Name: isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants
Uploaded: 2019-10-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Yazarlar Melbourne Üniversitesi'nden Dr Matthew Watt ve Johns Hopkins Üniversitesi'nden Dr Anastasia Kralli yardım mokbel veark. 6çalışmalarına dayalı bu protokolü benimseyen için minnettarız. Ayrıca Dr. Sabine Jordan'a bu protokolün laboratuarımızda geliştirilmesi ve benimsenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01s DK097164 ve DK112927 tarafından K.A.L. tarafından finanse edilmiştir.

Bu protokol Scripps Research'ün hayvan bakım yönergelerine uyar.
1. Kas Dokusu Ekstremitelerinin Toplanması ve İşlenmesi
<ol><li>Diseksiyondan bir gün önce, tüm diseksiyon ekipmanlarını (forsepsler, jiletler ve makaslar) sterilize edin ve gerekli tüm ortamları hazırlayın: fosfat tamponlu salin (PBS), MB Kaplama ortam (DMEM'in 12,5 mL'si, 12,5 mL HAMS F12, 20 mL ısı yalıtımlı fetal sığır serum (FBS), amniyotik sıvı orta takviyesi 5 mL ve Kaplama Çözeltisi (DMEM 24 m...

<ol>
	<li>Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+mass+index+as+a+predictor+of+longevity+in+older+adults.">Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults.</a> American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).</li><li>Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+glucose+flux+into+muscle+in+vivo.">The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).</li><li>Sj&#248;berg, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+increases+human+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+via+coordinated+increases+in+microvascular+perfusion+and+molecular+signaling.">Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling.</a> Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).</li><li>Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+signaling+regulates+proliferation,+differentiation,+and+myotube+size+in+C2C12+skeletal+muscle+cells.">Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells.</a> Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).</li><li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+skeletal+muscle+microexplant+culture+and+isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).</li><li>Mokbel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K7del+is+a+common+TPM2+gene+mutation+associated+with+nemaline+myopathy+and+raised+myofibre+calcium+sensitivity.">K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity.</a> Brain. 136 (2), 494-507 (2013).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li><li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+myoblast+purification,+characterization,+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy.">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li><li>Musar&#242;, A., Carosio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Satellite+Cells+from+Mouse+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).</li><li>Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+mitochondrial+respiration+as+an+indicator+of+cellular+metabolism+and+fitness.">Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness.</a> Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).</li><li>Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+role+of+myostatin+in+skeletal+muscle+and+whole+body+homeostasis.">The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis.</a> Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).</li><li>Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+murine+myotubes+as+a+model+for+investigating+muscular+dystrophy.">Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy.</a> BioMed Research International. , (2015).</li><li>Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+C+2+C+12+myotube+model+for+studying+exercise-inducible+responses+in+skeletal+muscle.">Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).</li><li>Chen, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+activation+of+AMP-kinase+and+fatty+acid+oxidation+by+globular+adiponectin+in+cultured+human+skeletal+muscle+of+obese+type+2+diabetics.">Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).</li><li>Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+muscle+cells+from+lysosomal+&#945;-glucosidase+deficient+mice:+A+new+tool+to+study+pathophysiology+and+assess+therapeutic+strategies+for+Pompe+disease.">Immortalization of murine muscle cells from lysosomal &#945;-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).</li><li>Varga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+elasticity+of+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).</li><li>Kriebs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+repressors+CRY1+and+CRY2+broadly+interact+with+nuclear+receptors+and+modulate+transcriptional+activity.">Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perm1+enhances+mitochondrial+biogenesis,+oxidative+capacity,+and+fatigue+resistance+in+adult+skeletal+muscle.">Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle.</a> FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).</li></ol>

İskelet kası metabolik homeostazın kurulması ve bakımı için hayati önem taşımaktadır11. Kas fizyolojisi çalışması, bireyler arası değişkenlik ve özellikle insan çalışmaları söz konusu olduğunda örnek almada güçlük nedeniyle karmaşıktır. Kültürlü primer miyotüpler kas fizyolojisi birçok özelliği recapitulate gösterilmiştir, kalsiyum homeostaz dahil12, hasarlı kas dokusunun rejenerasyon5, egzersiz yanıt metabo...

