Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Авторы благодарны д-ру Мэтью Уотту (Matthew Watt) из Мельбурнского университета и доктору Анастасии Кралли (Anastasia Kralli) из Университета Джонса Хопкинса за помощь в принятии этого протокола, основанного на работе Мокбеля и др.6. Мы также благодарим д-ра Сабину Джордан за помощь в разработке и принятии этого протокола в нашей лаборатории. Эта работа была профинансирована Национальными институтами здравоохранения R01s DK097164 и DK112927 в К.А.Л.

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными ВКП Scripps Research.
1. Сбор и обработка мышечных тканей Explants
<ol><li>За день до вскрытия стерилизовать все вскрытие оборудования (щипцы, лезвия бритвы и ножницы) и подготовить все необходимые носители: фосфат буферный соле...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

Скелетные мышцы имеют жизненно важное значение для создания и поддержания метаболического гомеостаза11. Изучение физиологии мышц осложняется межиндивидуальной изменчивостью, а также трудностями в получении образцов, особенно в случае человеческих исследований. Культур?...

Хотя часто цитируется в качестве признака общего метаболического здоровья, несколько исследований показали, что индекс массы тела (ИМТ) у пожилых людей не всегда связано с более высоким риском смертности. На сегодняшний день единственным фактором, который, как было показано, соответствует снижению смертности в этой популяции, является увеличение мышечной массы1. Мышечная ткань представляет собой один из крупнейших источников чувствительных к инсулину клеток в организме, и поэтому имеет решающее значение в поддержании общего метаболического гомеостаза2. Активация скелетной мышечной ткани с помощью физических упражнений связана с повышением чувствительности к местному инсулину и общего метаболического здоровья3. В то время как модели in vivo необходимы для изучения физиологии мышц и влияния мышечной функции на интегрированный метаболизм, первичные культуры миотубеб обеспечивают убираемую систему, которая снижает сложность исследований на животных.
Миобласты, полученные из послеродовых мышц, могут быть использованы для изучения влияния многочисленных условий лечения и роста в высоко воспроизводимым образом. Это уже давно признано и несколько методов для изоляции миобласти и культуры были описаны4,5,6,7,8,9. Некоторые из этих методов используют неонатальные мышцы и дают относительно небольшое количество миобластов5,8, требующих нескольких животных для более масштабных исследований. Кроме того, наиболее широко используемые методы культивирования миобластов используют «предварительное покрытие» для обогащения миобластов, которые менее привержены, чем другие типы клеток. Мы обнаружили, что альтернативный метод обогащения, описанный здесь, является гораздо более эффективным и воспроизводимым для обогащения высокопролиферативной популяции мизобластов. Таким образом, этот протокол позволяет изоляции высоко пролиферативных миобластов от молодых взрослых мышц explants, через нарост в культуре средств массовой информации. Myoblasts можно собрать повторно, над несколькими днями, быстро расширено, и наведено для того чтобы продифференцировать в myotubes. Этот протокол воспроизводит большое количество здоровых клеток миобласта, которые надежно дифференцируются в спонтанно подергивания миотубебий. Это позволило нам изучать метаболизм и циркадные ритмы в первичных миотубеусах мышей различных генотипов. Наконец, мы включаем методы подготовки миотубев для изучения окислительного метаболизма, используя измерения уровня потребления кислорода в 96-колодцах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Первичные миобласты являются недифференцированными пролиферирующими предшественниками скелетных мышц. Они могут быть культивированы и изучены в качестве предшественников мышц или индуцированных дифференцировать в более поздних стадиях развития мышц. Протокол, представленный здесь, описывает надежный метод изоляции и культуры высокопролиферативной популяции клеток миобласта от молодых взрослых вылабов мышц скелета мыши. Эти клетки полезны для изучения метаболических свойств скелетных мышц различных моделей мыши, а также в других приложениях вниз по течению, таких как трансфекция с экзогенной ДНК или трансдукция с вектором вирусного выражения. Уровень дифференциации и метаболического профиля этих клеток зависит от продолжительности воздействия, и состав средств массовой информации, используемых для индуцирования дифференциации миобластов. Эти методы обеспечивают надежную систему для изучения метаболизма мышечных клеток мыши ex vivo. Важно отметить, что, в отличие от моделей in vivo, описанные здесь методы обеспечивают популяцию клеток, которые могут быть расширены и изучены с высоким уровнем воспроизводимости.

После раздела 1 предусмотренного протокола должны давать первичные клетки, выходящие из эксплансов, которые будут видны под стандартным световым микроскопом(рисунок 2). Неоднородная популяция клеток будет рассматриваться растет из и окружающих каждо?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Myoblasts являются размножающимися клетками-предшественниками, которые дифференцируются, образуя полинуклиатые миотубины и в конечном итоге скелетные мышцы миофиберов. Здесь мы представляем протокол для эффективной изоляции и культуры первичных миобластов от молодых взрослых мышечных скелетных мышц. Метод позволяет молекулярные, генетические и метаболические исследования мышечных клеток в культуре.

