Formålet med metoden er at generere en immunologisk synapse, som er et eksempel på celle-til-celle bøjning dannet af en antigen-præsenterende celle og en T-hjælper lymfocyt. Vores mål er at registrere de første faser af immunsynapsedannelsen og at registrere de menneskehandelshændelser, der forekommer i T-hjælperens lymfocyt. Disse i sidste ende vil føre til polariseret sekretion på immun synapse.
Den tilgang, der præsenteres her indebærer celle-til-celle bøjning, time-lapse erhvervelse, wide-field fluorescens mikroskopi, og efterfølgende billedbehandling. Dette forbedrer signal-støj forholdet mellem billederne, forbedrer den tidsmæssige opløsning, og giver mulighed for samtidig erhvervelse af flere fluorochromes i nye synaptiske konjugater og reducerer fluorescens blegning. Desuden er protokollen kompatibel med slutpunktscellefikseringsprotokoller, der tillader immunfluorescensfarvning og analyse.
Denne protokol er også kompatibel med laserscanning fluorescerende mikroskopi og andre state-of-the-art mikroskopi teknikker. Demonstration af proceduren vil være Ana Bello, en kandidat studerende, Alejandro Garrido, en tekniker, og Solange Moreno, en kandidat studerende. For at begynde denne procedure, tilføje 150 mikroliter fibronectin til hver brønd af en otte mikroopkammer dias og inkubere det ved 37 grader Celsius i 30 minutter til en time.
Efter inkubationstiden, aspirere fibronectin og vask hver brønd med 200 mikroliter PVS i to minutter med blid omrystning. Gentag denne vask igen og lad den anden vask i brønden. Overfør 10 milliliter af en sammenløbet preculture af Raji celler til en 15 milliliter V-bund rør.
Centrifuge ved 300 gange G og ved stuetemperatur i fem minutter. Kassér supernatanten og opslæm forsigtigt cellepelletten i varmt, komplet medium i en koncentration på 1 million celler pr. milliliter. Hvis du vil mærke Raji-cellerne, skal du overføre det nødvendige antal celler i kulturmedium til et to milliliterrør.
For de otte mikrowell kammer dias, i alt 1,6 milliliter celle suspension er nødvendig. Tilføj celle tracker blå til en endelig koncentration af 10 mikromolar. Opsaltning af celletrackeren blåfarvede celler og overfør 200 mikroliter af cellesuspensionen til hver brønd af de forberedte fibronectinbelagte kammerdias.
Inkuber kammeret dias ved 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid i 30 minutter til en time. Derefter rystes kammerdiasene forsigtigt på mikroskopet for at sikre, at Raji-cellerne overholdes. Vask hver godt omhyggeligt med varm, komplet cellekultur medium for at fjerne overskydende celle tracker blå.
Sørg for, at Raji cellerne er klæbet til bunden af pladerne, og de viser huller mellem hinanden, og de er ikke sammenløbet. 50-60% af celle sammenløb er passende. Først tilsættes Staphylococcal Enterotoxin E i en koncentration af et mikrogram pr. milliliter til hver brønd.
Sørg for, at Raji celler er pulserende med superantigen ellers T-celle receptor fra Jurkat celler vil ikke genkende SCE og synapse vil ikke blive dannet. Inkuber kammeret dias ved 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid i mindst 30 minutter. Dernæst opnå en tidligere voksende kultur af Jurkat celler ved en koncentration mellem 1 og 2 millioner celler pr millimeter.
Overhold cellerne under et fasekontrastmikroskop, og overfør derefter cellerne til et 15 milliliter V-bundrør. Centrifuge ved 300 gange G og ved stuetemperatur i fem minutter. Kassér supernatanten og opslæm forsigtigt cellerne i varmt, komplet kulturmedium i en koncentration på 1 million celler pr. milliliter.
