Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Författarna är tacksamma för Dr Matthew watt vid University of Melbourne och Dr Anastasia Kralli vid Johns Hopkins University för att få hjälp med att anta detta protokoll baserat på arbetet i Mokbel et al.6. Vi tackar också Dr Sabine Jordan för hjälp att utveckla och anta detta protokoll i vårt laboratorium. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health R01s DK097164 och DK112927 till K.A.L.

Detta protokoll följer djurskötsel riktlinjerna för Scripps Research.
1. insamling och bearbetning av muskelvävnad Explants
<ol><li>Dagen före dissektion, sterilisera alla dissektion utrustning (pincett, rakblad, och sax) och förbereda alla nödvändiga medier: fosfatbuffrad saltlösning (PBS), MB Pläteringsmaterial (12,5 mL av DMEM, 12,5 mL skinka F12, 20 mL Värmeinaktiverade fetalt nötkreatur serum (FBS), 5 mL av fostervatten medel tillägg), och beläggnings lösning (24 mL DMEM,...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

Skelettmuskulaturen är avgörande för upprättande och underhåll av metabolisk homeostas11. Studiet av muskelfysiologi kompliceras av interindividuell variabilitet, samt svårighet att få prover, särskilt när det gäller humanstudier. Odlade primära myotubes har visat sig recapitulate många funktioner i muskelfysiologi, inklusive kalcium homeostas12, förnyelse av skadad muskelvävnad5, metaboliska förändringar som svar på övning<sup clas...

Medan ofta nämns som en indikation på övergripande metabolisk hälsa, flera studier har visat att body mass index (BMI) hos äldre vuxna är inte konsekvent förknippad med högre risk för dödlighet. Hittills, den enda faktor som visat sig vara förenligt med minskad dödlighet i denna population är ökad muskelmassa1. Muskelvävnad representerar en av de största källorna till insulin känsliga celler i kroppen, och är därför avgörande för upprätthållandet av övergripande metabolisk homeostas2. Aktivering av skelettmuskulaturen vävnad via motion är förknippad med ökningar i både lokal insulinkänslighet och övergripande metabolisk hälsa3. Medan in vivo modeller är viktiga för att studera muskelfysiologi och effekterna av muskelfunktion på integrerad metabolism, primära kulturer av myotubes ger ett tractable system som minskar komplexiteten i djurstudier.
Myoblaster som härrör från postnatal muskler kan användas för att studera effekten av många behandlings-och tillväxtförhållanden på ett mycket reproducerbart sätt. Detta har länge erkänts och flera metoder för myoblast isolering och kultur har beskrivits4,5,6,7,8,9. Några av dessa metoder använder neonatal muskler och avkastning relativt lågt antal myoblasts5,8, kräver flera djur för större skala studier. Också, mest använda metoder för odling myoblaster använder "förplätering" att berika för myoblasts, som är mindre anhängare än andra celltyper. Vi har funnit den alternativa anriknings metoden som beskrivs här för att vara mycket mer effektiv och reproducerbar för berikande en mycket proliferativ myoblast population. Sammanfattnings, detta protokoll möjliggör isolering av mycket proliferativa myoblasts från unga vuxna muskel explants, via utväxt till kultur media. Myoblasts kan skördas upprepade gånger, under flera dagar, snabbt expanderat, och induceras för att differentiera till myotubes. Detta protokoll reproducerbart genererar ett stort antal friska myoblast celler som robust differentiera till spontant ryckningar myotubes. Det har gjort det möjligt för oss att studera metabolism och dygnsrytm i primära myotubes av möss i en mängd olika genotyper. Slutligen, vi inkluderar metoder för att förbereda myotubes för studiet av oxidativ metabolism, med mätningar av syreförbrukning i 96-bra tallrikar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Primära myoblasts är odifferentierade prolifererande prekursorer av skelettmuskulaturen. De kan odlas och studeras som muskelprekursorer eller induceras för att differentiera i senare stadier av muskelutveckling. Det protokoll som anges här beskriver en robust metod för isolering och kultur av en mycket proliferativ population av myoblast celler från unga vuxna mus skelettmuskel explants. Dessa celler är användbara för studiet av de metabola egenskaperna hos skelettmuskulaturen i olika möss modeller, liksom i andra nedströms applikationer såsom transfektion med exogent DNA eller transduktion med viral Expression vektorer. Graden av differentiering och metabolisk profil av dessa celler beror på längden av exponeringen, och sammansättningen av de medier som används för att inducera myoblast differentiering. Dessa metoder ger ett robust system för studiet av mus muskel cell metabolism ex vivo. Viktigare, till skillnad från in vivo modeller, de metoder som beskrivs här ger en cellpopulation som kan utökas och studeras med höga nivåer av reproducerbarhet.

I enlighet med avsnitt 1 i det tillhandahållna protokollet bör primärceller från de växter som kommer att synas under ett vanligt ljusmikroskop (figur 2) ges. En heterogen cellpopulation kommer att ses växa ut ur och runt varje muskelvävnad explant. Myoblasts kommer att visas som små, runda, ljusa sfärer. Efter avsnitt 2 i protokollet kommer att ge tidiga skördar av myoblaster från vävnad explants, som kommer att innehålla några celler och komme...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Myoblaster är prolifererande föregångare celler som differentierar för att bilda polynukleerade myotubes och så småningom skelettmuskel myofibers. Här presenterar vi ett protokoll för effektiv isolering och kultur av primära myoblasts från unga vuxna mus skelett muskler. Metoden möjliggör molekylära, genetiska och metaboliska studier av muskelceller i kulturen.

