;">used for photos not taken under a microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:175px;">A3691,0500</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Leica SP8X upright confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.zeiss.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">double stick tape</td>
			<td>Scotch/3M</td>
			<td>3M ID 70005108587</td>
			<td style="width:607px;">Double-sided tape, available at most office supply handlers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:607px;">Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">EtOH (100%, RNase free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.leica-microsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M2]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Bru1[M3]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; This paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: Mef2-GAL4</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:27390</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[1]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3274</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: salm[FRT]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-Bru1IR</td>
			<td>Vienna Drosophila Research Center</td>
			<td>GD41568</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock, RNAi hairpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-GFP::Gma</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:31776</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: UAS-mCD8a::GFP</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC:5130</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: w[1118]</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td style="width:607px;">Fly stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Fly: weeP26</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">GFP detection reagent, GFP-Booster</td>
			<td>ChromoTek</td>
			<td>gba488-100</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">image processing software, Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.adobe.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td style="width:607px;">2-propanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 1 (RNA isolation): TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td style="width:607px;">Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">AM1907</td>
			<td style="width:607px;">TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:516px;">Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td>
			<td style="width:255px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:175px;">R2070S</td>
			<td style="width:607px;">RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">74134</td>
			<td style="width:607px;">We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td>
			<td style="width:255px;">Promega</td>
			<td style="width:175px;">Z6110</td>
			<td>We applied the protocol for &#8216;Purification of RNA from Fibrous Tissues&#8217;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">T2010G</td>
			<td>We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &#956;L of RNA Protection Reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM12400</td>
			<td style="width:607px;">RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12342108</td>
			<td style="width:607px;">Standard slides, uncharged, 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">microtome blades</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td style="width:607px;">C35 feather 80mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2004-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Monarch DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T2005-21</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16210072</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">OneTaq Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0480X</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paintbrush</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>1910000000</td>
			<td style="width:607px;">Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">PBS buffer (1x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td style="width:607px;">Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">PFA PureTip Pipette Tips</td>
			<td>Elemental Scientific</td>
			<td>ES-7000-0101</td>
			<td style="width:607px;">Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F-530XL</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5161</td>
			<td style="width:607px;">Universal 200 mL pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Preomics iST 8x Kit</td>
			<td>Preomics</td>
			<td>P.O.00001</td>
			<td style="width:607px;">peptide preparation kit for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:516px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>725500</td>
			<td style="width:607px;">mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Qubit RNA Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32855</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">rhodamine-phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>10063052</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 1 &#38; RNA integrity traces, Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 2, Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNA Pico Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7937</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td style="width:607px;">DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:175px;">18080-044</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #2: LunaScript</td>
			<td style="width:255px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">E3010S</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:255px;">Qiagen</td>
			<td style="width:175px;">205410</td>
			<td style="width:607px;">reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">slide mounting buffer, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td style="width:607px;">containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td style="width:607px;">www.graphpad.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">statistical software: Microscoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Purchased as part of the bundle: Office Home &#38; Student 2019</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000760</td>
			<td style="width:607px;">Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">tissue/ Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td style="width:607px;">Standard tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Transfer pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td style="width:607px;">Plastic pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td style="width:607px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:516px;">Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:607px;">3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:516px;">Whatman paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004-070</td>
			<td style="width:607px;">Filter paper circles, Grade 4, 70 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches

Drosophila uçuş kası transkripsiyonel düzenleme, alternatif birleştirme, metabolizma ve mekanobiyoloji gibi çeşitli süreçleri incelemek için güçlü bir modeldir, tüm etkisi kas gelişimi ve miofibrillogenesis. Kütle spektrometresi veya derin sıralama ile üretilenler gibi Omics verileri, bu biyolojik süreçlere önemli mekanik bilgiler sağlayabilir. Bu tür yaklaşımlar için, omik parmak izlerinin hem seçiciliğini hem de özgüllüğünü artırmak için dokuya özgü numunelerin analiz inde faydalıdır. Burada canlı pupa dan floresan etiketli uçuş kası diseksiyon uiçin bir protokol sunmak omik uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş kas örnekleri oluşturmak için. İlk olarak erken pupal evrelerde uçuş kaslarının nasıl diseksiyon unu (<48 h sonra puparium oluşumu [APF]), kaslar yeşil floresan protein (GFP) etiketleme ile ayırt edilebilir olduğunda açıklar. Daha sonra geç pupa (>48 h APF) veya yetişkinlerden kasların nasıl kesiştiğini, kasların bir diseksiyon mikroskobu altında ayırt edilebilir olduğunu açıklarız. Eşlik eden video protokolü bu teknik olarak talep edilen diseksiyonları kas ve Drosophila araştırma toplulukları için daha yaygın olarak erişilebilir hale getirecektir. RNA uygulamaları için, farklı zaman noktalarında ve farklı yaklaşımlarla izole edilebilen RNA'nın miktarını ve kalitesini tarıyoruz. Ayrıca Bruno1 (Bru1) miyozin ağır zincir(Mhc)birleştirme bir zamansal değişim için gerekli olduğunu göstermek, diseksiyon kasları mRNA-Seq için kullanılabilir gösteren, kütle spektrometresi, ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) Uygulama. Bu diseksiyon protokolü dokuya özgü omik analizlerinin desteklenmesine yardımcı olacaktır ve genellikle miyogenezin birden fazla biyolojik yönünü incelemek için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches at JoVE.com

