Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

저자는 멜버른 대학의 매튜 와트 박사와 존스 홉킨스 대학의 아나스타샤 크랄리 박사에게 목벨 등의 작업을 기반으로이 프로토콜을 채택하는 데 도움을 주셔서 감사합니다6. 우리는 또한 우리의 실험실에서이 프로토콜을 개발하고 채택하는 데 도움을 준 Sabine Jordan 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 K.A.L에 건강 R01s DK097164 및 DK112927의 국립 연구소에 의해 투자되었다.

이 프로토콜은 스크립스 연구의 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 근육 조직 이식의 수집 및 처리
<ol><li>해부 전날, 모든 해부 장비(집게, 면도날 및 가위)를 소독하고 필요한 모든 매체를 준비합니다: 인산염 완충식염수(PBS), MB 도금 매체(DMEM 12.5 mL, HAMS F12 12mL, 열-불활성화 태아 소 20mL) 혈청 (FBS), 양수 배지 보충의 5 mL), 및 코팅 용액 (DMEM의 24 mL, HAMS F12의 24 mL, 콜라겐 1.7 mL, 마트?...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

골격 근은 대사 항상성의 설립 및 유지보수에 필수적입니다11. 근육 생리학의 연구는 개별적인 가변성에 의해 복잡합니다, 뿐만 아니라 견본을 얻기에 있는 어려움, 특히 인간 적인 연구 결과의 경우에. 배양된 1차 묘튜브는 칼슘 항상성12,손상된 근육 조직 재생5,운동에 대한 반응으로 대사 변경13,및 근육 생리학의 많은 특징?...

종종 전반적인 신진 대사 건강의 표시로 인용 하는 동안, 여러 연구 는 체 질량 지 수 (BMI) 노인에서 일관 되 게 사망의 높은 위험과 관련 되지 않습니다. 현재까지, 이 인구에 있는 감소된 사망률과 일치하는 것으로 나타난 유일한 요인은 증가된 근육 질량1. 근육 조직은 신체에서 인슐린에 민감한 세포의 가장 큰 공급원 중 하나를 나타내며, 따라서 전반적인 대사 항상성의 유지에 중요합니다2. 운동을 통한 골격근 조직의 활성화는 국소 인슐린 감수성 및 전반적인 대사 건강 의 증가와 관련이있다 3. 생체 내 모델은 근육 생리학과 통합 신진 대사에 대한 근육 기능의 영향을 연구하는 데 필수적이지만, myotube의 기본 문화는 동물 연구의 복잡성을 줄이는 견인 시스템을 제공합니다.
산후 근육에서 파생된 근세포는 매우 재현가능한 방식으로 수많은 치료 및 성장 조건의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 오랫동안 인식되어 왔으며 근강초 격리 및 문화에 대한 여러 가지 방법이4,5,6,7,8,9로설명되어 왔다. 이러한 방법 중 일부는 신생아 근육을 사용하고 더 큰 규모의 연구를 위해 여러 동물을 필요로하는 근체5,8의상대적으로 낮은 숫자를 산출합니다. 또한, 근세포를 배양하기 위한 가장 널리 사용되는 방법은 다른 세포 유형보다 덜 부착된 근세포를 풍부하게 하기 위해 "사전 도금"을 사용합니다. 우리는 고도로 증식하는 근강군을 풍부하게 하기 위한 훨씬 더 효율적이고 재현성이 있는 것으로 여기에서 기술된 대체 농축 방법을 발견했습니다. 요약하면,이 프로토콜은 젊은 성인 근육 이식에서 고도로 증식성 근종의 격리를 가능하게, 문화 매체로 의자 성장을 통해. 근체는 며칠에 걸쳐 반복적으로 수확되고, 급속히 확장되고, myotube로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 이 프로토콜은 자발적으로 경련하는 myotubes로 강력하게 분화하는 많은 수의 건강한 근세포 세포를 재현가능하게 생성합니다. 그것은 우리가 다양한 유전자형의 마우스의 기본 myotube에서 신진 대사와 circadian 리듬을 연구할 수 있게 했습니다. 마지막으로, 우리는 96 웰 플레이트에서 산소 소비율의 측정을 사용하여 산화 물질 대사의 연구를 위한 myotubes를 준비하는 방법을 포함합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

