Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

ويعرب صاحبا البلاغ عن امتنانهما للدكتور ماثيو وات في جامعه ملبورن والدكتورة اناستاسيا كرالي في جامعه جونز هوبكنز للمساعدة في اعتماد هذا البروتوكول استنادا إلى عمل موبيل وآخرون6. كما نشكر الدكتورة سابين جوردان علي مساعدتها في تطوير واعتماد هذا البروتوكول في مختبرنا. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01s DK097164 و DK112927 إلى K.A.L.

يتبع هذا البروتوكول إرشادات الرعاية الحيوانية لأبحاث سكريبس.
1. جمع ومعالجه الانسجه العضلية الشرح
<ol><li>في اليوم السابق لتشريح ، تعقيم جميع معدات تشريح (ملقط ، شفرات الحلاقة ، ومقص) واعداد جميع وسائل الاعلام المطلوبة: الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) ، ميغابايت تصفيح وسائل ...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

الهيكل العظمي العضلات أمر حيوي لإنشاء وصيانة التوازن الأيضي11. وتعقد دراسة فسيولوجيا العضلات من خلال التباين بين الافراد, فضلا عن صعوبة في الحصول علي عينات, لا سيما في حاله الدراسات البشرية. وقد تبين myotubes الابتدائية مثقف لتلخيص العديد من الميزات من فسيولوجيا العضلات, بما في ذل...

في حين غالبا ما يستشهد كمؤشر علي الصحة الايضيه الشاملة, وقد أظهرت دراسات متعددة ان مؤشر كتله الجسم (BMI) في كبار السن لا يرتبط باستمرار مع ارتفاع خطر الوفاات. حتى الآن ، والعامل الوحيد الذي يظهر ان تكون متسقة مع انخفاض معدل الوفاات في هذه الفئة السكانية زيادة كتله العضلات1. الانسجه العضلية تمثل واحده من أكبر مصادر الخلايا الحساسة للانسولين في الجسم ، التالي حاسمه في الحفاظ علي التوازن الأيضي العام2. ويرتبط تفعيل انسجه العضلات الهيكل العظمي عن طريق ممارسه الزيادات في كل من حساسية الانسولين المحلية والصحة الايضيه العامة3. بينما في النماذج المجرية ضرورية لدراسة فسيولوجيا العضلات وتاثير وظيفة العضلات علي الأيض المتكاملة, الثقافات الاوليه من myotubes توفير نظام عريكة التي تقلل من تعقيد الدراسات الحيوانية.
يمكن استخدام العضلات المستمدة من عضلات ما بعد الولادة لدراسة تاثير العديد من ظروف العلاج والنمو بطريقه قابله للتكرار بشكل كبير. وقد تم الاعتراف بهذا منذ فتره طويلة وتم وصف عده طرق للعزل والثقافة ميوبلاست4,5,6,7,8,9. بعض هذه الطرق استخدام عضلات حديثي الولادة وتسفر عن اعداد منخفضه نسبيا من المقاطعات5,8, تتطلب العديد من الماشية للدراسات علي نطاق أوسع. أيضا ، تستخدم الطرق الأكثر استخداما لزراعه المقاطع العضلية "ما قبل الطلاء" لإثراء المقاطع العضلية ، التي هي اقل تمسكا من أنواع الخلايا الأخرى. وقد وجدنا ان طريقه الإثراء البديلة الموصوفة هنا لتكون أكثر كفاءه واستنساخا لإثراء السكان الميبلاست التكاثريين. وباختصار ، فان هذا البروتوكول يمكن عزل المقاطع العضلية التكاثرية العالية من الشباب البالغين من العضلات المفسرة ، عبر النمو في وسائل الاعلام الثقافية. يمكن حصاد المقاطع العضلية بشكل متكرر ، علي مدي عده أيام ، وتوسيعها بسرعة ، والتي تحفز علي التفريق في myotubes. هذا البروتوكول التكرار يولد عددا كبيرا من خلايا ميوبلاست صحية التي تفرق بقوة في الوخز التلقائي myotubes. وقد مكنتنا من دراسة الأيض وإيقاعات الايقاعيه في myotubes الابتدائية من الفئران من مجموعه متنوعة من الأنماط الجينية. وأخيرا ، ونحن تشمل أساليب لاعداد myotubes لدراسة الأيض التاكسدي ، وذلك باستخدام قياسات معدلات استهلاك الأوكسجين في لوحات 96-بئر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