Genellikle genel metabolik sağlığın bir göstergesi olarak atıfta bulunulsa da, birden fazla çalışma, yaşlı erişkinlerde vücut kitle indeksi (VKİ) sürekli mortalite yüksek risk ile ilişkili olmadığını göstermiştir. Bugüne kadar, bu popülasyonda azaltılmış mortalite ile tutarlı olduğu gösterilen tek faktör kaskütlesi1 artmıştır. Kas dokusu vücuttaki insülin duyarlı hücrelerin en büyük kaynaklarından birini temsil eder, ve bu nedenle genel metabolik homeostazbakımındakritik 2 . Egzersiz yoluyla iskelet kas dokusunun aktivasyonu hem lokal insülin duyarlılığı hem de genel metabolik sağlık artışlar ile ilişkilidir3. In vivo modelleri kas fizyolojisi ve entegre metabolizma üzerinde kas fonksiyonunun etkisi eğitimi için gerekli iken, miyotüplerin birincil kültürleri hayvan çalışmalarının karmaşıklığını azaltan bir sistem sağlar.
Doğum sonrası kaslardan elde edilen miyoblastlar, çok sayıda tedavi ve büyüme koşullarının etkisini son derece tekrarlanabilir bir şekilde incelemek için kullanılabilir. Bu uzun ve myoblast izolasyon ve kültür için çeşitli yöntemler4,5,6,7,8,9tarif edilmiştir kabul edilmiştir. Bu yöntemlerden bazıları yenidoğan kasları kullanmak ve miyoblastlar nispeten düşük sayıda verim5,8, büyük ölçekli çalışmalar için çeşitli hayvanlar gerektiren. Ayrıca, miyoblastların kültüre getirilmesinde en yaygın kullanılan yöntemler, diğer hücre türlerine göre daha az yapışık olan miyoblastlar için zenginleştirmek için "ön kaplama" yöntemini kullanır. Burada açıklanan alternatif zenginleştirme yönteminin, son derece çoğalan miyoblast popülasyonunu zenginleştirmek için çok daha verimli ve tekrarlanabilir olduğunu gördük. Özetle, bu protokol, genç erişkin kas eksperlerinden son derece çoğalan miyoblastların kültür ortamına büyüme yoluyla izolasyonuna olanak sağlamaktadır. Miyoblastlar tekrar tekrar hasat edilebilir, birkaç gün içinde, hızla genişletilmiş, ve miyotüpler içine ayırt etmek için indüklenen. Bu protokol, spontan seğirme miyotüpleri sevese doğru sağlam bir şekilde ayıran çok sayıda sağlıklı miyoblast hücresi üretir. Çeşitli genotiplere sahip farelerin primer miyotubelarında metabolizma ve sirkadiyen ritimleri incelememizi sağladı. Son olarak, 96 kuyulu plakalarda oksijen tüketim oranlarının ölçümlerini kullanarak miyotüplerin oksidatif metabolizma çalışmaları için hazırlanmasına yönelik yöntemleri de sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coating Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB40234A</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoblast Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td>10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 &#176;C water bath for 20 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12556023</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAMS F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-615F</td>
			<td>Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41400045</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td>Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21427-648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15mL)</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Consumption Rates:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>96-well plates for use in XFe96 Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103015-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102720-100</td>
			<td>components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283-5G</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>for measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td>used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants

Primer miyoblastlar iskelet kasının farklılaşmamış çoğalan öncüleridir. Onlar kültürlü ve kas öncüleri olarak çalışılmış veya kas gelişiminin daha sonraki aşamalarında ayırt etmek için indüklenen. Burada sağlanan protokol, genç yetişkin fare iskelet kas ekstrandan mıyoblast hücrelerinin son derece çoğalan popülasyonunun izolasyonu ve kültürü için sağlam bir yöntem tanımlanmaktadır. Bu hücreler farklı fare modellerinin iskelet kasının metabolik özelliklerinin yanı sıra eksojen DNA ile transfeksiyon veya viral ekspresyon vektörleri ile transdüksiyon gibi diğer downstream uygulamalarında da yararlıdır. Bu hücrelerin farklılaşma ve metabolik profil düzeyi maruz kalma uzunluğuna ve miyoblast farklılaşmasını sağlamak için kullanılan ortamın bileşimine bağlıdır. Bu yöntemler fare kas hücre metabolizması ex vivo çalışması için sağlam bir sistem sağlar. Daha da önemlisi, in vivo modellerinaksine, burada açıklanan yöntemler genişletilebilir ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde çalışılabilir bir hücre popülasyonu sağlar.

