Formålet med metoden er å generere en immunologisk synapse som er et eksempel på celle-til-celle-bøyning dannet av en antigen-presentasjonscelle og en T-hjelperlymfocytt. Vårt mål er å registrere de første stadiene av immunsynapseformasjonen og å registrere smuglingshendelsene som forekommer i T-hjelperlymfocytten. Disse vil til slutt føre til polarisert sekresjon ved immunsynapsen.
Tilnærmingen som presenteres her innebærer celle-til-celle-bøyning, time-lapse oppkjøp, bredfeltfluorescenikroskopi og påfølgende bildebehandling. Dette forbedrer signal-til-støy-forholdet mellom bildene, forbedrer den temporale oppløsningen, og tillater samtidig oppkjøp av flere fluorokromer i nye synaptiske konjugater og reduserer fluorescensbleking. I tillegg er protokollen kompatibel med endepunktcellefikseringsprotokoller som vil tillate immunofluorescence farging og analyse.
Denne protokollen er også kompatibel med laserskanning fluorescerende mikroskopi og andre toppmoderne mikroskopiteknikker. Demonstrere prosedyren vil være Ana Bello, en graduate student, Alejandro Garrido, en tekniker, og Solange Moreno, en graduate student. For å begynne denne prosedyren, legg til 150 mikroliter fibronectin til hver brønn av en åtte mikrobrønnkammersklie og inkubere den ved 37 grader Celsius i 30 minutter til en time.
Etter inkubasjonsperioden aspirerer fibronectinen og vask hver brønn med 200 mikroliter PVS i to minutter med mild risting. Gjenta denne vasken igjen og la den andre vasken i brønnen. Overfør 10 milliliter av en samtidig prekultur av Raji-celler til et 15 milliliter V-bunnrør.
Sentrifuge ved 300 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter. Kast den overnaturlige og forsiktig resuspend cellepellet i varmt, komplett medium i en konsentrasjon på 1 million celler per milliliter. For å merke Raji-cellene, overfør det nødvendige antall celler i kulturmedium til et to milliliter rør.
For de åtte mikrobrønnkammersklien er det nødvendig med totalt 1,6 milliliter cellefjæring. Legg celle tracker blå til en endelig konsentrasjon på 10 mikromos. Resuspend celle tracker blå-farget celler og overføre 200 mikroliter av cellen suspensjon i hver brønn av forberedt fibronectin-belagt kammer lysbilder.
Inkuber kammeret lysbildet på 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid i 30 minutter til en time. Etter dette rister du forsiktig kammeret lysbilder på mikroskopet for å sikre at Raji-cellene følges. Vask hver godt nøye med varm, komplett cellekultur medium for å eliminere overflødig celle tracker blå.
Sørg for at Raji-cellene følges bunnen av platene, og de viser hull blant hverandre, og de er ikke samløpet. 50-60% av celle samløpet er hensiktsmessig. Først legger Staphylococcal Enterotoxin E i en konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter til hver brønn.
Sørg for at Raji celler er pulserende med superantigen ellers T-celle reseptoren fra Jurkat cellene vil ikke gjenkjenne SCE og synapse vil ikke bli dannet. Inkuber kammeret lysbildet på 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid i minst 30 minutter. Deretter får du en tidligere voksende kultur av Jurkat-celler i en konsentrasjon mellom 1 og 2 millioner celler per millimeter.
Vær oppmerksom på cellene under et fasekontrastmikroskop og overfør deretter cellene til et 15 milliliter V-bunnrør. Sentrifuge ved 300 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter. Kast de overnaturante og forsiktig resuspend cellene i varmt, komplett kulturmedium i en konsentrasjon på 1 million celler per milliliter.
Deretter opprettholde Jurkat celler i kultur på 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid til klar til bruk. Hent kammerskliene som inneholder cellesporingen blåmerket Staphylococcus Enterotoxin E pulserte Raji-celler fra inkubatoren. Aspirer kulturmediet forsiktig fra hver brønn en etter en med en pipette plassert i et hjørne av brønnen.
