Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

המחברים אסירי תודה ד ר מתיו וואט באוניברסיטת מלבורן וד ר אנסטסיה קראלי באוניברסיטת ג'ונס הופקינס לסיוע אימוץ פרוטוקול זה מבוסס על העבודה של מומבל ואח '6. אנו גם מודים לד ר סבין ג'ורדן על סיוע בפיתוח ואימוץ הפרוטוקול הזה במעבדה שלנו. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות R01s DK097164 ו DK112927 כדי K.A.L.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים של סקריפס מחקר.
1. איסוף ועיבוד של הרחבות רקמת שריר
<ol><li>ביום שלפני הניתוח, לחטא את כל הציוד לחיתוך (מלקחיים, סכיני גילוח, ומספריים) ולהכין את כל המדיה הנדרשת: פוספט באגירה מלוחים (PBS), מדיה ציפוי MB (12.5 mL של DMEM זיכרון, 12.5 mL של בשר החזי...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

שריר השלד חיוני להקמת ותחזוקה של הומאוסטזיס מטבולית11. המחקר של הפיזיולוגיה שרירים הוא מסובך על ידי השונות הבינאישית, כמו גם קושי להשיג דגימות, במיוחד במקרה של מחקרים אנושיים. מיולים הראשי מתורבת הוכחו לכידה של תכונות רבות של פיזיולוגיה שרירים, כולל סידן הומאוסטזיס12...

בעוד מצוטט לעתים קרובות כאינדיקציה לבריאות מטבולית כוללת, מחקרים מרובים הראו כי מדד מסת הגוף (BMI) אצל מבוגרים לא קשורה בעקביות עם סיכון גבוה יותר של תמותה. עד כה, הגורם היחיד המוצג להיות עקבי עם תמותה מופחתת באוכלוסייה זו הוא מוגבר מסת השריר1. רקמת השריר מייצגת את אחד המקורות הגדולים ביותר של תאים רגישים לאינסולין בגוף, ולכן הוא קריטי בתחזוקת הומאוסטזיס הכולל מטבולית2. הפעלה של רקמת שריר השלד באמצעות פעילות גופנית קשורה מגדילה הן רגישות מקומית אינסולין הכולל בריאות מטבולית3. בעוד במודלים vivo חיוניים לחקר הפיזיולוגיה שרירים ההשפעה של תפקוד שרירים על חילוף החומרים משולב, התרבויות הראשיות של מיוכי מספקים מערכת צייתן המפחית את המורכבות של מחקרים בעלי חיים.
מוביאוטיבי נגזר השרירים שלאחר לידה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של הטיפול בתנאים רבים והצמיחה באופן מאוד מיוניתן. זה כבר מזמן הוכרה ומספר שיטות לבידוד myoblast חוז ותרבות תוארו4,5,6,7,8,9. חלק מהשיטות הללו משתמשות בשרירי הילדים ומפיקות מספר נמוך יחסית של myoblasts חזיק5,8, המחייב כמה בעלי חיים למחקרים בקנה מידה גדול יותר. כמו כן, השיטות הנפוצות ביותר לשימוש בשיטת "ציפוי מקדים" להעשרת עבור myoblasts אשר הם פחות חסיד מאשר סוגי תאים אחרים. מצאנו את שיטת ההעשרה החלופית המתוארת כאן כדי להיות הרבה יותר יעילה ומיושבה להעשרת אוכלוסיית מחוז מאוד מתרבים. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר את הבידוד של myoblasts צמיחה מאוד מתרבים מפני השרירים הצעירים explants בוגרים, באמצעות צמיחה לתוך מדיה התרבות. ניתן לקצור את המכשולים שוב ושוב, במשך מספר ימים, להרחיב במהירות, והמושרה כדי להבדיל לתוך שפופרות. פרוטוקול זה מייצר מספר רב של תאי מחוז מיאובלי בריאים אשר מבדילים באופן ספונטני מיופופרות. הוא איפשר לנו ללמוד חילוף החומרים ומקצבים מעגליות ב מיוכי הראשי של עכברים של מגוון של גנוסוגים. לבסוף, אנו כוללים שיטות להכנת מיוצינורות לחקר מטבוליזם חמצוני, באמצעות מדידות של שיעורי צריכת החמצן ב 96-לוחיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Myoblasts נמשך ראשוני הם מובחן מתרבים מקדם של שריר השלד. הם יכולים להיות מתורבתים ולמדו כלפי מקדם שרירים או המושרה להבדיל בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח שרירים. הפרוטוקול המסופק כאן מתאר שיטה איתנה עבור הבידוד והתרבות של אוכלוסיה מתרבים מאוד של תאים myoblast חוז מפני השלד הצעיר למבוגרים שרירים בשרירים. תאים אלה שימושיים למחקר של מאפייני חילוף החומרים של שריר השלד של דגמי עכבר שונים, כמו גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון העברה עם DNA אקסוגני או התמרה עם וקטורים ביטוי ויראלי. רמת הבידול ופרופיל חילוף החומרים של תאים אלה תלויה באורך החשיפה, והרכב של המדיה המשמש כדי לגרום בידול myאובאלי. שיטות אלה לספק מערכת חזקה לחקר של תא שרירי העכבר מטבוליזם לשעבר vivo. חשוב לציין, בניגוד לדגמים vivo, השיטות המתוארות כאן מספקות אוכלוסיית תאים שניתן להרחיב וללמוד ברמות גבוהות של האפשרות הניתנת למחקר.

