Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
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Die Autoren danken Dr. Matthew Watt von der University of Melbourne und Dr. Anastasia Kralli von der Johns Hopkins University für die Unterstützung bei der Annahme dieses Protokolls auf der Grundlage der Arbeit von Mokbel et al.6. Wir danken auch Dr. Sabine Jordan für die Unterstützung bei der Entwicklung und Annahme dieses Protokolls in unserem Labor. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01s DK097164 und DK112927 an K.A.L. finanziert.

Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien von Scripps Research.
1. Sammlung und Verarbeitung von Muskelgewebe-Explants
<ol><li>Am Tag vor der Zerlegung alle Seziergeräte (Zangen, Rasierklingen und Scheren) sterilisieren und alle benötigten Medien vorbereiten: phosphatgepufferte Kochsaline (PBS), MB-Beschichtungsmedien (12,5 ml DMEM, 12,5 ml HAMS F12, 20 ml wärmeinaktiviertes fetales Rinderrin Serum (FBS), 5 ml Fruchtwassermedium-Ergänzung) und Beschichtungslösung (24 ml DMEM, 24 ...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

Skelettmuskel ist entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase11. Die Untersuchung der Muskelphysiologie wird durch interindividuelle Variabilität sowie Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Proben, insbesondere bei Studien am Menschen, erschwert. Kultivierte primäre Myotuben haben gezeigt, dass viele Merkmale der Muskelphysiologie zu rekapitulieren, einschließlich Kalziumhomöostase12, Regeneration von geschädigtem Muskelgewebe<...

Obwohl oft als Hinweis auf die allgemeine metabolische Gesundheit genannt, haben mehrere Studien gezeigt, dass der Body-Mass-Index (BMI) bei älteren Erwachsenen nicht konsequent mit einem höheren Sterblichkeitsrisiko verbunden ist. Bis heute ist der einzige Faktor, der mit der reduzierten Sterblichkeit in dieser Population konsistent ist, erhöhte Muskelmasse1. Muskelgewebe stellt eine der größten Quellen von Insulin-empfindlichen Zellen im Körper dar und ist daher entscheidend für die Aufrechterhaltung der gesamten metabolischen Homöostase2. Aktivierung des Skelettmuskelgewebes durch Übung ist verbunden mit Erhöhungen der lokalen Insulinempfindlichkeit und der allgemeinen metabolischen Gesundheit3. Während In-vivo-Modelle für das Studium der Muskelphysiologie und die Auswirkungen der Muskelfunktion auf den integrierten Stoffwechsel unerlässlich sind, bieten Primärkulturen von Myotuben ein beschreibbares System, das die Komplexität von Tierstudien reduziert.
Myoblaste, die aus postnatalen Muskeln gewonnen werden, können verwendet werden, um die Auswirkungen zahlreicher Behandlungs- und Wachstumsbedingungen in einer sehr reproduzierbaren Weise zu untersuchen. Dies ist seit langem anerkannt und mehrere Methoden für myoblast Isolation und Kultur wurden beschrieben4,5,6,7,8,9. Einige dieser Methoden verwenden neonatale Muskeln und ergeben relativ geringe Anzahl von Myoblasten5,8, erfordert mehrere Tiere für größere Studien. Auch die am häufigsten verwendeten Methoden zur Kultivierung von Myoblasten verwenden "Pre-Plating", um myoblasts zu bereichern, die weniger haftend sind als andere Zelltypen. Wir haben festgestellt, dass die hier beschriebene alternative Anreicherungsmethode viel effizienter und reproduzierbarer für die Anreicherung einer hochproliferativen Myoblastpopulation ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Isolierung von hochproliferativen Myoblasten von jungen erwachsenen Muskelexplantationen über das Auswachsen in Kulturmedien ermöglicht. Myoblaste können wiederholt geerntet werden, über mehrere Tage, schnell erweitert, und induziert, in Myotubes zu differenzieren. Dieses Protokoll erzeugt reproduzierbar eine große Anzahl gesunder Myoblastzellen, die sich robust in spontan zuckende Myotuben differenzieren. Es hat uns ermöglicht, Stoffwechsel und zirkadiane Rhythmen in primären Myotuben von Mäusen einer Vielzahl von Genotypen zu studieren. Schließlich schließen wir Methoden zur Vorbereitung von Myoröhren für die Untersuchung des oxidativen Stoffwechsels ein, indem wir Messungen der Sauerstoffverbrauchsraten in 96-Well-Platten verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Primäre Myoblasten sind undifferenzierte proliferierende Vorläufer des Skelettmuskels. Sie können kultiviert und als Muskelvorläufer untersucht werden oder induziert, um in späteren Stadien der Muskelentwicklung zu unterscheiden. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Isolierung und Kultur einer stark proliferativen Population von Myoblastzellen aus jungen erwachsenen Mausskelettmuskelexplantationen. Diese Zellen sind nützlich für die Untersuchung der metabolischen Eigenschaften des Skelettmuskels verschiedener Mausmodelle sowie in anderen nachgelagerten Anwendungen wie Transfektion mit exogener DNA oder Transduktion mit viralen Expressionsvektoren. Der Grad der Differenzierung und des metabolischen Profils dieser Zellen hängt von der Dauer der Exposition und der Zusammensetzung der Medien ab, die zur Induzieren von Myoblastendifferenzierung verwendet werden. Diese Methoden bieten ein robustes System für die Untersuchung des Stoffwechsels von Mausmuskelzellen ex vivo. Wichtig ist, dass die hier beschriebenen Methoden im Gegensatz zu in vivo-Modellen eine Zellpopulation bieten, die mit einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit erweitert und untersucht werden kann.