العضلات الاوليه هي السلائف التكاثر غير متمايزة للعضلات الهيكل العظمي. ويمكن زراعتها ودراستها كسلائف العضلات أو المستحثة للتمييز في مراحل لاحقه من تطور العضلات. البروتوكول المقدم هنا يصف طريقه قويه للعزل والثقافة من السكان التكاثري للغاية من خلايا ميوبلاست من الشباب الكبار الفار العضلات الهيكل العظمي الشرح. هذه الخلايا هي مفيده لدراسة الخصائص الايضيه للعضلات الهيكل العظمي من نماذج الماوس المختلفة ، وكذلك في التطبيقات المصب الأخرى مثل التحول مع الحمض النووي الخارجية أو محول مع ناقلات التعبير الفيروسي. مستوي التمايز والتمثيل الأيضي لهذه الخلايا يعتمد علي طول التعرض ، وتكوين وسائل الاعلام المستخدمة للحث علي التمايز ميوبلاست. توفر هذه الطرق نظام قوي لدراسة الخلية العضلية الماوس التمثيل الغذائي السابق الجسم الحيوي. الأهم من ذلك ، علي عكس النماذج المجرية ، توفر الطرق الموصوفة هنا عدد الخلايا التي يمكن توسيعها ودراستها مع مستويات عاليه من الاستنساخ.

وبعد القسم 1 من البروتوكول المقدم ينبغي ان تسفر عن الخلايا الاوليه الناشئة من الشرح التي ستكون مرئية تحت مجهر ضوء قياسي (الشكل 2). وسوف ينظر إلى الخلايا غير المتجانسة السكان المتزايد من والمحيطة كل الانسجه العضلية الشرح. ستظهر المقاطعات كمجالات صغيره مستد?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

وتنتشر الخلايا السلائف التي تفرق لتشكيل myotubes بولينوتيد وألياف عضلية في نهاية المطاف الهيكل العظمي العضلات. هنا ، نقدم بروتوكولا للعزل الفعال وثقافة العضلات الاوليه من عضلات الماوس الكبار الشباب الهيكل العظمي. وتتيح هذه الطريقة الدراسات الجزيئية والجينية والايضيه لخلايا العضلات في الثقافة.

