Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Os autores são gratos ao Dr. Matthew Watt na Universidade de Melbourne e Dr. Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins para assistência adotando este protocolo com base no trabalho de Mokbel et al.6. Agradecemos também ao Dr. Sabine Jordan a ajuda para desenvolver e adotar este protocolo em nosso laboratório. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde R01s DK097164 e DK112927 para K.A.L.

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Scripps Research.
1. coleta e processamento de explantes do tecido muscular
<ol><li>O dia anterior à dissecção, esterilizar todos os equipamentos de dissecção (fórceps, lâminas de barbear e tesoura) e preparar todos os meios necessários: fosfato tampão salina (PBS), MB chapeamento de mídia (12,5 mL de DMEM, 12,5 mL de PRESUNTOS F12, 20 mL de calor-inativado fetal bovino soro (FBS), 5 mL de suplemento médio líquido amni...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

O músculo esquelético é vital para o estabelecimento e manutenção da homeostase metabólica11. O estudo da fisiologia muscular é complicado pela variabilidade interindividual, bem como dificuldade na obtenção de amostras, particularmente no caso de estudos humanos. Os miotubos preliminares cultivados foram mostrados para recapitular muitas características da fisiologia do músculo, incluindo a homeostase12do cálcio, regeneração do tecido danificado<sup class="xr...

Embora muitas vezes citado como uma indicação de saúde metabólica global, vários estudos mostraram que o índice de massa corporal (IMC) em idosos não está consistentemente associado com maior risco de mortalidade. Até o momento, o único fator que se mostrou consistente com a redução da mortalidade nessa população é o aumento da massa muscular1. O tecido muscular representa uma das maiores fontes de células sensíveis à insulina no corpo e, portanto, é crítico na manutenção da homeostase metabólica geral2. A ativação do tecido do músculo esqueletal através do exercício é associada com os aumentos na sensibilidade de insulin local e na saúde metabólica total3. Enquanto os modelos in vivo são essenciais para estudar a fisiologia muscular e o impacto da função muscular no metabolismo integrado, as culturas primárias dos miotubos fornecem um sistema tratável que reduz a complexidade dos estudos em animais.
Os mioblastos derivados de músculos pós-natais podem ser usados para estudar o impacto de inúmeras condições de tratamento e crescimento de forma altamente reprodutível. Isto tem sido reconhecido por muito tempo e diversos métodos para o isolamento e a cultura do mioblastos foram descritos4,5,6,7,8,9. Alguns destes métodos utilizam os músculos Neonatais e produzem números relativamente baixos de mioblastos,8,necessitando de vários animais para estudos de maior escala. Além disso, os métodos mais utilizados para a cultura de mioblasts usam "Pré-chapeamento" para enriquecer para os mioblastos, que são menos aderentes do que outros tipos de células. Nós encontramos o método alternativo do enriquecimento descrito aqui para ser muito mais eficiente e reprodutível para enriquecer uma população altamente proliferative do mioblastos. Em resumo, este protocolo permite o isolamento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares jovens adultos, através de conseqüência em meios de cultura. Myoblasts pode ser colhido repetidamente, sobre diversos dias, expandido ràpida, e induzido para diferenciar-se em myotubes. Este protocolo gera de forma revisível um grande número de células de mioblastos saudáveis que se diferenciam de forma robusta em miotubos espontâneamente espasmos. Nos permitiu estudar o metabolismo e os ritmos circadianos em miotubos primários de camundongos de uma variedade de genótipos. Finalmente, incluímos métodos para a preparação de miotubos para o estudo do metabolismo oxidativo, utilizando medições de taxas de consumo de oxigênio em placas de 96 poços.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Os mioblastos preliminares são precursores proliferating indiferenciados do músculo esqueletal. Eles podem ser cultivados e estudados como precursores musculares ou induzidos a se diferenciar em estágios posteriores do desenvolvimento muscular. O protocolo fornecido aqui descreve um método robusto para o isolamento e a cultura de uma população altamente proliferativa de células mioblastos de explantes de músculo esquelético do rato adulto jovem. Estas pilhas são úteis para o estudo das propriedades metabólicas do músculo esqueletal de modelos diferentes do rato, assim como em outras aplicações a jusante tais como o transfection com ADN exógeno ou a transdução com vetores da expressão viral. O nível de diferenciação e perfil metabólico dessas células depende do comprimento da exposição e da composição dos meios utilizados para induzir a diferenciação mioblástica. Estes métodos fornecem um sistema robusto para o estudo do metabolismo de células musculares do rato ex vivo. É importante ressaltar que, diferentemente dos modelos in vivo, os métodos aqui descritos fornecem uma população celular que pode ser expandida e estudada com altos níveis de reprodutibilidade.

Após a seção 1 do protocolo fornecido deve-se produzir células primárias emergindo dos explantes que serão visíveis um microscópio de luz padrão (Figura 2). Uma população heterogênea da pilha será vista crescer fora e em torno de cada explant do tecido do músculo. Os Myoblasts aparecerão como esferas pequenas, redondas, brilhantes. A seção 2 do protocolo produzirá colheitas precoces de mioblasts de explantes teciduais, que conterá poucas c?...

