Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants au Dr Matthew Watt de l'Université de Melbourne et au Dr Anastasia Kralli de l'Université Johns Hopkins pour leur aide à adopter ce protocole basé sur les travaux de Mokbel et al.,6. Nous remercions également la Dre Sabine Jordan pour son aide à l'élaboration et à l'adoption de ce protocole dans notre laboratoire. Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health R01s DK097164 et DK112927 à K.A.L.

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de Scripps Research.
1. Collecte et traitement des explants de tissu musculaire
<ol><li>La veille de la dissection, stériliser tous les équipements de dissection (forceps, lames de rasoir et ciseaux) et préparer tous les supports requis : saline tamponnée en phosphate (PBS), mb Placage (12,5 mL de DMEM, 12,5 mL de HAMS F12, 20 mL de bovins fœtaux inactivés par la chaleur sérum (FBS), 5 mL de supplément moyen de liquide amniotique)...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

Le muscle squelettique est essentiel pour l'établissement et le maintien de l'homéostasie métabolique11. L'étude de la physiologie musculaire est compliquée par la variabilité interindividuelle, ainsi que par la difficulté d'obtenir des échantillons, en particulier dans le cas des études humaines. Les myotubes primaires cultivés ont été montrés pour récapituler beaucoup de dispositifs de la physiologie de muscle, y compris l'homéostasie de calcium12,régéné...

Bien que souvent cité comme une indication de la santé métabolique globale, de multiples études ont montré que l'indice de masse corporelle (IMC) chez les personnes âgées n'est pas systématiquement associée à un risque plus élevé de mortalité. À ce jour, le seul facteur démontré compatible avec la réduction de la mortalité dans cette population est l'augmentation de la masse musculaire1. Le tissu musculaire représente l'une des plus grandes sources de cellules sensibles à l'insuline dans le corps, et est donc critique dans le maintien de l'homéostasie métabolique globale2. L'activation du tissu musculaire squelettique par l'exercice est associée à des augmentations de la sensibilité locale à l'insuline et de la santé métabolique globale3. Alors que les modèles in vivo sont essentiels pour étudier la physiologie musculaire et l'impact de la fonction musculaire sur le métabolisme intégré, les cultures primaires des myotubes fournissent un système tractable qui réduit la complexité des études animales.
Les myoblastes dérivés des muscles postnatals peuvent être utilisés pour étudier l'impact de nombreux traitements et conditions de croissance d'une manière hautement reproductible. Cela a longtemps été reconnu et plusieurs méthodes pour l'isolement et la culture du myoblaste ont été décrits4,5,6,7,8,9. Certaines de ces méthodes utilisent des muscles néonatals et produisent un nombre relativement faible de myoblastes5,8, nécessitant plusieurs animaux pour des études à plus grande échelle. En outre, les méthodes les plus largement utilisées pour cultiver les myoblastes utilisent le « pré-plaquage » pour enrichir les myoblastes, qui sont moins adhérents que les autres types de cellules. Nous avons trouvé la méthode alternative d'enrichissement décrite ici comme étant beaucoup plus efficace et reproductible pour enrichir une population de myoblastes hautement proliférante. En résumé, ce protocole permet l'isolement des myoblastes hautement proliférants des explants musculaires de jeunes adultes, par l'intermédiaire de la croissance dans les médias culturels. Les myoblastes peuvent être récoltés à plusieurs reprises, sur plusieurs jours, rapidement élargis, et induits à se différencier en myotubes. Ce protocole génère reproductiblement un grand nombre de cellules de myoblaste saines qui se différencient solidement en myotubes secousses spontanément. Il nous a permis d'étudier le métabolisme et les rythmes circadiens dans les myotubes primaires des souris d'une variété de génotypes. Enfin, nous incluons des méthodes pour préparer les myotubes pour l'étude du métabolisme oxydatif, en utilisant des mesures des taux de consommation d'oxygène dans les plaques de 96 puits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Les myoblastes primaires sont des précurseurs proliférants indifférenciés du muscle squelettique. Ils peuvent être cultivés et étudiés comme précurseurs musculaires ou induits à se différencier en stades ultérieurs du développement musculaire. Le protocole fourni ici décrit une méthode robuste pour l'isolement et la culture d'une population fortement proliférante des cellules de myoblast des explants de muscle squelettique de souris de jeune adulte. Ces cellules sont utiles pour l'étude des propriétés métaboliques du muscle squelettique de différents modèles de souris, ainsi que dans d'autres applications en aval telles que la transfection avec l'ADN exogène ou la transduction avec des vecteurs d'expression virale. Le niveau de différenciation et le profil métabolique de ces cellules dépend de la durée d'exposition, et la composition des médias utilisés pour induire la différenciation du myoblaste. Ces méthodes fournissent un système robuste pour l'étude du métabolisme des cellules musculaires de la souris ex vivo. Fait important, contrairement aux modèles in vivo, les méthodes décrites ici fournissent une population cellulaire qui peut être élargie et étudiée avec des niveaux élevés de reproductibilité.

