Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
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Los autores están agradecidos al Dr. Matthew Watt en la Universidad de Melbourne y a la Dra. Anastasia Kralli de la Universidad Johns Hopkins por la asistencia para adoptar este protocolo basado en el trabajo de Mokbel et al.6. También damos las gracias a la Dra. Sabine Jordan por su asistencia en el desarrollo y adopción de este protocolo en nuestro laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud R01s DK097164 y DK112927 a K.A.L.

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de Scripps Research.
1. Recolección y procesamiento de explantes de tejido muscular
<ol><li>El día anterior a la disección, esterilizar todos los equipos de disección (fórceps, cuchillas de afeitar y tijeras) y preparar todos los medios necesarios: solución salina tamponada de fosfato (PBS), MB Deplating (12,5 ml de DMEM, 12,5 ml de HAMS F12, 20 ml de bovina fetal inactivada por calor suero (FBS), 5 ml de suplemento medio de líquido am...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

El músculo esquelético es vital para el establecimiento y mantenimiento de la homeostasis metabólica11. El estudio de la fisiología muscular se complica por la variabilidad interindividual, así como la dificultad para obtener muestras, especialmente en el caso de estudios en humanos. Se ha demostrado que los miotubos primarios cultivados recapitulan muchas características de la fisiología muscular, incluyendo la homeostasis de calcio12,la regeneración del tejido mus...

Aunque a menudo se cita como una indicación de la salud metabólica general, múltiples estudios han demostrado que el índice de masa corporal (IMC) en adultos mayores no se asocia consistentemente con un mayor riesgo de mortalidad. Hasta la fecha, el único factor que ha demostrado ser consistente con la reducción de la mortalidad en esta población es el aumento de la masa muscular1. El tejido muscular representa una de las mayores fuentes de células sensibles a la insulina en el cuerpo, y por lo tanto es crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica general2. La activación del tejido muscular esquelético a través del ejercicio se asocia con aumentos tanto en la sensibilidad local a la insulina como en la salud metabólica general3. Mientras que los modelos in vivo son esenciales para estudiar la fisiología muscular y el impacto de la función muscular en el metabolismo integrado, los cultivos primarios de miotubos proporcionan un sistema manejable que reduce la complejidad de los estudios en animales.
Los mióblastos derivados de los músculos postnatales se pueden utilizar para estudiar el impacto de numerosas condiciones de tratamiento y crecimiento de una manera altamente reproducible. Esto ha sido reconocido durante mucho tiempo y se han descrito varios métodos para el aislamiento y el cultivo de mioblastos4,5,6,7,8,9. Algunos de estos métodos utilizan músculos neonatales y producen un número relativamente bajo de mioblastos5,8,que requieren varios animales para estudios a mayor escala. Además, los métodos más utilizados para el cultivo de mioblastos utilizan "pre-plating" para enriquecer los mioblastos, que son menos adherentes que otros tipos de células. Hemos encontrado que el método de enriquecimiento alternativo descrito aquí es mucho más eficiente y reproducible para enriquecer una población de mioblastos altamente proliferativos. En resumen, este protocolo permite el aislamiento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares adultos jóvenes, a través del crecimiento en los medios de cultivo. Los mióblastos se pueden cosechar repetidamente, durante varios días, expandirse rápidamente e inducirse a diferenciarse en miotubos. Este protocolo genera reproduciblemente un gran número de células de mioblasto sano que se diferencian sólidamente en miotubos de espasmos espontáneamente. Nos ha permitido estudiar el metabolismo y los ritmos circadianos en miotubos primarios de ratones de una variedad de genotipos. Por último, incluimos métodos para preparar miotubos para el estudio del metabolismo oxidativo, utilizando mediciones de las tasas de consumo de oxígeno en placas de 96 pocillos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Los mioblastos primarios son precursores proliferantes indiferenciados del músculo esquelético. Pueden ser cultivados y estudiados como precursores musculares o inducidos para diferenciarse en etapas posteriores del desarrollo muscular. El protocolo proporcionado aquí describe un método robusto para el aislamiento y el cultivo de una población altamente proliferativa de células mioblastecas de explantes musculares esqueléticos de ratón adulto joven. Estas células son útiles para el estudio de las propiedades metabólicas del músculo esquelético de diferentes modelos de ratón, así como en otras aplicaciones aguas abajo como la transfección con ADN exógeno o la transducción con vectores de expresión viral. El nivel de diferenciación y perfil metabólico de estas células depende de la duración de la exposición y de la composición de los medios utilizados para inducir la diferenciación de mioblastos. Estos métodos proporcionan un sistema robusto para el estudio del metabolismo de las células musculares de la ratón ex vivo. Es importante destacar que, a diferencia de los modelos in vivo, los métodos descritos aquí proporcionan una población celular que se puede ampliar y estudiar con altos niveles de reproducibilidad.

Siguiendo la Sección 1 del protocolo proporcionado debe producir células primarias que emergen de los explantes que serán visibles bajo un microscopio de luz estándar(Figura 2). Se verá una población de células heterogéneas creciendo fuera y rodeando cada explantación de tejido muscular. Los mióblastos aparecerán como esferas pequeñas, redondas y brillantes. Siguiendo la Sección 2 del protocolo producirá cosechas tempranas de mioblastos a partir...