Skift umiddelbart mellomlegemet med 200 mikroliter av de resuspenderte Jurkat-cellene i cellekulturmediet. Hvis det utføres en tidsforløp, fortsett raskt til mikroskopet. Finn det kamrede lysbildet på mikroskopet oppsamling servitør og velg noen aktuelle felt.
Forbered mikroskopet og inkubasjonskammeret før avbildning. Etter at Jurkat-cellene er lagt til hver brønn som inneholder Raji-cellene, finner du raskt det mikrooppvarmede kammerlysbildet på det forvarmede mikroskopet iscenesatt inkubator og velger noen XY-posisjoner. Hvis bare et endepunkteksperiment er planlagt, inkubere kammeret lysbildet på 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid i en til to timer.
Etter kulturperioden, se etter konjugatdannelse og deretter fikse konjugatene som beskrevet i tekstprotokollen. For å fikse cellene, legg til varm RPMI uten FCS og rist forsiktig. Aspirer RMPI og legg til 200 mikroliter av enten PFA eller prechilled aceton til hver brønn.
Inkuber kammeret gli ved romtemperatur eller på is i 20 minutter. Vask deretter hver brønn to ganger med PVS og tilsett 200 mikroliter slukkeløsning. I denne studien genereres Jurkat-Raji immunsynapsekonjugater og de tidlige stadiene av immunologisk synapsedannelse er riktig avbildet.
Denne strategien induserer den immunologiske synapseformasjonen samtidig som den utfører tidsforløp. Representative synaptiske Jurkat-Raji konjugater hentet fra denne teknikken er vist her, inkludert et bilde av transmittance kanal, cellen tracker blå kanal, og begge disse kanalene fusjonert. Noen synaptiske konjugater kan sees, inkludert de som består av bare en Jurkat celle og flere Raji celler, som er komplekse konjugater.
Avtagende cellekonsentrasjoner vil omgå dannelsen av komplekse cellulære konjugater, men kan ikke gi nok cellekonjuger for den påfølgende analysen av polarisert trafikk, noe som igjen vil redusere sjansene for å finne og å bilde nye synaptiske konjugater. En overføring av GFP-CD63 fluorescens kanalbilder utføres med en passende deconvolution programvare ved hjelp av det brede feltet optisk alternativ og de riktige optiske parametrene. Denne dekonvoluterte kanalen ble senere slått sammen til cellen tracker blå bred kanal.
Det er en forbedring av både signal-til-støy-forholdet og skarpheten. En representativ Z-stabel med en fast immunologisk synapsekonjugat vises her. Immunofluorescence utføres ved hjelp av falloidin for å visualisere F-actin, anti-CD63 for å visualisere MVB, og anti-gamma-tubulin for å visualisere MTOC mens celle tracker blå merket Raji cellene.
Den valgfrie transfixing av Jurkat cellene vil tillate visualisering av trafikken av sekretoriske granulat i levende celler. For eksempel, når GFP-CD63 uttrykkes, kan bevegelsen av GFP-CD63-dekorerte vesikler registreres. Protokollen er kompatibel med endepunktfikseringsprotokoller som vil tillate ytterligere immunofluorescence farging protokoller og analyser.
Produktivitet eksperimentelle modeller eksisterer som kan forenkle avbildning i immunsynapse, men disse modellene ikke etterligne den komplekse og uregelmessige overflaten på antigen-presenter celler som kan produsere ikke-fysiologiske interaksjoner på immunsynapse. Tilnærmingen som er beskrevet her er egnet til å reprodusere og bekrefte noen biologiske kompleksiteter som forekommer ved immunsynapsen. Superantigen er et farlig toksin, så husk å bruke hansker, og slipp den brukte spissen på den farlige boksen.