לאחר סעיף 1 של הפרוטוקול המסופק יש להניב תאים ראשוניים המתעוררים מתוך explants שיהיו גלויים תחת מיקרוסקופ אור רגיל (איור 2). אוכלוסיית תאים הטרוגנית יראו גדלה ומקיפה כל רקמת שריר לחקור. מיאובלי יופיע כספירות קטנות, עגולות ובהירות. לאחר סעיף 2 של הפרוטוקול תניב ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

זהו פרוטוקול לבידוד של תאי גזע שריר העכבר הראשי לחקר חילוף החומרים ex vivo. פרוטוקול זה מספק אוכלוסייה הרבה יותר גדולה של תאי גזע בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שניסינו בעבר. וחשוב מכך, ברגע שאנחנו מבדילים את תאי הגזע האלה לתוך מיוטובים, הם מפגינים פיזיולוגיה נורמלית, כך שדברים כמו מקצבים ביולוגיים.כאשר מנסים הליך זה בפעם הראשונה, לרשום הערות מפורטות ולשמור כמה תמונות כי כל רקמה explant נראה שונה ויהיה וריאציה בהיכל של myoblasts. ללא הדגמה חזותית, קשה לדעת אם אתה מבודד את התאים הנכונים. נהנינו מהעזרה הנדיבה של אחרים שהראו לנו שיטה זו כאשר הקמנו אותה במעבדה שלנו.לאחר הכנת המנה לניתוח על פי כתב היד, הכינו תא לח על ידי הנחת שניים עד שלושה גיליונות נייר סופג עבה לתוך שקית ניילון ולהשתמש פיפטה להרטיב את פני השטח של הנייר עם מים סטריליים. מניחים את התא תחת אור UV במשך חמש דקות כדי לעקר. לנתח את השריר הרצוי מעכבר בן ארבעה עד שמונה שבועות ולשטוף בעדינות PBS המכיל 40 מיקרוגרם למיליליטר ג'נטמיצין כדי לעקר.השתמש ממטרים סטריליים כדי להעביר את השריר לצלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ לא מצופה. מוסיפים 0.5 למיליליטר של ציפוי התקשורת על השריר כך הרקמה לחה אך לא צפה. השתמש אזמל סטרילי או סכין גילוח כדי לחתוך בעדינות את השריר לרסיסים קטנים.השתמש ממטרים או פיפטה כדי להעביר את שברי השריר על פני השטח של צלחת מצופה מראש שישה סנטימטרים. בעדינות רבה כיסוי נוסף 0.8 מיליליטר של ציפוי התקשורת על הרקמה. מניחים את צלחת ששת הסנטימטר המכילה את שברי השריר בתוך התא לח ולהחזיר אותו אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.הכינו וקדם מיובלסט מדיה, טריפסין ו PBS-gentamycin באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לצפות בקבוק T25 עבור כל קבוצת שרירים, להוסיף שני מיליליטר של פתרון ציפוי על פני השטח של הבקבוק, לנער בעדינות כדי ליצור מעיל אחיד על פני השטח, ו דגירה הבקבוק בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. עכשיו עם פיפטה, להסיר את התקשורת ציפוי מן השריר explants בעדינות לשטוף את השריר explants עם שני מיליליטר של PBS-gentamycin.