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Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Este es un protocolo para el aislamiento de células madre musculares de ratón primario para el estudio del metabolismo ex vivo. Este protocolo proporciona una población mucho mayor de células madre en comparación con otros protocolos que hemos probado en el pasado. Y lo que es más importante, una vez que diferenciamos estas células madre en miotubos, exhiben fisiología normal, así como cosas como los ritmos circadianos.Al probar este procedimiento por primera vez, tome notas detalladas y guarde varias imágenes porque cada tejido explant se ve diferente y habrá variación en el crecimiento de los mióblastos. Sin demostración visual, es difícil saber si estás aislando las células correctas. Nos beneficiamos de la generosa ayuda de otras personas que nos mostraron este método cuando lo establecimos en nuestro laboratorio.Después de preparar el plato para la disección de acuerdo con el manuscrito, prepare una cámara húmeda colocando de dos a tres hojas de papel absorbente grueso en una bolsa de plástico y use una pipeta para mojar la superficie del papel con agua estéril. Coloque la cámara debajo de la luz UV durante cinco minutos para esterilizar. Diseccione el músculo deseado de un ratón de cuatro a ocho semanas de edad y enjuague suavemente en PBS que contiene 40 microgramos por mililitro de gentamicina para esterilizar.Utilice fórceps estériles para transferir el músculo a una placa estéril de Petri no recubierta de 10 centímetros. Añadir 0,5 a un mililitro de medios de chapado sobre el músculo de modo que el tejido esté húmedo pero no flotante. Usa un bisturí estéril o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente el músculo en pequeños fragmentos.Utilice fórceps o una pipeta para transferir los fragmentos musculares a la superficie de una placa pre-recubierta de seis centímetros. Superponga muy suavemente 0,8 mililitros de medios de chapado sobre el tejido. Coloque el plato de seis centímetros que contiene los fragmentos musculares dentro de la cámara húmeda y devuélvalo a una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.Preparar y precalentar medios de mioblast, trippsina y PBS-gentamicina en un baño de agua a 37 grados centígrados. Para recubrir un matraz T25 para cada grupo muscular, agregue dos mililitros de solución de recubrimiento a la superficie del matraz, agite suavemente para crear una capa uniforme en la superficie e incubar el matraz a cuatro grados Centígrados durante una hora. Ahora con una pipeta, retire el medio de chapado de los explantes musculares y enjuague suavemente los explantes musculares con dos mililitros de PBS-gentamicina.Retire rápidamente el PBS y no deje que la placa se siente en el PBS. A continuación, agregue suavemente un mililitro de PBS-gentamicina y coloque la placa en la incubadora de 37 grados Celsius durante un minuto. Utilice una pipeta P1000 para recoger el PBS con células en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.A continuación, agregue un mililitro de tripsina al plato y devuélvalo a la incubadora de 37 grados Celsius durante tres minutos. Toque suavemente las placas para desalojar los mioblastos. Recoja la tripina con las células y combínela con la colección PBS.Agregue ocho mililitros de medios de mioblast al tubo centrífugo e invierta suavemente para mezclar. Superponga suavemente dos mililitros de solución de chapado en las placas musculares y devuelva las placas a la incubadora de 37 grados Celsius. Gire los tubos centrífugos que contienen células en una centrífuga durante tres minutos a 200 veces g.Aspirar el sobrenadante y mantener aproximadamente un mililitro en el tubo. Agregue suavemente medios de mioblasto, transfiera las células al matraz pre-recubierto y coloque el matraz en la incubadora de 37 grados Celsius. Aspirar los medios de los matraces P0 myoblast T25.Enjuague brevemente las células con dos mililitros de PBS-gentamicina caliente y luego aspire el PBS del matraz. Pipetear dos mililitros de PBS caliente en cada matraz que contiene mioblastos. Coloque los matraces con PBS en la incubadora de 37 grados Celsius durante tres minutos.A continuación, toque firmemente el lado del matraz para desalojar las células. Compruebe bajo un microscopio de luz si hay mioblastos flotantes. Coloque los matraces en posición vertical en una capucha de cultivo de tejido y enjuague la parte inferior de los matraces con 10 mililitros de medios de mioblasto de dos a tres veces para asegurarse de que todas las células estén desalojadas.Recoger la mezcla de medios celulares en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar durante tres minutos a 200 veces g. Aspirar el medio para dejar alrededor de un mililitro en el tubo teniendo cuidado de evitar el pellet celular.Agregue suavemente un volumen adecuado de medios de mioblast al tubo centrífugo y mezcle suavemente. Distribuya la mezcla celular a los nuevos matraces T75 de seis mililitros cada uno. Agregue 10 mililitros de medios de mioblast a cada nuevo matraz T75.Agitar suavemente los matraces horizontalmente para distribuir las células y colocarlas en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. En este protocolo, las células primarias surgieron de los explantes se observaron bajo un microscopio de luz estándar. Las primeras cosechas de mioblastos aparecieron como pequeñas esferas redondas y brillantes.La diferenciación de los mioblastos tomó de cuatro a seis días durante los cuales la morfología de las células cambió de esferas redondas únicas a fibras multinómodas largas fusionadas alargadas. Se producieron miotubos totalmente diferenciados que estaban listos para medir las tasas de consumo de oxígeno. Estas células se pueden utilizar para un número de aplicaciones descendentes.Por ejemplo, con frecuencia los utilizamos para estudiar el flujo de sustrato en instrumentos de caballitos de mar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...