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Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Este é um protocolo para o isolamento das células-tronco do músculo do camundongo primário para o estudo do metabolismo ex vivo. Este protocolo fornece uma população muito maior de células-tronco em comparação com outros protocolos que tentamos no passado. E o mais importante, uma vez que diferenciamos essas células-tronco em motubes, elas exibem fisiologia normal, então coisas como ritmos circadianos.Ao tentar este procedimento pela primeira vez, tome notas detalhadas e salve várias imagens porque cada explantação de tecido parece diferente e haverá variação no crescimento dos míobios. Sem demonstração visual, é difícil saber se você está isolando as células corretas. Nós nos beneficiamos da generosa ajuda de outros que nos mostraram este método quando o estabelecemos em nosso laboratório.Depois de preparar o prato para dissecção de acordo com o manuscrito, prepare uma câmara úmida colocando duas a três folhas de papel absorvente grosso em um saco plástico e use uma pipeta para molhar a superfície do papel com água estéril. Coloque a câmara sob luz UV por cinco minutos para esterilizar. Disseque o músculo desejado de um rato de quatro a oito semanas de idade e enxágue suavemente em PBS contendo 40 microgramas por mililitro de gentamicina para esterilizar.Use fórceps estéreis para transferir o músculo para uma placa de Petri não revestida de 10 centímetros. Adicione 0,5 a um mililitro de mídia de chapeamento sobre o músculo de tal forma que o tecido esteja úmido, mas não flutuando. Use um bisturi estéril ou lâmina de barbear para cortar suavemente o músculo em pequenos fragmentos.Use fórceps ou uma pipeta para transferir os fragmentos musculares para a superfície de uma placa pré-revestida de seis centímetros. Sobreponha suavemente 0,8 mililitros adicionais de mídia de revestimento sobre o tecido. Coloque a antena de seis centímetros contendo os fragmentos musculares dentro da câmara úmida e devolva-a a uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.Prepare e pré-aqueça a mídia myoblast, trippsin e PBS-gentamicina em um banho de água a 37 graus Celsius. Para revestir um frasco T25 para cada grupo muscular, adicione dois mililitros de solução de revestimento à superfície do frasco, agite suavemente para criar uma camada uniforme na superfície e incubar o frasco a quatro graus Celsius por uma hora. Agora com uma pipeta, remova a mídia de chapeamento das explanações musculares e enxágue suavemente as explantas musculares com dois mililitros de PBS-gentamicina.Remova rapidamente o PBS e não deixe a placa sentar no PBS. Em seguida, adicione suavemente um mililitro de PBS-gentamicina e coloque a placa na incubadora Celsius de 37 graus por um minuto. Use uma pipeta P1000 para coletar o PBS com células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Em seguida, adicione um mililitro de trippsina à placa e devolva-a à incubadora Celsius de 37 graus por três minutos. Toque suavemente nas placas para desalojar os meus oblablados. Colete o trypsin com células e combine com a coleção PBS.Adicione oito mililitros de mídia myoblast ao tubo centrífuga e inverta suavemente para misturar. Sobreponha suavemente dois mililitros de solução de revestimento nas placas musculares e devolva as placas à incubadora Celsius de 37 graus. Gire os tubos de centrífuga contendo células em uma centrífuga por três minutos a 200 vezes g.Aspire o supernasal e mantenha aproximadamente um mililitro no tubo. Adicione suavemente a mídia myoblast, transfira as células para o frasco pré-revestido e coloque o frasco na incubadora Celsius de 37 graus. Aspire a mídia de frascos P0 myoblast T25.Enxágüe as células brevemente com dois mililitros de PBS-gentamicina quente e aspire o PBS do frasco. Pipeta dois mililitros de PBS quente em cada frasco contendo myoblasts. Coloque os frascos com PBS na incubadora Celsius de 37 graus por três minutos.Em seguida, toque firmemente o lado do frasco para desalojar as células. Verifique sob um microscópio leve para obter myoblasts livremente flutuantes. Coloque os frascos em pé em uma capa de cultura de tecido e enxágue a parte inferior dos frascos com 10 mililitros de mídia myoblast duas a três vezes para garantir que todas as células sejam desalojadas.Colete a mistura de mídia celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar por três minutos a 200 vezes g. Aspire a mídia para deixar em torno de um mililitro no tubo tendo cuidado para evitar a pelota celular.Adicione suavemente um volume apropriado de mídia myoblast ao tubo centrífuga e misture suavemente. Distribua a mistura celular para novos frascos T75 seis mililitros cada. Adicione 10 mililitros de mídia myoblast a cada novo frasco T75.Agite suavemente os frascos horizontalmente para distribuir as células e colocá-las na incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. Neste protocolo, as células primárias emergiram das explantas sob um microscópio de luz padrão. As primeiras colheitas de myoblasts apareceram como pequenas esferas redondas e brilhantes.A diferenciação dos míobios levou de quatro a seis dias durante os quais a morfologia das células mudou de esferas redondas únicas para fibras longas e fundidas. Foram render-se miotubes totalmente diferenciados que estavam prontos para a medição das taxas de consumo de oxigênio. Essas células podem ser usadas para uma série de aplicações a jusante.Por exemplo, frequentemente os usamos para estudar flauta de substrato em instrumentos de cavalo marinho.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...