Sağlanan protokolün Bölüm 1'inden sonra, standart bir ışık mikroskobu altında görülebilecek eksplants'lerden çıkan birincil hücreler sağlamalıdır(Şekil 2). Heterojen bir hücre popülasyonu dışarı büyüyen ve her kas dokusu ekstrüzyon çevreleyen görülecektir. Miyoblastlar küçük, yuvarlak, parlak küreler olarak görünür. Protokolün 2. Protokolün 3. Protokolün Bölüm 4'ü takip ederek daha fazla d...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Bu metabolizma ex vivo çalışması için birincil fare kas kök hücrelerinin izolasyon için bir protokoldür. Bu protokol, geçmişte denediğimiz diğer protokollere kıyasla çok daha büyük bir kök hücre popülasyonu sağlıyor. Ve daha da önemlisi, bu kök hücreleri miyotubelara ayırdığımızda, normal fizyolojisergilerler, yani sirkadiyen ritimler gibi şeyler.Bu yordamı ilk kez denerken, ayrıntılı notlar alın ve çeşitli görüntüler kaydedin, çünkü her doku ekstronu farklı görünür ve miyoblastların büyümesinde farklılıklar olacaktır. Görsel gösterim olmadan, doğru hücreleri izole edip olmadığınızı bilmek zordur. Laboratuarımızda kurduğumuzda bize bu yöntemi gösteren başkalarının cömert yardımlarından faydalandık.El yazmasına göre diseksiyon için çanak hazırladıktan sonra, plastik bir torba içine kalın emici kağıt 2-3 yaprak yerleştirerek nemli bir hazne hazırlamak ve steril su ile kağıt yüzeyini ıslatmak için bir pipet kullanın. Sterilize etmek için beş dakika boyunca UV ışığı altında oda yerleştirin. İstenilen kası dört ila sekiz haftalık bir fareden ayırın ve sterilize etmek için mililitre gentamisin başına 40 mikrogram içeren PBS'de hafifçe durulayın.Kası steril 10 santimetre kaplamasız Petri kabına aktarmak için steril çömeçler kullanın. Doku nemli ama yüzen değil kas üzerinde kaplama medya 0,5 ila bir mililitre ekleyin. Hafifçe küçük parçalar halinde kas dilim için steril bir neşter veya jilet kullanın.Kas parçalarını önceden kaplanmış altı santimetrelik bir plakanın yüzeyine aktarmak için forceps veya pipet kullanın. Çok yavaşça doku üzerinde kaplama medya ek 0.8 mililitre bindirme. Nemli oda içinde kas parçaları içeren altı santimetre çanak yerleştirin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir kuvöz e ve döndürün.Hazırlamak ve 37 santigrat derece bir su banyosunda myoblast medya, tripsin ve PBS-gentamycin preWarm. Her kas grubu için bir T25 şişesi kaplamak için, şişenin yüzeyine iki mililitre kaplama çözeltisi ekleyin, yüzeyde eşit bir kat oluşturmak için hafifçe sallayın ve şişeyi bir saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Şimdi bir pipet ile, kas ekstrelerinden kaplama medya kaldırmak ve yavaşça PBS-gentamycin iki mililitre ile kas ekstreleri durulayın.PBS'yi hızlıbir şekilde çıkarın ve plakanın PBS'de olmasına izin vermeyin. Sonra yavaşça PBS-gentamycin bir mililitre ekleyin ve bir dakika için 37 derece Santigrat inkübatör plaka yerleştirin. 15 mililitrelik bir santrifüj tüp içine hücreleri ile PBS toplamak için bir P1000 pipet kullanın.Sonra, tabağa bir mililitre tripsin ekleyin ve 37 santigrat derece kantire üç dakika geri verin. Miyoblastları çıkarmak için plakalara hafifçe dokunun. Hücrelerle tripsin toplamak ve PBS koleksiyonu ile birleştirmek.Santrifüj tüpüne sekiz mililitre miyoblast media ekleyin ve karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Kas plakalarına iki mililitre kaplama çözeltisini yavaşça yerleştirin ve plakaları 37 derece santigrat inkübatöre geri döndürün. 200 kez g üç dakika boyunca bir santrifüj içinde bir santrifüj içinde hücreleri içeren santrifüj tüpler spin.Supernatant aspire ve tüp yaklaşık bir mililitre tutun. Yavaşça miyoblast media ekleyin, önceden kaplanmış şişe hücreleri aktarın ve 37 derece Santigrat inkübatör şişe yerleştirin. P0 myoblast T25 şişelerinden medya aspire.Hücreleri iki mililitre sıcak PBS-gentamisin ile kısa bir süre durulayın ve ardından pbs'yi şişeden aspire edin. Pipet miyoblastlar içeren her şişe içine sıcak PBS iki mililitre. PBS ile şişeleri 37 santigrat derece kuluçka içine üç dakika yerleştirin.Sonra sıkıca hücreleri yerinden için şişenin yan dokunun. Serbestçe yüzen miyoblastlar için hafif bir mikroskop altında kontrol edin. Şişeleri bir doku kültürü başlığına dik olarak yerleştirin ve tüm hücrelerin yerinden edilmesini sağlamak için 10 mililitre miyoblast media ile şişelerin altını 2-3 kez durulayın.Hücre ortam karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. 200 kez g üç dakika santrifüj. Aspire medya hücre pelet önlemek için dikkatli olmak tüp içinde bir mililitre civarında bırakmak için.Santrifüj tüpüne uygun miktarda miyoblast ortamını hafifçe ekleyin ve hafifçe karıştırın. Hücre karışımını her biri altı mililitre yeni T75 şişesine dağıtın. Her yeni T75 şişesine 10 mililitre miyoblast medya ekleyin.Hücreleri dağıtmak için şişeleri yatay olarak hafifçe sallayın ve bir gecede 37 santigrat derecede kuvöze yerleştirin. Bu protokolde eksantilerden çıkan primer hücreler standart ışık mikroskobu altında gözlenmiştir. Miyoblastların erken hasat küçük yuvarlak ve parlak küreler olarak ortaya çıktı.Miyoblastların farklılaşması, hücrelerin morfolojisinin tek yuvarlak kürelerden uzun uzun erimiş çok çekirdekli liflere dönüştüğü dört ila altı gün sürdü. Oksijen tüketim oranlarının ölçülmelerine hazır olan tam diferansiye miyotüpler ivedilikle vermiştir. Bu hücreler bir dizi akış aşağı uygulamaları için kullanılabilir.Örneğin, biz sık sık Seahorse aletleri substrat akı çalışma için kullanabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...