1 차 근세포는 골격 근의 미분화 증식 선구자입니다. 그들은 배양 하 고 근육 선구자로 공부 하거나 근육 개발의 나중 단계로 분화 유도 수 있습니다. 여기에 제공된 프로토콜은 젊은 성인 마우스 골격 근 이식으로부터 의 골수 세포집단의 고도로 증식성 집단의 격리 및 배양에 대한 강력한 방법을 설명한다. 이들 세포는 다른 마우스 모델의 골격 근의 대사 특성의 연구뿐만 아니라 바이러스 발현 벡터를 가진 외인성 DNA 또는 형질전환과 같은 다른 다운스트림 응용 분야에서 유용하다. 이들 세포의 분화 및 대사 프로필의 수준은 근구 분화를 유도하는 데 사용되는 매체의 노출 길이 및 조성에 따라 달라집니다. 이들 방법은 마우스 근육 세포 대사 엑생체의 연구를 위한 견고한 시스템을 제공한다. 중요한 것은, 생체 내 모델과는 달리, 여기에 기술된 방법은 높은 수준의 재현성으로 확장되고 연구될 수 있는 세포 집단을 제공한다.

제공된 프로토콜의 섹션 1에 따라 표준 광 현미경 하에서 볼 수 있는 이식으로부터 나오는 1차 세포를 산출해야한다(도 2). 이기종 세포 인구에서 성장 하 고 각 근육 조직 이식 주위 볼 것 이다. 근체는 작고 둥글고 밝은 구체로 나타납니다. 프로토콜의 섹션 2에 따라 조직 이식에서 조세포의 조기 수확을 얻을 것이다, 이는 몇 가지 세포를 포함하고 이...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

근세포는 다핵근화 된 myotubes를 형성하고 결국 골격 근섬유를 형성하기 위해 분화 전구세포를 증식시. 여기에서, 우리는 젊은 성인 마우스 골격 근육에서 1 차적인 근분의 능률적인 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배양에서 근육 세포의 분자, 유전 및 대사 연구를 가능하게합니다.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