La section 1 du protocole fourni devrait produire des cellules primaires issues des explants qui seront visibles sous un microscope léger standard (figure 2). Une population hétérogène de cellules sera vue se développant hors et entourant chaque explante de tissu de muscle. Les myoblastes apparaîtront comme de petites sphères rondes et lumineuses. La section 2 du protocole produira des récoltes précoces de myoblastes à partir d'explants de tissus, q...

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Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Les myoblastes sont des cellules précurseurs proliférantes qui se différencient pour former des myotubes polynucléés et éventuellement des myofibres musculaires squelettiques. Ici, nous présentons un protocole pour l'isolement efficace et la culture des myoblastes primaires des muscles squelettiques de souris jeunes adultes. La méthode permet des études moléculaires, génétiques et métaboliques des cellules musculaires en culture.

Isolement et différenciation des myoblastes primaires des explantations de muscle squelettique de souris

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Il s’agit d’un protocole pour l’isolement des cellules souches musculaires primaires de la souris pour l’étude du métabolisme ex vivo. Ce protocole fournit une population beaucoup plus importante de cellules souches par rapport à d’autres protocoles que nous avons essayé dans le passé. Et surtout, une fois que nous différencions ces cellules souches en myotubes, elles présentent une physiologie normale, donc des choses comme les rythmes circadiens.Lors de l’essai de cette procédure pour la première fois, prendre des notes détaillées et enregistrer plusieurs images parce que chaque explant tissu semble différent et il y aura des variations dans l’excroissance des myoblastes. Sans démonstration visuelle, il est difficile de savoir si vous isolez les cellules correctes. Nous avons bénéficié de l’aide généreuse d’autres personnes qui nous ont montré cette méthode lorsque nous l’avons établie dans notre laboratoire.Après avoir préparé le plat pour la dissection selon le manuscrit, préparer une chambre humide en plaçant deux à trois feuilles de papier absorbant épais dans un sac en plastique et utiliser une pipette pour mouiller la surface du papier avec de l’eau stérile. Placez la chambre sous la lumière UV pendant cinq minutes pour stériliser. Disséquer le muscle désiré d’une souris de quatre à huit semaines et rincer doucement dans PBS contenant 40 microgrammes par gentamycine millilitre pour stériliser.Utilisez des forceps stériles pour transférer le muscle dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres non enduite. Ajouter 0,5 à un millilitre de supports de placage sur le muscle de sorte que le tissu est humide, mais pas flottant. Utilisez un scalpel stérile ou une lame de rasoir pour couper doucement le muscle en petits fragments.Utilisez des forceps ou une pipette pour transférer les fragments musculaires sur la surface d’une plaque pré-enduite de six centimètres. Superposez très doucement 0,8 millilitres supplémentaires de supports de placage sur le tissu. Placez le plat de six centimètres contenant les fragments musculaires à l’intérieur de la chambre humide et retournez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.Préparer et préchawarer les médias myoblastes, la trypsine et la génotamycine PBS dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Pour enrober un flacon T25 pour chaque groupe musculaire, ajouter deux millilitres de solution de revêtement à la surface du flacon, secouer doucement pour créer une couche même à la surface, et incuber le flacon à quatre degrés Celsius pendant une heure. Maintenant, avec une pipette, enlever les supports de placage des explantations musculaires et rincer doucement les explantations musculaires avec deux millilitres de PBS-gentamycine.Retirez