العزلة والتمايز من المقاطع الاساسيه من الماوس الهيكل العظمي العضلات الشرح

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

هذا هو بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية الأولية عضلة الماوس لدراسة الأيض السابقين فيفو. يوفر هذا البروتوكول عددًا أكبر بكثير من الخلايا الجذعية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي جربناها في الماضي. والأهم من ذلك، بمجرد أن نفرق هذه الخلايا الجذعية إلى ميوتوب، فإنها تظهر علم وظائف الأعضاء الطبيعي، لذلك أشياء مثل الإيقاعات الإيقاعية.عند محاولة هذا الإجراء للمرة الأولى، أخذ ملاحظات مفصلة وحفظ عدة صور لأن كل explant الأنسجة تبدو مختلفة، وسوف يكون هناك اختلاف في الخروج من myoblasts. بدون مظاهرة مرئية، من الصعب معرفة ما إذا كنت تقوم بعزل الخلايا الصحيحة. لقد استفدنا من المساعدة السخية من الآخرين الذين أظهروا لنا هذه الطريقة عندما أنشأناها في مختبرنا.بعد تحضير الطبق للتشريح وفقاً للمخطوطة، أعد غرفة رطبة بوضع ورقين إلى ثلاث أوراق سميكة من الماصات في كيس بلاستيكي واستخدام ماصة لتبلل سطح الورقة بالماء المعقم. ضع الغرفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق لتعقيم. تشريح العضلات المطلوبة من ماوس يبلغ من العمر أربعة إلى ثمانية أسابيع وشطف بلطف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 40 ميكروغرام لكل ملليلتر gentamycin لتعقيم.استخدام ملقط العقيمة لنقل العضلات إلى طبق معقمة 10 سم غير المغلفة Petri. إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسائل الاعلام الطلاء على العضلات بحيث الأنسجة رطبة ولكن ليس عائمة. استخدام مشرط عقيمة أو شفرة حلاقة لشريحة بلطف العضلات إلى أجزاء صغيرة.استخدام ملقط أو ماصة لنقل شظايا العضلات على سطح لوحة ستة سنتيمترات المغلفة مسبقا. تراكب بلطف جدا إضافية 0.8 ملليلتر من وسائل الاعلام الطلاء على الأنسجة. ضع طبق الستة سنتيمترات الذي يحتوي على شظايا العضلات داخل الغرفة الرطبة وإعادته إلى حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.إعداد وسائل الإعلام myoblast قبل ال وجميعه، التربسين وPBS-gentamycin في حمام مائي في 37 درجة مئوية. لمعطف قارورة T25 لكل مجموعة العضلات، إضافة ملليلترين من حل طلاء لسطح القارورة، يهز بلطف لخلق معطف حتى على السطح، واحتضان قارورة في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. الآن مع ماصة، وإزالة وسائل الاعلام الطلاء من explants العضلات وشطف بلطف explants العضلات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني-gentamycin.إزالة بسرعة برنامج تلفزيوني وعدم السماح لوحة الجلوس في برنامج تلفزيوني. ثم يضاف بلطف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني-gentamycin ووضع لوحة في الحاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. استخدام ماصة P1000 لجمع برنامج تلفزيوني مع الخلايا في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من التربسين إلى الطبق واعيده إلى حاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. اضغط بلطف على اللوحات لطرد القوالب. جمع التربسين مع الخلايا والجمع مع جمع برنامج تلفزيوني.إضافة ثمانية ملليلتر من وسائل الاعلام myoblast إلى أنبوب الطرد المركزي وعكس بلطف لخلط. تراكب بلطف مليلترين من محلول الطلاء على لوحات العضلات وإعادة اللوحات إلى حاضنة درجة مئوية 37. تدور أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا في جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة ز.استلهمت من فوق ونبقي ما يقرب من ملليلتر في الأنبوب. إضافة وسائط myoblast بلطف، ونقل الخلايا إلى قارورة المغلفة مسبقا ووضع القارورة في حاضنة درجة مئوية 37. استلهم وسائل الإعلام من قارورة P0 myoblast T25.شطف الخلايا لفترة وجيزة مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني دافئ-gentamycin ثم pirate برنامج تلفزيوني من القارورة. الماصات ملليلتر اثنين من PBS الدافئة في كل قارورة تحتوي على myoblasts. ضع القارورة مع برنامج تلفزيوني في حاضنة درجة مئوية 37 لمدة ثلاث دقائق.ثم اضغط بقوة على جانب القارورة لطرد الخلايا. تحقق تحت مجهر خفيف لتعويم myoblasts بحرية. ضع القارورة تستقيم في غطاء لثقافة الأنسجة وشطف الجزء السفلي من القارورة مع 10 ملليلترات من وسائل الإعلام myoblast مرتين إلى ثلاث مرات لضمان طرد جميع الخلايا.جمع خليط وسائط الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة ز. التعرق وسائل الإعلام على ترك حوالي ملليلتر واحد في أنبوب يجري الحرص على تجنب بيليه الخلية.أضف بلطف حجمًا مناسبًا من وسائط myoblast إلى أنبوب الطرد المركزي واخلط بلطف. توزيع خليط الخلية على قارورة T75 جديدة ستة ملليلتر لكل من. أضف 10 ملليلترات من وسائط myoblast إلى كل قارورة T75 جديدة.هز القارورة أفقياً بلطف لتوزيع الخلايا ووضعها في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في هذا البروتوكول، تم رصد الخلايا الأولية من explants تحت مجهر ضوء قياسي. وبدا الحصاد المبكر من myoblasts كما جولة صغيرة والمجالات مشرق.استغرق التمايز من myoblasts أربعة إلى ستة أيام خلالها مورفولوجيا الخلايا تغيرت من مجالات جولة واحدة إلى ألياف طويلة طويلة متعددة نوات. تم إنتاج شتّى ميوتوبات مختلفة تماماً والتي كانت جاهزة لقياس معدلات استهلاك الأكسجين. يمكن استخدام هذه الخلايا لعدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات.على سبيل المثال، نحن كثيرا ما تستخدم لهم لدراسة تدفق الركيزة في الصكوك Seahorse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

عزل من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من عضلات الماوس الهيكل العظمي

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

تطبيق التحفيز المزمن لدراسة التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات الهوس الفئران التي يسببها النشاط

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...