이것은 신진 대사 ex vivo의 연구를 위한 1 차적인 마우스 근육 줄기 세포의 격리를 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 우리가 과거에 시도한 그밖 프로토콜에 비교된 줄기 세포의 훨씬 더 큰 인구를 제공합니다. 그리고 중요한 것은, 일단 우리가 myotubes로 이 줄기 세포를 분화하면, 그(것)들은 일반적인 생리학을 전시합니다, 그래서 circadian 리듬 같이 것.처음으로이 절차를 시도 할 때, 상세한 메모를하고 모든 조직 explant가 다르게 보이고 myoblasts의 파생에 변화가있을 것이기 때문에 여러 이미지를 저장합니다. 시각적 데모없이 올바른 셀을 격리하고 있는지 알기가 어렵습니다. 우리는 실험실에서 이 방법을 보여 준 다른 사람들의 관대 한 도움으로부터 유익을 얻었습니다.원고에 따라 해부 접시를 준비한 후, 두꺼운 흡수성 용지 2~3장을 비닐 봉지에 넣고 파이펫을 사용하여 종이 표면을 멸균물로 적재하여 습한 챔버를 준비합니다. 챔버를 UV 광 아래에 5분간 놓고 멸균합니다. 4~8주 된 마우스에서 원하는 근육을 해부하고 PBS에서 밀리리터 젠타마이신 당 40 마이크로그램을 함유하여 살균합니다.멸균 집게를 사용하여 근육을 10센티미터 비코팅 페트리 접시로 옮기하십시오. 조직이 촉촉하지만 부동하지 않도록 근육에 도금 매체의 1 밀리리터에 0.5를 추가합니다. 멸균 메스 나 면도날을 사용하여 근육을 작은 조각으로 부드럽게 자릅니다.집게 나 파이펫을 사용하여 근육 조각을 미리 코팅 된 6 센티미터 플레이트의 표면으로 옮기. 매우 부드럽게 조직에 도금 매체의 추가 0.8 밀리리터를 오버레이. 습한 챔버 내부에 근육 파편이 들어 있는 6센티미터 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 48시간 동안 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.섭씨 37도의 수조에서 myoblast 미디어, 트립신 및 PBS-gentamycin을 준비하고 예동하십시오. 각 근육 그룹에 대한 T25 플라스크를 코팅하려면 플라스크 표면에 코팅 용액 2 밀리리터를 추가하고 부드럽게 흔들어 표면에 균일한 코트를 만들고 플라스크를 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 파이펫으로, 근육 이에서 도금 매체를 제거하고 부드럽게 PBS -gentamycin의 두 밀리리터와 근육 이출을 헹구십시오.PBS를 신속하게 제거하고 플레이트가 PBS에 앉지 못하게 합니다. 그런 다음 PBS-gentamycin의 밀리리터 1 밀리리터를 부드럽게 넣고 1 분 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 놓습니다. P1000 파이펫을 사용하여 세포가 있는 PBS를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다.다음으로, 접시에 트립신 1 밀리리터를 넣고 3분 동안 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 접시를 부드럽게 눌러 myoblasts를 빼냅니다. 트립신을 셀과 수집하고 PBS 컬렉션과 결합합니다.심근 세포 의 8 밀리리터를 원심분리기 튜브에 넣고 부드럽게 섞어 주세요. 근육 판에 도금 용액 2 밀리리터를 부드럽게 오버레이하고 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 원심분리기에서 세포를 포함하는 원심분리기 튜브를 200배 g에서 3분간 회전시합니다.슈퍼 나티퍼를 흡인하고 튜브에 약 1 밀리리터를 유지하십시오. 밀라스트 미디어를 부드럽게 추가하고, 세포를 미리 코팅된 플라스크로 옮기고 플라스크를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. P0 myoblast T25 플라스크에서 미디어를 흡인.따뜻한 PBS-gentamycin의 2 밀리리터로 세포를 잠시 헹구고 플라스크에서 PBS를 흡인시합니다. 피펫 2 밀리리터의 따뜻한 PBS는 myoblasts를 포함하는 각 플라스크에 넣습니다. PBS로 플라스크를 섭씨 37도 인큐베이터에 3분간 넣습니다.그런 다음 플라스크의 측면을 단단히 탭하여 세포를 빼내세요. 자유롭게 떠있는 myoblasts에 대한 가벼운 현미경에서 확인합니다. 플라스크를 조직 배양 후드에 똑바로 놓고 모든 세포가 빠지도록 2~3회 미오블라스트 배지의 10밀리리터로 플라스크 바닥을 헹구는다.15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 세포 미디어 혼합물을 수집합니다. 원심 분리기는 200배 g에서 3분간. 세포를 피하기 위해 조심되는 튜브에 약 1 밀리리터를 남기는 매체를 흡인.원심분리기 튜브에 적절한 양의 myoblast 미디어를 부드럽게 추가하고 부드럽게 섞습니다. 새로운 T75 플라스크에 세포 혼합물을 각각 6 밀리리터에 분배한다. 각 새로운 T75 플라스크에 myoblast 미디어의 10 밀리리터를 추가합니다.플라스크를 수평으로 부드럽게 흔들어 세포를 분배하고 하룻밤 사이에 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 이 프로토콜에서, 1차 세포는 표준 광 현미경하에서 관찰된 이분야에서 나왔다. 근사의 초기 수확은 작은 둥글고 밝은 구체로 나타났다.근막의 분화는 세포의 형태가 단일 둥근 구체에서 긴 융합 된 긴 융합 된 긴 융합 된 다중 핵 섬유로 변경되는 동안 4 6 일이 걸렸습니다. 완전히 분화된 근투는 산소 소비율을 측정할 준비가 되어 있었습니다. 이러한 셀은 여러 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.예를 들어, 우리는 자주 해마 악기에서 기판 플럭스를 연구하는 데 사용합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

수축 성 활동 유도 된 쥐 골격 근육 Phenotypic 적응 연구 만성 자극에의 응용

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...