Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelig for Dr. Matthew watt på University of Melbourne og Dr. Anastasia Kralli på Johns Hopkins University for at hjælpe med at vedtage denne protokol baseret på arbejdet i Mokbel et al.6. Vi takker også Dr. Sabine Jordan for hjælp til at udvikle og vedtage denne protokol i vores laboratorium. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health R01s DK097164 og DK112927 at K.A.L.

Denne protokol følger retningslinjerne for dyrepasning i Scripps Research.
1. indsamling og behandling af muskelvæv Explants
<ol><li>Dagen før dissektion, sterilisere al dissektions udstyr (pincet, barberblade og saks) og forberede alle nødvendige medier: fosfat bufferet saltvand (PBS), MB plating medier (12,5 mL DMEM, 12,5 mL SKINKE F12, 20 mL varme inaktiveret føtal serum (FBS), 5 mL amniotisk væske medium supplement) og belægnings opløsning (24 mL DMEM, 24 mL SKINKE F12, 1,7 mL ko...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

Skeletmuskulatur er afgørende for etablering og vedligeholdelse af metabolisk homøostase11. Studiet af muskel fysiologi kompliceres af den interindividuelle variation, samt vanskeligheder med at få prøver, især i tilfælde af humane undersøgelser. Kulturperler primære myotubes har vist sig at rekapitulere mange funktioner i muskel fysiologi, herunder calcium homøostase12, regenerering af beskadigede muskelvæv5, metaboliske ændringer som rea...

Mens ofte citeret som en indikation af samlede metaboliske sundhed, flere undersøgelser har vist, at Body Mass Index (BMI) hos ældre voksne ikke er konsekvent forbundet med højere risiko for dødelighed. Til dato, den eneste faktor vist at være i overensstemmelse med reduceret dødelighed i denne population er øget muskel masse1. Muskelvæv repræsenterer en af de største kilder til insulin-følsomme celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedligeholdelsen af den samlede metaboliske homøostase2. Aktivering af skeletmuskulatur væv via motion er forbundet med stigninger i både lokale insulinfølsomhed og samlede metaboliske sundhed3. Mens in vivo modeller er afgørende for at studere muskel fysiologi og virkningen af muskelfunktion på integreret metabolisme, primære kulturer af myotubes giver en Tractable system, der reducerer kompleksiteten af dyreforsøg.
Myoblaster afledt af postnatale muskler kan bruges til at undersøge virkningen af talrige behandling og vækstbetingelser i en meget reproducerbar måde. Dette har længe været anerkendt, og flere metoder til fremmer isolation og kultur er blevet beskrevet4,5,6,7,8,9. Nogle af disse metoder bruger neonatal muskler og giver relativt lavt antal myoblaster5,8, der kræver flere dyr til større skala undersøgelser. Også, mest udbredte metoder til dyrkning myoblaster bruge "pre-plating" at berige for myoblaster, som er mindre Veder end andre celletyper. Vi har fundet den alternative berigende metode, der er beskrevet her, for at være langt mere effektiv og reproducerbar for at berige en meget proliferativ fremmer-population. Sammenfattende giver denne protokol mulighed for isolering af meget proliferativ myoblaster fra unge voksne muskel explants, via udvækst til kultur medier. Myoblaster kan høstes gentagne gange, over flere dage, hurtigt ekspanderet, og induceret til at skelne til myotubes. Denne protokol genererer reproducerbart et stort antal raske fremmer-celler, der i høj grad adskiller sig i spontant trækninger myotubes. Det har gjort det muligt for os at studere metabolisme og døgnrytme i primære myotubes af mus af en række genotyper. Endelig omfatter vi metoder til fremstilling af myotubes til undersøgelse af oxidativ metabolisme, ved hjælp af målinger af iltforbrug satser i 96-brønd plader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Primære myoblaster er udifferentierede prolifererende forstadier af skeletmuskulatur. De kan dyrkes og undersøgt som muskel prækursorer eller induceret til at differentiere i senere stadier af muskel udvikling. Den protokol, der gives her beskriver en robust metode til isolation og kultur af en meget proliferativ population af fremmer celler fra unge voksne mus skeletmuskulatur explants. Disse celler er nyttige for studiet af de metaboliske egenskaber af skeletmuskulatur af forskellige musemodeller, såvel som i andre downstream applikationer såsom transfektering med eksogen DNA eller transduktion med viral Expression vektorer. Graden af differentiering og metaboliske profil af disse celler afhænger af eksponeringens længde, og sammensætningen af de medier, der anvendes til at inducere fremmer differentiering. Disse metoder giver et robust system til undersøgelse af muse muskel cellemetabolisme ex vivo. Vigtigere, i modsætning til in vivo-modeller, de metoder, der er beskrevet her, giver en cellepopulation, som kan udvides og undersøgt med høje niveauer af reproducerbarhed.