Nach Abschnitt 1 des bereitgestellten Protokolls sollten Primärzellen aus den Explanten hervorgehen, die unter einem Standardlichtmikroskop sichtbar sind (Abbildung 2). Eine heterogene Zellpopulation wird gesehen, wie sie aus jedem Muskelgewebe-Explantation herauswächst und es umgibt. Myoblasten erscheinen als kleine, runde, helle Kugeln. Nach Abschnitt 2 des Protokolls werden frühe Ernten von Myoblasten aus Gewebeexpflanzen hervorgebracht, die nur wenige ...

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Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Dies ist ein Protokoll zur Isolierung von primären Mausmuskelstammzellen für die Untersuchung des Stoffwechsels ex vivo. Dieses Protokoll bietet eine viel größere Population von Stammzellen im Vergleich zu anderen Protokollen, die wir in der Vergangenheit ausprobiert haben. Und wichtig ist, dass, sobald wir diese Stammzellen in Myotuben differenzieren, sie normale Physiologie aufweisen, also Dinge wie zirkadiane Rhythmen.Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal ausprobieren, nehmen Sie detaillierte Notizen und speichern Sie mehrere Bilder, weil jede Gewebeexplantation anders aussieht und es Variationen im Auswachsen von Myoblasten geben wird. Ohne visuelle Demonstration ist es schwierig zu wissen, ob Sie die richtigen Zellen isolieren. Wir profitierten von der großzügigen Hilfe anderer, die uns diese Methode zeigten, als wir sie in unserem Labor etablierten.Nach der Vorbereitung der Schale für die Zerlegung nach dem Manuskript, bereiten Sie eine feuchte Kammer, indem Sie zwei bis drei Blatt dickes absorbierendes Papier in eine Plastiktüte und verwenden Sie eine Pipette, um die Oberfläche des Papiers mit sterilem Wasser zu befeuchten. Legen Sie die Kammer für fünf Minuten unter UV-Licht, um zu sterilisieren. Sezieren Sie den gewünschten Muskel von einer vier bis acht Wochen alten Maus und spülen Sie sanft in PBS mit 40 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin zu sterilisieren.Verwenden Sie sterile Zangen, um den Muskel auf eine sterile 10 Zentimeter unbeschichtete Petrischale zu übertragen. Fügen Sie 0,5 bis einen Milliliter Beschichtungsmedien über den Muskel, so dass das Gewebe feucht ist, aber nicht schwebend. Verwenden Sie ein steriles Skalpell oder Rasierklinge, um den Muskel sanft in kleine Fragmente zu schneiden.Verwenden Sie Zangen oder eine Pipette, um die Muskelfragmente auf die Oberfläche einer vorbeschichteten Sechs-Zentimeter-Platte zu übertragen. Sehr sanft überlagern weitere 0,8 Milliliter Beschichtungsmedien über das Gewebe. Legen Sie die sechs Zentimeter große Schale mit den Muskelfragmenten in die feuchte Kammer und geben Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einen Brutkasten zurück.Myoblast-Medien, Trypsin und PBS-Gentamycin in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorbereiten und vorwärmen. Um einen T25-Kolben für jede Muskelgruppe zu beschichten, fügen Sie zwei Milliliter Beschichtungslösung auf die Oberfläche des Kolbens, schütteln Sie sanft, um eine gleichmäßige Schicht auf der Oberfläche zu schaffen, und bebrüten sie den Kolben bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Mit einer Pipette nun die Beschichtungsmedien aus den Muskelexplanten entfernen und die Muskelexplantationen vorsichtig mit zwei Millilitern PBS-Gentamycin abspülen.Entfernen Sie die PBS schnell und lassen Sie die Platte nicht im PBS sitzen. Dann vorsichtig einen Milliliter PBS-Gentamycin hinzufügen und die Platte für eine Minute in den 37 Grad Celsius Inkubator legen. