该方法的目的是产生一个免疫突触，这是一个细胞与细胞结合的例子，由抗原呈现细胞和T-帮助淋巴细胞形成。我们的目标是记录免疫突触形成的第一阶段，并记录在T-帮助淋巴细胞中发生的贩运事件。这些最终将导致免疫突触的两极分化分泌。
此处介绍的方法涉及细胞到细胞的结合、延时采集、广场荧光显微镜以及后续的图像处理。这提高了图像的声噪比，提高了时间分辨率，并允许在新兴突触结合中同时采集多个氟化物，并减少荧光漂白。此外，该协议与端点细胞固定协议兼容，允许免疫荧光染色和分析。
该协议还与激光扫描荧光显微镜和其他最先进的显微镜技术兼容。展示这个程序的将是安娜·贝洛，一个研究生，亚历杭德罗·加里多，一个技术员，和索朗格·莫雷诺，一个研究生。要开始此过程，在 8 个微井室滑梯的每个井中加入 150 微升的纤维素，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟到 1 小时。
孵育期后，用200微升PVS清洗每井，轻轻摇动两分钟。再次重复此洗涤，将第二次洗涤留在井中。将 Raji 细胞的汇合预培养的 10 毫升转移到 15 毫升 V 底管。
在300倍G下离心，在室温下离心5分钟。丢弃上一提液，以每毫升100万细胞的浓度，轻轻地将细胞颗粒重新在温暖、完整的培养中等中。要给Raji细胞贴上标签，请将培养基中所需数量的细胞转移到两毫升管。
对于八个微井室滑动，总共需要1.6毫升的细胞悬浮液。将细胞跟踪器蓝色添加到 10 微摩尔的最终浓度中。重新悬浮细胞跟踪器蓝色染色细胞，将细胞悬浮液的200微升转移到准备好的纤维素涂层腔室幻灯片的每个井中。
用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵化室内滑动，30分钟到1小时。之后，轻轻摇动显微镜上的腔室，以确保Raji细胞得到粘附。用温暖、完整的细胞培养培养培养器仔细清洗每个井，以消除多余的细胞跟踪器蓝色。
确保 Raji 细胞粘附在板的底部，并且它们彼此之间显示间隙，并且它们不汇合。50-60%的细胞汇合是适当的。首先，将葡萄球菌肠毒素E以每毫升1微克的浓度添加到每口井中。
确保Raji细胞用超抗原脉冲，否则来自Jurkat细胞的T细胞受体将不能识别SCE，突触不会形成。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵化室内滑梯，至少30分钟。接下来，以每毫米100万至200万个细胞的浓度获得以前生长的Jurkat细胞培养。
在相对比显微镜下观察细胞，然后将细胞转移到15毫升V底管。在300倍G下离心，在室温下离心5分钟。丢弃上一直液，以每毫升100万个细胞的浓度轻轻地在温暖、完整的培养培养中重新暂停细胞。
然后将培养中的Jurkat细胞保持在37摄氏度，并吸收5%的二氧化碳，直到准备好使用。从培养箱中检索包含细胞跟踪器蓝色标记的葡萄球菌肠毒素 E 脉冲粘附的 Raji 细胞的腔室幻灯片。小心地从每一个井中吸出培养介质，将移液器放在井的一角。
立即用细胞培养培养培养的200微升的重新释放的Jurkat细胞取代该培养物。如果正在执行时间推移，请快速进入显微镜。在显微镜分期侍者上找到室滑梯，并选择一些合适的字段。
在成像前准备显微镜和孵化室。将Jurkat细胞添加到每个含有Raji细胞的井中后，快速找到预热显微镜上微井室幻灯片，并选择一些XY位置。如果只计划进行终点实验，在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵化腔室，一到两个小时。
在培养期之后，检查偶联形成，然后修复文本协议中概述的偶联体。要修复电池，请添加不带 FCS 的暖 RPMI 并轻轻摇动。吸气RMPI，并添加200微升的PFA或预冷丙酮到每一个井。
在室温下或冰上孵育腔室滑梯20分钟。然后用 PVS 洗两次每孔，并加入 200 微升淬火溶液。在这项研究中，Jurkat-Raji免疫突触结合产生，免疫突触形成的早期阶段被正确成像。
此策略诱导免疫突触的形成，同时执行时间推移成像。此处显示了从该技术获得的代表突触 Jurkat-Raji 结合，包括传输通道的图像、细胞跟踪器蓝色通道以及这两个通道的合并。可以看到一些突触结合物，包括那些只由一个Jurkat细胞和几个Raji细胞组成，这是复杂的结合物。
细胞浓度的降低将绕过复杂细胞结合的形成，但可能无法提供足够的细胞结合，以便随后分析极化交通，进而减少发现和成像新兴突触结合的机会。使用宽场光学选项和适当的光学参数，使用适当的去卷积软件执行 GFP-CD63 荧光通道图像的去卷积。此除算通道随后合并到单元格跟踪器蓝色宽通道。
信噪比和锐度都有了提高。此处显示了固定免疫突触结合的代表性 Z 堆栈。使用 phaloidin 进行免疫荧光，以可视化 F-actin，抗 CD63 可视化 MVB，防伽马-图布林可视化 MTOC，而细胞跟踪器蓝色标记 Raji 细胞。
Jurkat 细胞的可选转换将允许在活细胞中对分泌颗粒的流量进行可视化。例如，当表示 GFP-CD63 时，可以记录 GFP-CD63 装饰囊泡的运动。该协议与端点固定协议兼容，允许进一步的免疫荧光染色协议和分析。
生产力实验模型的存在，可以简化免疫突触的成像，但这些模型不模仿抗原演示细胞的复杂和不规则的表面，这些表面可能在免疫突触上产生非生理相互作用。此处描述的方法适合在免疫突触中重现和确认一些生物复杂性。Superantigen 是一种危险的毒素，所以请务必戴上手套，将用过的尖端掉在危险盒上。