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila uçuş kası transkripsiyonel düzenleme, alternatif birleştirme, metabolizma ve mekanobiyoloji çalışma güçlü bir modeldir. Biz proteomics ve derin sıralama için ideal son derece zenginleştirilmiş örnekler oluşturmak için canlı pupa floresan etiketli uçuş kası diseksiyon için bir protokol salıyoruz. Bu örnekler kas gelişiminin çeşitli yönleri ne önemli mekanistik anlayışlar sunabilir.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Protokol, gen ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için pupa gelişimi sırasında drosophila'dan çeşitli zaman noktasında GFP etiketli dolaylı uçuş kasının diseksiyonu kolaylaştırıyor. Bu teknikler kullanılarak, rt-PCR, batı leke veya omik yaklaşımlar için uygun minimum RNA protein bozunması ile yüksek zenginleştirilmiş uçuş kas örneği elde edilebilir. Bu özel diseksiyonlar pratik ve beceri gerektirir, ancak kesilebilir pupa sayısı ve örneklerin kalitesi deneyimi ile geliştirmek.Bu diseksiyonun görsel gösterimi, uçuş kaslarının kas dışı dokulardan nasıl ayırt edilebildiğini belirlemek ve uçuş kaslarının pupal numunelerden hızlı bir şekilde izole edilmesi için çok önemlidir. Pupa sahnelemek için, 60 milimetrelik Petri kabına pre-pupa toplamak ve aktarmak için ıslak bir fırça kullanın ve bir dürbün mikroskobu altında pupa seks. Erkekler, opak pupaüzerinde yarı saydam küreler olarak görünen testislerin varlığıyla tanımlanır.Yemeği sineklerin zamanı, tarihi ve genotipiyle etiketledikten sonra, pupayı uygun aşamaya kadar 25 ila 27 derece lik bir inkübatörde yaşlayın. 48 H APF'den önce IFM diseksiyonu için, uygun şekilde hazırlanmış pupayı soğutulmuş PBS ile dolu 2/3'lük siyah bir diseksiyon kabına aktarmak için ıslak bir fırça kullanın. Floresan diseksiyon mikroskobu altında, siyah diseksiyon çanak altına pupa birini itmek için 5 forceps kullanın.Pupa açıkça görselleştirilene kadar mikroskop yakınlaştırma ve odak ayarlayın. Pupanın ön kısmını kavramak için bir çift forceps kullanarak, ikinci bir çift forceps tek bir ucu ile pupa dürtmek, karın biraz kapalı-merkez, toraks hemen arkasında. Pupal kılıfın ön yarısını çıkarmak ve karını torakstan ayırmak için toraksın hemen arkasındaki açıkpayı çimdiklemek için ilk keter leri kullanın.Daha sonra, floresan etiketli IFM'leri ortaya çıkarmak için toraksın ön kısmını hafifçe sıkın. Daha sonra, kalan leşi yemeğin karşı tarafına atmak için terpleri kullanın ve sonraki pupayı aynı şekilde inceleyin. Tüm pupa kesildi kten sonra, IFM lifleri toplamak için keterkullanın ve siyah kesme çanak altında bir yığın halinde lifleri düzenlemek.Herhangi bir enkazı görüş alanının dışına itmek için çalgılar kullanın ve ifm olmayan kasları, yağları, piriçleri veya diğer istenmeyen dokuyu örneklerden çıkarın. Daha sonra, IFM yığınını 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarmak için kırpılmış pipet ucu kullanın. 48 H APF'den sonra IFM diseksiyonu için, sahnelenen pupayı mikroskop kaydıranın üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant şeridine aktarmak için hafifçe ıslak bir fırça kullanın.Bir çizgi içinde pupa Orient, ventral tarafı aşağı, ve slayt altına doğru ön. Tüm pupa yerleştirildiğinde, ayrı kızdırmak ve ön spiracles üzerinde ilk pupal durumda açmak için forceps kullanın, ve yavaşça posterior doğru, forceps dorsally bir çift slayt, forceps hareket olarak pupal durumda kesme. Pupayı açılan kasadan kurtarın ve hemen ikinci bir