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die PBS mit Zellen in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu sammeln.Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Trypsin auf die Platte und geben Sie es für drei Minuten in den 37 Grad Celsius Inkubator zurück. Tippen Sie vorsichtig auf die Platten, um die Myoblasten zu vertreiben. Sammeln Sie das Trypsin mit Zellen und kombinieren Sie es mit der PBS-Auflistung.Acht Milliliter Myoblast-Medien in das Zentrifugenrohr geben und sanft invertieren. Überlagern Sie vorsichtig zwei Milliliter Beschichtungslösung auf den Muskelplatten und bringen Sie die Platten zum 37 Grad Celsius Inkubator zurück. Drehen Sie die Zentrifugenröhren, die Zellen in einer Zentrifuge enthalten, drei Minuten lang bei 200 mal g.Aspirieren Sie den Überstand und halten Sie etwa einen Milliliter in der Röhre. Fügen Sie vorsichtig myoblast-Medien hinzu, übertragen Sie die Zellen in den vorbeschichteten Kolben und legen Sie den Kolben in den 37-Grad-Celsius-Inkubator. Aspirieren Sie die Medien von P0 myoblast T25 Kolben.Spülen Sie die Zellen kurz mit zwei Millilitern warmem PBS-Gentamycin und saugen Sie dann die PBS aus dem Kolben. Pipette zwei Milliliter warme PBS in jeden Kolben mit Myoblasten. Legen Sie die Kolben mit PBS für drei Minuten in den 37 Grad Celsius Inkubator.Tippen Sie dann fest auf die Seite des Kolbens, um die Zellen zu lösen. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop frei schwebende Myoblasten. Legen Sie die Kolben aufrecht in eine Gewebekulturhaube und spülen Sie den Boden der Kolben mit 10 Millilitermyoblast-Medien zwei- bis dreimal ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt werden.Sammeln Sie die Zellmedienmischung in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Zentrifuge für drei Minuten bei 200 mal g. Aspirieren Sie die Medien, um etwa einen Milliliter in der Röhre zu lassen, um das Zellpellet zu vermeiden.Fügen Sie dem Zentrifugenrohr vorsichtig ein entsprechendes Volumen myoblast-Medien hinzu und mischen Sie es vorsichtig. Verteilen Sie die Zellmischung auf neue T75-Flaschen mit jeweils sechs Millilitern. Fügen Sie 10 Milliliter myoblast-Medien zu jedem neuen T75-Kolben hinzu.Schütteln Sie die Kolben vorsichtig horizontal, um die Zellen zu verteilen und legen Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. In diesem Protokoll wurden Primärzellen, die aus den Expflanzen hervorgingen, unter einem Standardlichtmikroskop beobachtet. Frühe Ernten von Myoblasten erschienen als kleine runde und helle Kugeln.Die Differenzierung von Myoblasten dauerte vier bis sechs Tage, in denen sich die Morphologie der Zellen von einzelnen runden Kugeln zu langgestreckten, verschmolzenen langen, mehrnukleierten Fasern wandelte. Es wurden vollständig differenzierte Myotubes nachgegeben, die zur Messung der Sauerstoffverbrauchsraten bereit waren. Diese Zellen können für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen verwendet werden.Zum Beispiel verwenden wir sie häufig, um den Substratfluss in Seepferdchen-Instrumenten zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...