הסר במהירות את PBS ואל תיתן לצלחת לשבת ב- PBS. לאחר מכן מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד של PBS-gentamycin ומ מניחים את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. השתמש P1000 פיפטה כדי לאסוף את PBS עם תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין לצלחת ומחזירים אותו לאנקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. הקישו בעדינות על הצלחות כדי לנתק את המילובסטים. לאסוף את טריפסין עם תאים ולשלב עם אוסף PBS.הוסף שמונה מיליליטר של מדיה myoblast לצינור צנטריפוגה בעדינות להפוך לערבב. בעדינות כיסוי שני מיליליטר של פתרון ציפוי על צלחות השריר ולהחזיר את הצלחות אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. סובב את צינורות הצנטריפוגה המכילים תאים בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 200 פעמים g.שאף את העל-טבעי ושמור כמיליליטר בצינור. מוסיפים בעדינות את המדיה myoblast, מעבירים את התאים לבקבוק מצופה מראש ומ מניחים את הבקבוק באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. שאפו את התקשורת מבקבוקי T25 מיובלסט P0.לשטוף את התאים לזמן קצר עם שני מיליליטר של PBS חם-gentamycin ואז לספירה PBS מן הבקבוק. פיפטה שני מיליליטר של PBS חם לתוך כל בקבוק המכיל מיובלאסטים. מניחים את הבקבוקים עם PBS לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן הקישו בחוזקה על צד הבקבוק כדי לנתק את התאים. בדוק תחת מיקרוסקופ אור עבור myoblasts צף בחופשיות. מניחים את flasks זקוף מכסה המנוע של תרבות הרקמה ולשטוף את החלק התחתון של flasks עם 10 מיליליטר של מדיה myoblast פעמיים עד שלוש פעמים כדי להבטיח את כל התאים הם נקע.לאסוף את תערובת מדיה התא בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 200 פעמים g. שאף את התקשורת להשאיר סביב מיליליטר אחד בצינור נזהר כדי למנוע את גלולת התא.הוסיפו בעדינות נפח מתאים של מדיה myoblast לצינור הצנטריפוגה ומערבבים בעדינות. מפיצים את תערובת התאים לבקבוקי T75 חדשים שישה מיליליטר כל אחד. הוסף 10 מיליליטר של מדיה myoblast לכל בקבוק T75 חדש.בעדינות לנער את flasks אופקית כדי להפיץ את התאים למקם אותם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בפרוטוקול זה, תאים ראשוניים הגיחו מן המתפוצצים נצפו תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. יבולים מוקדמים של מיובלאס הופיעו כעולמות עגולים ובהירים קטנים.ההידול של myoblasts לקח ארבעה עד שישה ימים שבמהלכם המורפולוגיה של התאים השתנה מעולמות עגולים בודדים סיבים מוארכים התמזגו ארוך רב גרעינים. מיוטובים מובחנים לחלוטין הניבו שהיו מוכנים למדידת שיעורי צריכת החמצן. תאים אלה יכולים לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם.לדוגמה, לעתים קרובות אנו משתמשים בהם כדי ללמוד שטף מצעים במכשירי סוסון ים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...