Изоляция и дифференциация первичных миобластов от мышь скелетных мышц высасывания

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Это протокол для изоляции первичных стволовых клеток мышц мыши для изучения метаболизма ex vivo. Этот протокол обеспечивает гораздо большую популяцию стволовых клеток по сравнению с другими протоколами, которые мы пробовали в прошлом. И что важно, как только мы дифференцидим эти стволовые клетки на миотрубы, они демонстрируют нормальную физиологию, так что такие вещи, как циркадные ритмы.При попытке этой процедуры в первый раз, сделать подробные заметки и сохранить несколько изображений, потому что каждая ткань explant выглядит по-разному и не будет вариации в результате миобластов. Без визуальной демонстрации, трудно знать, если вы изолируете правильные клетки. Мы воспользовались щедрой помощью других людей, которые показали нам этот метод, когда мы создали его в нашей лаборатории.После подготовки блюда к вскрытию в соответствии с рукописью, подготовить влажную камеру, поместив два-три листа толстой абсорбющей бумаги в полиэтиленовый пакет и использовать пипетку, чтобы промокнуть поверхность бумаги стерильной водой. Поместите камеру под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут, чтобы стерилизовать. Вскрыть желаемую мышцу от четырех до восьми недель мыши и аккуратно промыть в PBS, содержащий 40 микрограмм на миллилитр гентамицин для стерилизации.Используйте стерильные типсы для переноса мышцы в стерильную 10-сантиметровую тарелку Петри без покрытия. Добавьте 0,5 к одному миллилитру покрытия мультимедиа над мышцей таким образом, чтобы ткань была влажной, но не плавающей. Используйте стерильный скальпель или лезвие бритвы, чтобы аккуратно нарезать мышцы небольшими фрагментами.Используйте типсы или пипетки для переноса фрагментов мышц на поверхность предварительно покрытой шестиметровой пластины. Очень мягко наложить дополнительные 0,8 миллилитров покрытия средств массовой информации над тканью. Поместите шестиметровую тарелку, содержащую фрагменты мышц, во влажную камеру и верните ее в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение 48 часов.Подготовка и довоенная миобласт сми, трипсин и PBS-гентамицин в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Чтобы покрыть колбу T25 для каждой группы мышц, добавьте два миллилитров раствора покрытия на поверхность колбы, осторожно встряхните, чтобы создать равномерною на поверхности, и инкубировать колбу при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Теперь с пипеткой, удалить покрытие средств массовой информации из мышц explants и осторожно промыть мышцы explants с двумя миллилитров PBS-гентамицин.Быстро удалите PBS и не позволяйте пластине сидеть в PBS. Затем аккуратно добавьте один миллилитр PBS-гентамицина и поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение одной минуты. Используйте P1000 пипетку для сбора PBS с клетками в 15 миллилитровую центрифугу трубки.Затем добавьте один миллилитр трипсина в тарелку и верните его в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Аккуратно коснитесь пластин, чтобы выбить миобласты. Соберите трипсин с клетками и объедините с коллекцией PBS.Добавить восемь миллилитров миобластных средств массовой информации в центрифугу трубки и осторожно инвертировать, чтобы смешать. Аккуратно наложить два миллилитров покрытия раствора на мышечные пластины и вернуть пластины в 37 градусов по Цельсию инкубатор. Спин центрифуг трубки, содержащие клетки в центрифуге в течение трех минут при 200 раз г.Аспирировать супернатант и держать примерно один миллилитр в трубке. Аккуратно добавьте миобластные средства массовой информации, перенесите клетки в предварительно покрытую колбу и поместите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Аспирировать средства массовой информации из P0 myoblast T25 колбы.Промыть клетки кратко с двумя миллилитров теплого PBS-гентамицин затем аспирировать PBS из колбы. Pipette два миллилитров теплого PBS в каждой колбе, содержащей миобласты. Поместите колбы с PBS в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение трех минут.Затем твердо коснитесь стороны колбы, чтобы выбить клетки. Проверьте под световым микроскопом свободно плавающие миобласты. Поместите колбы вертикально в капюшон культуры тканей и промыть дно колбы с 10 миллилитров миобластных средств массовой информации два-три раза, чтобы убедиться, что все клетки выбили.Соберите смесь клеточных медиа в 15-миллилитровую центрифугу. Центрифуга в течение трех минут при 200 раз г. Аспирировать средства массовой информации, чтобы оставить около одного миллилитра в трубке быть осторожным, чтобы избежать ячейки гранулы.Аккуратно добавьте соответствующий объем миобластных средств массовой информации в центрифугу трубки и аккуратно перемешать. Распределите клеточную смесь на новые колбы T75 по шесть миллилитров каждая. Добавьте 10 миллилитров миобластных средств массовой информации к каждой новой колбе T75.Аккуратно встряхните колбы горизонтально, чтобы распределить клетки и поместить их в инкубатор при 37 градусах по Цельсию на ночь. В этом протоколе, первичные клетки вышли из explants наблюдались под стандартным световым микроскопом. Ранние урожаи миобластов казались маленькими круглыми и яркими сферами.Дифференциация миобластов заняла от четырех до шести дней, в течение которых морфология клеток превратилась из одиночных круглых сфер в удлиненные слитые длинные многонуклеанные волокна. Были дифференцированы полностью миотрубы, которые были готовы к измерению показателей потребления кислорода. Эти ячейки могут быть использованы для ряда приложений вниз по течению.Например, мы часто используем их для изучения потока субстрата в приборах Seahorse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Выделение человеческих миобластов, оценка миогенной дифференциации и контроль потребления кальция в магазине

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Применение хронической стимуляции для изучения сократительной активности индуцированной крыса скелетных мышц Фенотипическая адаптация

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...