Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

著者らは、メルボルン大学のマシュー・ワット博士とジョンズ・ホプキンス大学のアナスタシア・クラリ博士に感謝し、Mokbelらの研究に基づいてこのプロトコルを採用する支援を行っています6.また、サビーヌ・ヨルダン博士が当研究室でこのプロトコルを開発し、採用する支援をしてくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所R01s DK097164とK.A.L.へのDK112927によって資金提供されました。

このプロトコルは、スクリプス研究の動物ケアガイドラインに従っています。
1. 筋肉組織移植の収集と処理
<ol><li>解剖の前日、すべての解剖装置(鉗子、かみそり刃、はさみ)を殺菌し、必要なすべての媒体を準備する:リン酸緩衝生理食べ物(PBS)、MBめっき媒体(DMEMの12.5 mL、HAMS F12の12.5 mL、熱不活性化された胎児の20 mL)血清(FBS)、羊水培地サプリメント5mL、およびコーティ...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

骨格筋は、代謝恒常性11の確立と維持のために不可欠である。筋肉生理学の研究は、特に人間の研究の場合には、個々の変動、ならびにサンプルを得ることの困難によって複雑である。培養された原発性筋管は、カルシウム恒常性12、損傷した筋肉組織5の再生、運動13に応答する代謝変化を含む筋肉生理学の多くの特徴を...

多くの場合、全体的な代謝健康の指標として引用されているが、複数の研究は、高齢者のボディマス指数(BMI)が一貫して死亡率の高いリスクと関連付けられていないことを示しています。現在までに、この集団における死亡率の低下と一致することが示された唯一の因子は、筋肉量1の増加である。筋肉組織は、体内のインスリン感受性細胞の最大の供給源の1つを表し、したがって、全体的な代謝恒常性2の維持に重要である。運動による骨格筋組織の活性化は、局所インスリン感受性と全体的な代謝健康3の両方の増加に関連している。生体内モデルでは、筋肉の生理学と統合された代謝に対する筋肉機能の影響を研究するために不可欠であるが、ミオチューブの一次培養は、動物研究の複雑さを軽減する扱いやすいシステムを提供する。
出生後の筋肉に由来する筋芽生性は、非常に再現性の高い方法で多数の治療と成長条件の影響を研究するために使用することができます。これは長い間認識されており、筋芽生性分離および培養のためのいくつかの方法が説明されています4,5,6,7, 8,9.これらの方法のいくつかは、新生児の筋肉を使用し、ミオブラスト5、8の比較的低い数を生み出し、より大規模な研究のためにいくつかの動物を必要とします。また、筋芽細胞を培養するための最も広く使用されている方法は、他の細胞型よりも付着性が低い筋芽細胞を濃縮するために「プレメッキ」を使用します。我々は、ここで説明する代替濃縮方法は、非常に増殖性の高い筋芽生性集団を濃縮するためにはるかに効率的で再現性があることを見出した。要約すると、このプロトコルは、培養培地への成長を介して、若い成人筋移植から非常に増殖性の筋芽生性の単離を可能にする。ミオブラストは、数日間にわたって繰り返し収穫することができ、急速に拡大し、ミオチューブに分化するように誘導される。このプロトコルは、自発的にけいれんミオチューブに強く分化する多数の健康な筋芽細胞を再現的に生成します。様々なマウスの一次筋管における代謝と概日リズムを研究することが可能になりました。最後に、96ウェルプレートの酸素消費率の測定値を用いて、酸化代謝の研究のために筋管を調製する方法を取り入れています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

原発性筋芽生児は、骨格筋の未分化増殖前駆体である。彼らは培養し、筋肉の前駆体として研究したり、筋肉の発達の後の段階に区別するように誘導することができます.ここで提供されるプロトコルは、若い成人マウス骨格筋移植から筋芽細胞の高増殖集団の単離および培養のための堅牢な方法を説明する。これらの細胞は、異なるマウスモデルの骨格筋の代謝特性の研究、ならびに外因性DNAによるトランスフェクションやウイルス発現ベクターによるトランスダクションなどの他の下流アプリケーションの研究に有用である。これらの細胞の分化および代謝プロファイルのレベルは、暴露の長さ、および筋芽細胞分化を誘導するために使用される培養物の組成に依存する。これらの方法は、マウス筋細胞代謝ex vivoの研究のための堅牢なシステムを提供する。重要なのは、生体内モデルとは異なり、ここで説明する方法は、高いレベルの再現性で拡張および研究できる細胞集団を提供する。

提供されたプロトコルのセクション1に従って、標準的な光顕微鏡の下で見える移植所から出てくる一次細胞を得るべきである(図2)。異種細胞集団は、各筋肉組織の切除から成長し、周囲に見られる。筋芽生は、小さく、丸く、明るい球として表示されます。プロトコルのセクション2に続いて、組織の移植から筋芽細胞の早期収穫が得られ、こ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