Derefter opretholde Jurkat celler i kultur på 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid, indtil klar til brug. Hent kammerdiasene, der indeholder cellesporingen, der er blåt mærket Staphylococcus Enterotoxin E pulserende Raji-celler fra kuvøsen. Inspirer forsigtigt kulturmediet fra hver brønd en efter en med en pipette placeret i et hjørne af brønden.
Straks erstatte mediet med 200 mikroliter af de resuspenderede Jurkat celler i cellekultur medium. Hvis der udføres en tidsforfald, skal du hurtigt gå videre til mikroskopet. Find den chambered dias på mikroskop midlertidig tjener og vælge nogle relevante felter.
Forbered mikroskopet og inkubationskammeret før billeddannelse. Efter Jurkat celler er blevet tilføjet til hver brønd, der indeholder Raji celler, hurtigt finde microwelled kammer dias på forvarmet mikroskop iscenesat inkubator og vælge nogle XY positioner. Hvis kun et slutpunkt eksperiment er planlagt, inkubere kammeret dias på 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid i en til to timer.
Efter kulturperioden skal du kontrollere for konjugatdannelse og efterfølgende fastsætte konjugaterne som beskrevet i tekstprotokollen. For at fastgøre cellerne, tilsæt varm RPMI uden FCS og ryst forsigtigt. Aspirere RMPI og tilsæt 200 mikroliter af enten PFA eller prechilled acetone til hver brønd.
Kammeret inkuberes ved stuetemperatur eller på is i 20 minutter. Vask derefter hver brønd to gange med PVS og tilsæt 200 mikroliter af dæmpningsopløsning. I denne undersøgelse genereres Jurkat-Raji immunsynapsekonjugates, og de tidlige stadier af immunologisk synapsedannelse er korrekt afbildet.
Denne strategi inducerer den immunologiske synapse dannelse samtidig udfører tidsforfald billeddannelse. Repræsentative synaptiske Jurkat-Raji konjugater opnået fra denne teknik er vist her, herunder et billede af transmittance kanal, cellen tracker blå kanal, og begge disse kanaler fusioneret. Nogle synaptiske konjugater kan ses, herunder dem, der består af kun én Jurkat celle og flere Raji celler, som er komplekse konjugater.
Faldende cellekoncentrationer vil omgå dannelsen af komplekse cellulære konjugater, men kan ikke give nok cellekonjugater til den efterfølgende analyse af polariseret trafik, hvilket igen vil mindske chancerne for at finde og billedet nye synaptiske konjugater. En deconvolution af GFP-CD63 fluorescens kanal billeder udføres med en passende deconvolution software ved hjælp af wide field optisk option og den korrekte optiske parametre. Denne deconvoluted kanal blev efterfølgende fusioneret til cellen tracker blå bred kanal.
Der er en forbedring af både signal-støj-forholdet og skarpheden. En repræsentativ Z stak af en fast immunologisk synapse konjugat er vist her. Immunofluorescens udføres ved hjælp af falloidin at visualisere F-actin, anti-CD63 at visualisere MVB, og anti-gamma-tubulin at visualisere MTOC, mens celle tracker blå mærket Raji celler.
Den valgfri transfixing af Jurkat celler vil gøre det muligt at visualisere trafikken af sekretoriske granulat i levende celler. For eksempel, når GFP-CD63 er udtrykt, bevægelsen af GFP-CD63-dekoreret vesikler kan registreres. Protokollen er kompatibel med slutpunktsfikseringsprotokoller, der vil tillade yderligere immunfluorescensfarvningsprotokoller og analyser.
Produktivitet eksperimentelle modeller findes, der kan forenkle billeddannelse i immun synapse, men disse modeller ikke emulere den komplekse og uregelmæssige overflade på antigen-studievært celler, der kan producere ikke-fysiologiske interaktioner på immun synapse. Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, er egnet til at reproducere og bekræfte nogle biologiske kompleksiteter, der forekommer på immunsynapsen. Superantigen er et farligt toksin, så sørg for at bære handsker, og slip den brugte spids på den farlige boks.