I henhold til afsnit 1 i den medfølgende protokol skal primær cellerne fremkommer fra de bruskeksplantater, der vil være synlige under et standardlys mikroskop (figur 2). En heterogen cellepopulation vil blive set vokser ud af og omgiver hver muskelvæv explant. Myoblaster vil fremstå som små, runde, lyse kugler. Efter afsnit 2 i protokollen vil give tidlig høst af myoblaster fra vævs explants, som vil indeholde få celler og vil være heterogene (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Myoblaster er prolifererende prækursorceller, der differentierer til dannelse af polynucleerede myotubes og i sidste ende skeletmuskulatur myofibers. Her præsenterer vi en protokol for effektiv isolation og kultur af primære myoblaster fra unge voksne mus skeletmuskulatur. Metoden muliggør molekylære, genetiske og metaboliske undersøgelser af muskelceller i kulturen.

Isolering og differentiering af primære Myoblaster fra mus skeletmuskulatur Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Dette er en protokol for isolering af primære mus muskel stamceller til undersøgelse af metabolisme ex vivo. Denne protokol giver en langt større population af stamceller i forhold til andre protokoller, som vi har prøvet tidligere. Og vigtigst af alt, når vi differentiere disse stamceller i myotubes, de udviser normal fysiologi, så ting som døgnrytmen.Når du prøver denne procedure for første gang, tage detaljerede noter og gemme flere billeder, fordi hver væv explant ser anderledes ud, og der vil være variation i udvækst af myoblaster. Uden visuel demonstration er det svært at vide, om du isolerer de korrekte celler. Vi nød godt af den generøse hjælp fra andre, der viste os denne metode, da vi etablerede det i vores laboratorium.Efter at have forberedt skålen til dissektion i henhold til manuskriptet, forberede en fugtig kammer ved at placere to til tre ark tykt absorberende papir i en plastikpose og bruge en pipette til våd overfladen af papiret med sterilt vand. Placer kammeret under UV-lys i fem minutter for at sterilisere. Disseker den ønskede muskel fra en fire til otte uger gammel mus og skyl forsigtigt i PBS indeholdende 40 mikrogram pr. milliliter gentamycin for at sterilisere.Brug sterile kraftbecer til at overføre musklen til en steril 10 centimeter ikke-belagt petriskål. Tilføj 0,5 til en milliliter plating medier over musklen, således at vævet er fugtigt, men ikke flydende. Brug en steril skalpel eller barberblad til forsigtigt at skære musklen i små fragmenter.Brug scener eller en pipette til at overføre muskelfragmenterne på overfladen af en forbelagt seks centimeter plade. Meget forsigtigt overlejre en ekstra 0,8 milliliter plating medier over vævet. Placer de seks centimeter parabol, der indeholder muskel fragmenter inde i fugtige kammer og returnere den til en inkubator på 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 48 timer.Forbered og prewarm myoblast medier, trypsin og PBS-gentamycin i et vandbad ved 37 grader Celsius. En T25-kolbe til hver muskelgruppe anbringes to milliliter belægningsopløsning på kolbens overflade, rystes forsigtigt for at skabe et jævnt lag på overfladen og inkubere kolben ved fire grader Celsius i en time. Nu med en pipette, fjerne plating medier fra musklen explants og forsigtigt skylle musklen explants med to milliliter PBS-gentamycin.Fjern hurtigt PBS, og lad ikke pladen sidde i PBS. Derefter forsigtigt tilføje en milliliter PBS-gentamycin og placere pladen i 37 grader Celsius inkubator i et minut. Brug en P1000-pipette til at opsamle PBS med celler i et 15 milliliter centrifugerør.Dernæst