これは、ex vivo代謝研究のための一次マウス筋幹細胞の単離のためのプロトコルである。このプロトコルは、過去に試した他のプロトコルと比較して、幹細胞の人口がはるかに多くなります。そして重要なのは、これらの幹細胞をミオチューブに分化すると、通常の生理学を示し、概日リズムのようなものです。この手順を初めて試すときは、すべての組織の外植が異なって見え、筋芽細胞の成長にばらつきがあるので、詳細なメモを取り、いくつかの画像を保存します。視覚的なデモンストレーションがなければ、正しいセルを分離しているかどうかを知ることは困難です。私たちは、私たちの研究室でそれを確立したときに私たちにこの方法を示した他の人の寛大な助けの恩恵を受けました。原稿による解剖用の皿を準備した後、2枚から3枚の厚い吸収紙をビニール袋に入れて湿ったチャンバーを準備し、ピペットを使って紙の表面を滅菌水で濡らします。チャンバーをUV光の下に5分間置き、殺菌します。4~8週齢のマウスから所望の筋肉を解剖し、1ミリリットルのゲンタマイシン当たり40マイクログラムを含むPBSで穏やかに洗いすんで殺菌する。無菌鉗子を使用して、無菌10センチメートルの非コーティングされたペトリ皿に筋肉を移します。組織が湿っているが浮遊しないように、筋肉の上に0.5〜1ミリリットルのメッキ媒体を加えます。滅菌メスやカミソリの刃を使用して、筋肉を小さな断片に優しくスライスします。鉗子またはピペットを使用して、あらかじめコーティングされた6センチメートルプレートの表面に筋肉の断片を移します。非常に穏やかに組織の上にメッキ媒体の追加の0.8ミリリットルをオーバーレイ。湿った部屋の中に筋肉の破片を含む6センチメートルの皿を置き、摂氏37度でインキュベーターに戻し、48時間二酸化炭素を5%戻します。ミオブラスト培地、トリプシン、PBS-ゲンタマイシンを摂氏37度の水浴で準備して予感させます。各筋肉群にT25フラスコをコーティングするには、フラスコの表面に2ミリリットルのコーティング溶液を加え、穏やかに振って表面に均一なコートを作り、フラスコを摂氏4度で1時間インキュベートします。ピペットで、筋外植からメッキ培地を取り除き、PBS-ゲンタマイシンの2ミリリットルで筋肉の外植を穏やかに洗いす。PBSを素早く取り出し、プレートをPBSに入れないでください。その後、PBS-ゲンタマイシンを1ミリリットル軽く加え、プレートを37°Cインキュベーターに1分間入れる。P1000ピペットを使用して、細胞を含むPBSを15ミリリットルの遠心分離管に集めます。次に、プレートに1ミリリットルのトリプシンを加え、37°Cインキュベーターに3分間戻します。プレートを軽くタップして、筋芽細胞を取り除きます。細胞とトリプシンを収集し、PBSコレクションと組み合わせます。遠心管に8ミリリットルの筋芽細胞培地を加え、そっと反転して混ぜます。2ミリリットルのメッキ溶液を筋肉プレートにそっと重ね、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。遠心分離機中の細胞を含む遠心管を200倍gで3分間回転させます。上清を吸引し、チューブに約1ミリリットルを保持します。ミオブラスト培地を静かに加え、細胞をあらかじめコーティングされたフラスコに移し、フラスコを37°Cのインキュベーターに入れる。P0筋芽T25フラスコからメディアを吸引する。2ミリリットルの温かいPBS-ゲンタマイシンで細胞を短時間洗い上げ、フラスコからPBSを吸引する。ミオブラテを含む各フラスコに2ミリリットルの温かいPBSをピペットします。PBSと一緒にフラスコを37°Cのインキュベーターに3分間入れます。次に、フラスコの側面をしっかりとタップして細胞を外します。軽い顕微鏡で、自由に浮遊する筋芽細胞を確認してください。フラスコを組織培養フードに直立させ、フラスコの底を10ミリリットルの筋芽細胞培地で2~3回すすいで、すべての細胞が外れ出すことを確認します。15ミリリットルの遠心分離管に細胞培地混合物を集める。200回gで3分間遠心分離機。培地を吸引し、細胞ペレットを避けるように注意してチューブに1ミリリットル程度放置する。遠心管に適切な量の筋芽細胞培地をそっと加え、軽く混ぜます。新しいT75フラスコに細胞混合物をそれぞれ6ミリリットルに分配する。新しいT75フラスコに10ミリリットルの筋芽細胞培地を加えます。フラスコを水平方向に軽く振って細胞を分配し、一晩摂氏37度でインキュベーターに入れます。このプロトコルでは、外植から出現した初等細胞を標準の光顕微鏡下で観察した。筋芽細胞の初期の収穫は、小さな丸くて明るい球として現れました。筋芽細胞の分化には4~6日かかり、細胞の形態は単一の丸い球から細長い融合された長い多核繊維に変化した。完全に区別されたミオチューブは、酸素消費率の測定の準備ができていた生成された。これらのセルは、いくつかのダウンストリーム アプリケーションに使用できます。例えば、シーホースの機器の基質フラックスを研究するために頻繁に使用します。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...