इमेजिंग मानव इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स

विधि का उद्देश्य एक इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स उत्पन्न करना है जो एंटीजन-पेश करने वाले सेल और टी-हेल्पर लिम्फोसाइट द्वारा गठित सेल-टू-सेल संयुग्मण का एक उदाहरण है। हमारा उद्देश्य प्रतिरक्षा सिनेप्स गठन के पहले चरणों को रिकॉर्ड करना और टी-हेल्पर लिम्फोसाइट में होने वाली तस्करी की घटनाओं को रिकॉर्ड करना है। ये अंततः प्रतिरक्षा सिनेप्स पर ध्रुवीकृत स्राव का कारण बनेंगे।

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण सेल-टू-सेल संवर्जेशन, समय-चूक अधिग्रहण, व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, और बाद में छवि प्रसंस्करण शामिल है । यह छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करता है, अस्थायी संकल्प को बढ़ाता है, और उभरते सिनैप्टिक संजूगेट में कई फ्लोरोक्रोम के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देता है और फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग को कम करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल अंत बिंदु सेल निर्धारण प्रोटोकॉल के साथ संगत है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और विश्लेषण की अनुमति देगा।

यह प्रोटोकॉल लेजर स्कैनिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और अन्य अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ भी संगत है। प्रक्रिया का प्रदर्शन एना बेलो, एक स्नातक छात्र, एलेजैंड्रो गार्रिडो, एक तकनीशियन, और सोलंगे मोरेनो, एक स्नातक छात्र होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, एक आठ माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में फाइब्रोनेक्टिन के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 30 मिनट से एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

इनक्यूबेशन अवधि के बाद, फाइब्रोनेक्टिन को एस्पिरेट करें और प्रत्येक को कोमल झटकों के साथ दो मिनट के लिए पीवीएस के 200 माइक्रोलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं। इस वॉश को एक बार और दोहराएं और दूसरा वॉश कुएं में छोड़ दें। राजी कोशिकाओं की एक ढुलमुल पूर्वसंस्कृति के 10 मिलीलीटर को 15 मिलीलीटर वी-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें।

३०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को त्यागें और धीरे-धीरे सेल पेलेट को गर्म, पूर्ण माध्यम में 1 मिलियन कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर फिर से रखें। राजी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए, संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।

आठ माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड के लिए, सेल निलंबन के कुल १.६ मिलीलीटर की जरूरत है । 10 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में सेल ट्रैकर ब्लू जोड़ें। सेल ट्रैकर नीले दाग कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और सेल निलंबन के 200 माइक्रोलीटर को तैयार फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड चैंबर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें।

चैंबर स्लाइड को 30 मिनट से एक घंटे के लिए पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । इसके बाद, धीरे से माइक्रोस्कोप पर चैंबर स्लाइड हिला ताकि राजी कोशिकाओं का पालन सुनिश्चित किया जा सके। अतिरिक्त सेल ट्रैकर नीले को खत्म करने के लिए गर्म, पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान से धोएं।

सुनिश्चित करें कि राजी कोशिकाओं प्लेटों के नीचे का पालन कर रहे हैं, और वे एक दूसरे के बीच अंतराल प्रदर्शित करते हैं और वे ढुलमुल नहीं हैं। 50-60% सेल संगम उचित है। सबसे पहले, प्रत्येक कुएं में एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर स्टेफिलोकोकल एंटोटॉक्सिन ई जोड़ें।

यह सुनिश्चित करें कि राजी कोशिकाओं को सुपरएंटीजन के साथ स्पंदित किया जाए अन्यथा जुरकट कोशिकाओं से टी-सेल रिसेप्टर एससीई को पहचान नहीं पाएगा और सिनेप्स का गठन नहीं किया जाएगा। चैंबर स्लाइड को कम से 30 मिनट के लिए पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । इसके बाद, 1 और 2 मिलियन कोशिकाओं प्रति मिलीमीटर के बीच एकाग्रता पर जुरकट कोशिकाओं की पहले से बढ़ती संस्कृति प्राप्त करें।

एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और फिर कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर वी-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। ३०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र । सुपरनैटेंट को त्यागें और धीरे-धीरे कोशिकाओं को गर्म, पूर्ण संस्कृति माध्यम में 1 मिलियन कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर फिर से खर्च करें।

फिर संस्कृति में Jurkat कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए तैयार जब तक पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने के लिए तैयार है । सेल ट्रैकर ब्लू-लेबल स्टेफिलोकोकस एंटोटॉक्सिन ई स्पंदित-इनक्यूबेटर से रजनी कोशिकाओं का पालन करने वाले कक्ष स्लाइडों को पुनः प्राप्त करें। ध्यान से अच्छी तरह से एक पाइप के साथ एक-एक करके प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें।

तुरंत सेल कल्चर मीडियम में रिलांकेड जुरकट सेल्स के 200 माइक्रोलीटर से मीडियम को बदल दें। यदि एक समय चूक किया जा रहा है, तो जल्दी से माइक्रोस्कोप के लिए आगे बढ़ें। माइक्रोस्कोप मचान वेटर पर कक्ष स्लाइड का पता लगाएं और कुछ उपयुक्त क्षेत्रों का चयन करें।

इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप और इनक्यूबेशन चैंबर तैयार करें। जौरकात कोशिकाओं को राजी कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक कुएं में जोड़ने के बाद, प्रीहीटेड माइक्रोस्कोप पर माइक्रोवेल्ड चैंबर स्लाइड का जल्दी से पता लगाएं और कुछ XY पदों का चयन करें। यदि केवल एक एंडपॉइंट प्रयोग की योजना बनाई जाती है, तो चैंबर स्लाइड को एक से दो घंटे के लिए पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।

संस्कृति अवधि के बाद, संजूगेट गठन की जांच करें और बाद में पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित संजूगेट को ठीक करें। कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, FCS के बिना गर्म RPMI जोड़ें और धीरे से हिला । आरएमपीआई को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीएफए या प्रीचिल्ड एसीटोन के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।

कक्ष स्लाइड कमरे के तापमान पर या 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट । फिर प्रत्येक को पीवीएस के साथ दो बार अच्छी तरह से धोएं और शमन समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। इस अध्ययन में, जुरकट-राजी प्रतिरक्षा सिनेप्स कन्जुगेट उत्पन्न होते हैं और इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स गठन के शुरुआती चरणों को ठीक से चित्रित किया जाता है।

यह रणनीति एक साथ समय चूक इमेजिंग का प्रदर्शन करते हुए प्रतिरक्षा synapse गठन लाती है। इस तकनीक से प्राप्त प्रतिनिधि सिनैप्टिक जुरकट-राजी संजूगेट यहां दिखाए गए हैं, जिसमें ट्रांसमीटर चैनल की छवि, सेल ट्रैकर ब्लू चैनल और इन दोनों चैनलों का विलय शामिल है। कुछ सिनैप्टिक संजूगेट देखे जा सकते हैं, जिनमें केवल एक जुरकट सेल और कई राजी कोशिकाओं से बने लोग शामिल हैं, जो जटिल संजूगेट हैं।

कम सेल सांद्रता जटिल सेलुलर conjugates के गठन को दरकिनार कर देगा, लेकिन ध्रुवीकृत यातायात के बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त सेल conjugates प्रदान नहीं कर सकते हैं, जो बदले में खोजने के लिए और उभरते सिनैप्टिक conjugates छवि के लिए संभावना कम हो जाएगा । जीएफपी-सीडी 63 फ्लोरेसेंस चैनल छवियों का एक विहित डेकोन्वोल्यूशन सॉफ्टवेयर के साथ व्यापक क्षेत्र ऑप्टिकल विकल्प और उचित ऑप्टिकल मापदंडों का उपयोग करके किया जाता है। इस डिकोवोल्यूटेड चैनल को बाद में सेल ट्रैकर ब्लू ब्रॉड चैनल में मर्ज कर दिया गया ।

सिग्नल-टू-शोर रेशियो और तीखेपन दोनों में सुधार हुआ है । एक निश्चित प्रतिरक्षा सिनेप्स संयुग्म का एक प्रतिनिधि जेड स्टैक यहां दिखाया गया है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस को एमवीबी की कल्पना करने के लिए एफ-ऐक्टिन, एंटी-सीडी63 और एमटीसी की कल्पना करने के लिए एंटी-गामा-ट्यूबलिन की कल्पना करने के लिए फल्लोडिन का उपयोग करके किया जाता है जबकि सेल ट्रैकर ब्लू ने राजी कोशिकाओं को लेबल किया है।

जुरकट कोशिकाओं की वैकल्पिक ट्रांसफिक्सिंग जीवित कोशिकाओं में गुप्त कणिकाओं के यातायात के दृश्य की अनुमति देगी। उदाहरण के लिए, जब GFP-CD63 व्यक्त किया जाता है, तो जीएफपी-सीडी 63-सजाए गए वेसिकल्स का आंदोलन दर्ज किया जा सकता है। प्रोटोकॉल अंतिम बिंदु निर्धारण प्रोटोकॉल के साथ संगत है जो प्रोटोकॉल और विश्लेषण को और अधिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने की अनुमति देगा।

उत्पादकता प्रयोगात्मक मॉडल मौजूद हैं जो प्रतिरक्षा सिनैप्स में इमेजिंग को सरल बना सकते हैं लेकिन ये मॉडल एंटीजन-प्रस्तोता कोशिकाओं पर जटिल और अनियमित सतह का अनुकरण नहीं करते हैं जो प्रतिरक्षा सिनेप्स पर गैर-शारीरिक बातचीत का उत्पादन कर सकते हैं। यहां वर्णित दृष्टिकोण प्रतिरक्षा सिनेप्स पर होने वाली कुछ जैविक जटिलताओं को पुन: पेश करने और पुष्टि करने के लिए उपयुक्त है। सुपरएंटिजन एक खतरनाक टॉक्सिन है इसलिए कृपया दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें, और खतरनाक बॉक्स पर इस्तेमाल की गई टिप को छोड़ दें।