Isolering och differentiering av primära myoblasts från mus skelettmuskel Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Detta är ett protokoll för isolering av primära mus muskel stamceller för studier av metabolism ex vivo. Detta protokoll ger en mycket större population av stamceller jämfört med andra protokoll som vi har provat tidigare. Och viktigast av allt, när vi differentiera dessa stamceller i myotubes, de uppvisar normal fysiologi, så saker som dygnsrytm.När du försöker detta förfarande för första gången, ta detaljerade anteckningar och spara flera bilder eftersom varje vävnad explant ser annorlunda ut och det kommer att finnas variation i utväxten av myoblasts. Utan visuell demonstration är det svårt att veta om du isolerar rätt celler. Vi drog nytta av den generösa hjälpen från andra som visade oss denna metod när vi etablerade den i vårt labb.Efter att ha förberett skålen för dissektion enligt manuskriptet, förbereda en fuktig kammare genom att placera två till tre ark tjockt absorberande papper i en plastpåse och använda en pipett för att väta ytan av papperet med sterilt vatten. Placera kammaren i UV-belysning i fem minuter för att sterilisera. Dissekera den önskade muskeln från en fyra till åtta veckor gammal mus och skölj försiktigt i PBS som innehåller 40 mikrogram per milliliter gentamycin för att sterilisera.Använd sterila tärnor för att överföra muskeln till en steril 10 centimeter icke-belagd petriskål. Tillsätt 0,5 till en milliliter pläteringsmedia över muskeln så att vävnaden är fuktig men inte flytande. Använd en steril skalpell eller rakblad för att försiktigt skiva muskeln i små fragment.Använd tuppar eller en pipett för att överföra muskelfragmenten på ytan av en förbelagd sex centimeter platta. Mycket försiktigt överlägg ytterligare 0,8 milliliter pläteringsmedia över vävnaden. Placera sex centimeter skålen som innehåller muskelfragmenten inuti den fuktiga kammaren och returnera den till en inkubator på 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 48 timmar.Förbered och förkrigsförvar myoblast media, trypsin och PBS-gentamycin i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. För att belägga en T25-kolv för varje muskelgrupp, tillsätt två milliliter beläggningslösning på kolvens yta, skaka försiktigt för att skapa en jämn skikt på ytan och inkubera kolven i fyra grader Celsius i en timme. Nu med en pipett, ta bort plätering media från muskeln explants och försiktigt skölja muskeln explants med två milliliter PBS-gentamycin.Ta snabbt bort PBS och låt inte plattan sitta i PBS. Tillsätt sedan försiktigt en milliliter PBS-gentamycin och placera plattan i 37 grader Celsius inkubatorn i en minut. Använd en P1000-pipett för att samla in PBS med celler i ett centrifugrör på 15 milliliter.Därefter lägger du till en milliliter trypsin på plattan och returnera den till 37 graders Celsius inkubator i tre minuter. Knacka försiktigt på plattorna för att rubba myoblasterna. Samla trypsin med celler och kombinera med PBS-samlingen.Tillsätt åtta milliliter myoblast media till centrifugröret och försiktigt invertera för att blanda. Försiktigt överlägg två milliliter av pläteringslösning på muskelplattorna och återför plattorna till 37 grader Celsius inkubatorn. Snurra centrifugrören som innehåller celler i en centrifug i tre minuter vid 200 gånger g.Aspirera supernatanten och ha ungefär en milliliter i röret. Tillsätt försiktigt myoblast media, överför cellerna till den förbelagda kolven och placera kolven i 37 grader Celsius inkubatorn. Aspirera media från P0 myoblast T25 kolvar.Skölj cellerna kort med två milliliter varm PBS-gentamycin sedan aspirera PBS från kolven. Pipett två milliliter varm PBS i varje kolv som innehåller myoblasts. Placera kolvarna med PBS i 37 grader Celsius inkubatorn i tre minuter.Knacka sedan ordentligt på flaskans sida för att rubba cellerna. Kontrollera under ett ljusmikroskop för fritt flytande myoblasts. Placera kolvarna upprätt i en vävnadskulturhuva och skölj botten av kolvarna med 10 milliliter myoblastmedia två till tre gånger för att säkerställa att alla celler rubbas.Samla ihop cellmediablandningen i ett centrifugrör på 15 milliliter. Centrifugera i tre minuter vid 200 gånger g. Aspirera media att lämna runt en milliliter i röret vara noga med att undvika cell pelleten.Tillsätt försiktigt en lämplig volym myoblast media till centrifugröret och blanda försiktigt. Fördela cellblandningen till nya T75-kolvar sex milliliter vardera. Tillsätt 10 milliliter myoblastmedia till varje ny T75-kolv.Skaka kolvarna försiktigt horisontellt för att fördela cellerna och placera dem i inkubatorn i 37 grader Celsius över natten. I detta protokoll, primära celler framkommit från explants observerades under en standard ljus mikroskop. Tidiga skördar av myoblaster framträdde som små runda och ljusa sfärer.Differentiering av myoblasts tog fyra till sex dagar under vilken morfologi av cellerna ändras från enda runda sfärer till långsträckta smält långa multi-nucleated fibrer. Fullt differentierade myotubes gavs som var klara för mätning av syreförbrukningshastigheter. Dessa celler kan användas för ett antal nedströms applikationer.Till exempel använder vi ofta dem för att studera substratflöde i Seahorse instrument.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Upprättande och kultur Myogenic prekursorceller / Primära myoblaster från skelettmuskulatur av vuxna och äldre människor

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolering av typ I och typ II pericyter från muskelsmuskler

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Isolering av humana myoblaster, bedömning av myogen differentiering och butiksdriven kalciuminmatning

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolering, kultur och differentiering av benmärgens stromaceller och Osteoclast stamfäder från möss

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Tillämpningen av kronisk stimulering att studera kontraktila aktivitet-inducerad råtta skelettmuskulaturen fenotypiska anpassningar

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...