tilsættes en milliliter trypsin til pladen og returnere den til 37 grader Celsius inkubator i tre minutter. Bank forsigtigt på pladerne for at løsne myoblasterne. Saml trypsin med celler og kombinere med PBS indsamling.Tilføj otte milliliter myoblast medier til centrifugerøret og let inverteres for at blande. Overlejr forsigtigt to milliliter platinopløsning på muskelpladerne og tilbagelever pladerne til 37 grader Celsius-inkubatoren. Centrifugerør, der indeholder celler i en centrifuge, drejes i tre minutter ved 200 gange g.Inspirer supernatanten og hold ca. en milliliter i røret. Tilsæt forsigtigt myoblastmedier, overfør cellerne til den forbelagte kolbe, og kolben anbringes i 37 grader Celsius-inkubatoren. Aspirere medierne fra P0 myoblast T25 kolber.Cellerne skylles kortvarigt med to milliliter varm PBS-gentamycin, hvortil indsugning af PBS fra kolben. Pipetter to milliliter varm PBS i hver kolbe indeholdende myoblaster. Kolber med PBS anbringes i 37 grader Celsius-inkubatoren i tre minutter.Bank derefter godt på siden af kolben for at løsne cellerne. Check under et let mikroskop for frit flydende myoblaster. Kolberene anbringes oprejst i en vævskulturhætte, og kolberne skylles to til tre gange for at sikre, at alle celler løsnes.Celleremedieblandingen opsamls i et centrifugerør på 15 milliliter. Centrifuge i tre minutter ved 200 gange g. Inspirer medierne til at forlade omkring en milliliter i røret være omhyggelig med at undgå celle pellet.Tilsæt forsigtigt en passende mængde myoblastmedier til centrifugerøret og bland forsigtigt. Celleblandingen fordeles til nye T75-kolber med seks milliliter hver. Der tilsættes 10 milliliter myoblastmedier til hver ny T75-kolbe.Ryst forsigtigt kolben vandret for at fordele cellerne og anbringe dem i inkubatoren ved 37 grader Celsius natten over. I denne protokol, primære celler opstod fra explants blev observeret under en standard lys mikroskop. Tidlig høst af myoblaster optrådte som små runde og lyse kugler.Differentiering af myoblaster tog fire til seks dage, hvor morfologien af cellerne skiftede fra enkelt runde kugler til aflange sammensmeltet lange multi-nucleated fibre. Fuldt differentieret myotubes blev givet, som var klar til måling af iltforbrug satser. Disse celler kan bruges til en række downstream-applikationer.For eksempel bruger vi dem ofte til at studere substrat flux i Seahorse instrumenter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering og kvantitativ Immuncytokemisk karakterisering af primære myogene celler og fibroblaster fra human skeletmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Brug af Isoleret Mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High throughput Mikropladekrav Respiratory Målinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion af akut Skeletal Muscle Regeneration af cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Forberedelse og Kultur Myogenic precursorceller / Primær Myoblaster af skeletmuskulatur af Voksen og Aged Mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolering af type I og type II pericytter fra muskelsmuskler

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Isolering af humane myoblaster, vurdering af myogen differentiering og butiksdrevet calciumindgangsmåling

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, kultur og differentiering af knoglemarven stromale celler og osteoklast ophav fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse af kronisk stimulering til at studere kontraktile aktivitet-induceret rotte skeletmuskulatur fænotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...