rapidement le PBS et ne laissez pas la plaque reposer dans le PBS. Ajouter ensuite délicatement un millilitre de PBS-gentamycine et placer la plaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant une minute. Utilisez une pipette P1000 pour recueillir le PBS avec des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine à la plaque et retournez-le à l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Appuyez doucement sur les assiettes pour déloger les myoblastes. Recueillir la trypsine avec des cellules et combiner avec la collection PBS.Ajouter huit millilitres de myoblaste dans le tube de centrifugeuse et inverser délicatement pour mélanger. Superposez doucement deux millilitres de solution de placage sur les plaques musculaires et retournez les plaques à l’incubateur de 37 degrés Celsius. Faire tourner les tubes de centrifugeuse contenant des cellules dans une centrifugeuse pendant trois minutes à 200 fois g.Aspirer le surnatant et garder environ un millilitre dans le tube. Ajouter délicatement le média myoblaste, transférer les cellules dans le flacon pré-enduit et placer le flacon dans l’incubateur de 37 degrés Celsius. Aspirez les médias des flacons P0 myoblastE T25.Rincez brièvement les cellules à l’aide de deux millilitres de génotamycine PBS chaude puis aspirez le PBS du flacon. Pipette deux millilitres de PBS chaud dans chaque flacon contenant des myoblastes. Placez les flacons avec PBS dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant trois minutes.Puis appuyez fermement sur le côté de la fiole pour déloger les cellules. Vérifiez sous un microscope léger les myoblastes flottant librement. Placez les flacons à la verticale dans un capot de culture tissulaire et rincez le fond des flacons avec 10 millilitres de médias myoblastes deux à trois fois pour vous assurer que toutes les cellules sont délogées.Recueillir le mélange de médias cellulaires dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Centrifugeuse pendant trois minutes à 200 fois g. Aspirez les médias à laisser environ un millilitre dans le tube en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire.Ajouter délicatement un volume approprié de supports myoblastes au tube de centrifugeuse et mélanger délicatement. Répartir le mélange cellulaire dans de nouveaux flacons T75 de six millilitres chacun. Ajouter 10 millilitres de myoblaste à chaque nouveau flacon T75.Secouez doucement les flacons horizontalement pour distribuer les cellules et placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Dans ce protocole, des cellules primaires ont émergé des explants ont été observées sous un microscope léger standard. Les premières récoltes de myoblastes sont apparues sous forme de petites sphères rondes et brillantes.La différenciation des myoblastes a pris quatre à six jours au cours de laquelle la morphologie des cellules est passé de sphères rondes simples à de longues fibres multinucléées fusionnées allongées. Des myotubes entièrement différenciés ont été donnés qui étaient prêts pour la mesure des taux de consommation d’oxygène. Ces cellules peuvent être utilisées pour un certain nombre d’applications en aval.Par exemple, nous les utilisons fréquemment pour étudier le flux de substrat dans les instruments seahorse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

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Recherche

Biologie du développement

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Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

L&#39;isolement des myoblastes humains, l&#39;évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l&#39;entrée de calcium par magasin

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Application d’une Stimulation chronique pour étudier les Rat d’induite par l’activité Contractile du Muscle squelettique phénotypique Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...