mikroskop slaytında pupayı bir damla PBS'ye aktarın.Tüm pupa serbest bırakıldığında, uzak toraks pupa karın kesmek için ince makas kullanın, ve ayrı bir yığın içine karın itin. Tüm toraks lar çıkarıldığında, PBS çoğunluğu ve karın yığını kaldırmak için bir kağıt mendil kullanın. Kalan torakslara taze, soğutulmuş PBS bir damla ekleyin, tek bir hareketle toraks ikiye bölmek için uzunlamasına vücut ekseni boyunca kafa kesmek için makas kullanmadan önce.Tüm pupalar incelendiğinde, hemikesitlerden birini seçmek için 5 forceps kullanın ve ifm'lerin ortasına ve altına bir tane tane sinin uçlarını nazikçe yerleştirin. İlk çift forceps'ü hala tutarak, pupa180 derecedöndürmeden önce, IFM'nin bir ucunu miğkül ve tendondan uzaklaştırmak için ince makas kullanın. IFM paketini torakstan PBS kabarcığın kenarına aktarmak için, paketi yerinde tutmak için su gerilimini kullanarak forcep'leri kullanın.Ardından, karkas slaytın karşı tarafına doğru itin ve IFM'lerin geri kalanını aynı şekilde inceleyin. IFM'lerin tümü toplandığında, numunelerin içine giden yolu bulmuş olabilecek herhangi bir atlama kası veya manikür parçalarını çıkarmak için 5 forceps kullanın. Daha sonra bir çift forceps arasında parçalanmış IFM'leri nazikçe yakalamak ve IFM'leri 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirmek için su gerilimini kullanın.BRUNO1 IR IFM'lerden alınan mRNA sıralama verileri, yabani tip sıralama verilerine göre gen birimi düzeyinde ekspresyon değişiklikleri gösterir. Diseksiyonlu IFM'lerde tüm proteom kütle spektrometresi kullanılarak protein ve protein izoform düzeylerinde de benzer bir düzenleme gözlenmektedir. Mhc'nin son introniçine bir protein tuzak hattı yerleştirildikten sonra, GFP etiketli proteinin dahil edilmesi IFM'de M-line'ın her iki tarafında 90 H APF'de iki nokta olarak gözlemlenebilirken, bacak kası dokusunda GFP sinyali sarcomere M-line boyunca düzgün bir şekilde gözlemlenebilir.Parçalanan IFM'de RT-PCR kullanılırken, GFP etiketli ekson 34-37 olayından etiketsiz ekson 34-35 olayına kadar bir Mhc izoform anahtarı, 27 santigrat derecede puparium oluşumundan 30 ila 48 saat sonra tespit edilebilir. MRNA dizileme verilerinden, bacak ve atlama kas dokuları üç Mhc izoformunu da ifade eder ve olgun kaslarda GFP etiketli izoformun ekspresyonunu korur. Hem Spalt majör mutant ve BRUNO1 IR-IFM, gfp etiketli Mhc izoform un ekspresyonunu kapatmayı başaramadılar, bu da bacak ve atlama kas dokusuna benzeyen izoform bir ifade profili ile sonuçlandı.RNA bozulmasını önlemek için diseksiyonlar30 dakikadan daha az bir dakika içinde yapılmalıdır unutmayın. Ve, diğer hücre tipleri tarafından kontaminasyon sınırlamak için dikkat etmek. Bu yöntem, RT-PCR veya batı lekeleme gibi biyokimyasal yaklaşımlara uygun IFM ile zenginleştirilmiş örneklerin yanı sıra kütle spektrometresi, yüksek iş elde ekiseri, kromatin konformasyon yakalama ve metabolomik gibi omik stil yaklaşımları oluşturur.Bu diseksiyonlar Drosophila'daki güçlü genetik yaklaşımları, gelişme ve gen düzenlemesinin temel mekanizmalarını araştırmak için sistem düzeyinde verilerle tamamlayabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Drosophila melanogaster dönen egzersiz miktar sistem (istekler) kullanarak ölçüm egzersiz seviyelerinde

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

TreadWheel: Aralığı eğitim protokolü yavaşça indüklenen egzersiz Drosophila melanogaster için

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...