Syftet med metoden är att generera en immunologisk synaps som är ett exempel på cell-till-cell konjugation som bildas av en antigen-presenterande cell och en T-hjälpare lymfocyt. Vårt mål är att registrera de första stadierna av immun synapsbildning och att registrera människohandel händelser som inträffar i T-helper lymfocyter. Dessa kommer så småningom att leda till polariserad utsöndring vid immunsynapsen.
Det tillvägagångssätt som presenteras här innebär cell-till-cell konjugering, time-lapse förvärv, wide-field fluorescens mikroskopi och efterföljande bildbehandling. Detta förbättrar signal-till-brus förhållandet av bilderna, förbättrar den tidsmässiga upplösningen, och gör det möjligt att samtidig förvärv av flera fluorokromer i framväxande synaptiska konjugater och minskar fluorescens blekning. Dessutom är protokollet kompatibelt med slutpunkt cellfixering protokoll som kommer att möjliggöra immunofluorescens färgning och analys.
Detta protokoll är också kompatibelt med laserscanningslysrörsmikroskopi och andra toppmoderna mikroskopitekniker. Visar förfarandet kommer att Ana Bello, en doktorand, Alejandro Garrido, en tekniker, och Solange Moreno, en doktorand. För att börja detta förfarande, tillsätt 150 mikroliter fibronectin till varje brunn av en åtta microwell kammare glida och inkubera den på 37 grader Celsius i 30 minuter till en timme.
Efter inkubationstiden aspirera fibronectin och tvätta varje brunn med 200 mikroliter PVS i två minuter med skonsam skakning. Upprepa denna tvätt en gång till och låt andra tvätten vara kvar i brunnen. Överför 10 milliliter av en konfluent prekultur av Raji-celler till ett 15 milliliter V-bottenrör.
Centrifugera vid 300 gånger G och i rumstemperatur i fem minuter. Kassera supernatanten och försiktigt resuspend cellpelleten i varmt, komplett medium vid en koncentration av 1 miljon celler per milliliter. För att märka Raji-cellerna, överför erforderligt antal celler i odlingsmedium till ett två milliliterrör.
För den åtta mikrobrunnskammarens bild behövs totalt 1,6 milliliter cellfjädring. Lägg till cell tracker blå till en slutlig koncentration av 10 mikromolar. Resuspend cellen tracker blå-färgade celler och överföra 200 mikroliter av cellen suspensionen i varje brunn av den beredda fibronectin-belagda kammaren diabilder.
Inkubera kammaren glida på 37 grader Celsius med fem procent koldioxid i 30 minuter till en timme. Efter detta ska du försiktigt skaka kammarprutorna på mikroskopet för att se till att Raji-cellerna följs. Tvätta varje väl noga med varmt, komplett cellkulturmedium för att eliminera överflödig cell tracker blå.
Se till att Raji-cellerna följs till botten av plattorna, och de visar luckor bland varandra och de är inte konfluenta. 50-60%av cell sammanflödet är lämpligt. Tillsätt först Staphylococcal Enterotoxin E i en koncentration av ett mikrogram per milliliter till varje brunn.
Se till att Raji celler är pulsade med superantigen annars T-cell receptorn från Jurkat cellerna inte kommer att känna igen SCE och synapse kommer inte att bildas. Inkubera kammaren glida på 37 grader Celsius med fem procent koldioxid i minst 30 minuter. Därefter erhåll en tidigare växande kultur av Jurkat-celler vid en koncentration mellan 1 och 2 miljoner celler per millimeter.
Observera cellerna under ett faskontrastmikroskop och överför sedan cellerna till ett 15 milliliter V-bottenrör. Centrifugera vid 300 gånger G och i rumstemperatur i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend försiktigt cellerna i varmt, komplett odlingsmedium vid en koncentration av 1 miljon celler per milliliter.
Sedan behålla Jurkat cellerna i kultur på 37 grader Celsius med fem procent koldioxid tills den är klar att använda. Hämta kammarglasen som innehåller cellföljaren blåmärkta Staphylococcus Enterotoxin E pulsade Raji-celler från inkubatorn. Aspirera försiktigt odlingsmediet från varje brunn en efter en med en pipett placerad i ett hörn av brunnen.
Byt omedelbart ut mediet mot 200 mikroliter av de återanvända Jurkatcellerna i cellodlingsmedium. Om en tidsfördröjning utförs, fortsätt snabbt till mikroskopet. Leta upp kammarbilden på mikroskopet staging servitör och välj några lämpliga fält.
Bered mikroskopet och inkubationskammaren före avbildning. Efter jurkat cellerna har lagts till varje brunn som innehåller Raji cellerna, snabbt lokalisera microwelled kammaren glida på förvärmda mikroskop iscensatt inkubator och välja några XY positioner. Om bara ett endpoint-experiment planeras, inkubera kammarrutschkanen i 37 grader Celsius med fem procent koldioxid i en till två timmar.
Efter kulturperioden, kontrollera om konjugatbildning och därefter fixa konjugaterna som beskrivs i textprotokollet. För att fixera cellerna, tillsätt varm RPMI utan FCS och försiktigt skaka. Aspirera RMPI och tillsätt 200 mikroliter av antingen PFA eller prechilled acetone till varje brunn.
Inkubera kammaruten i rumstemperatur eller på is i 20 minuter. Tvätta sedan varje brunn två gånger med PVS och tillsätt 200 mikroliter av släckningslösning. I denna studie genereras Jurkat-Raji immunsynapse konjuger och de tidiga stadierna av immunologiska synapsbildning är korrekt avbildade.
Denna strategi inducerar den immunologiska synapsbildningen samtidigt som den utför avbildningen time lapse. Representativa synaptic Jurkat-Raji konjugater erhållna från denna teknik visas här, inklusive en bild av transmittanskanalen, celltracker blå kanal, och båda dessa kanaler samman. Vissa synaptiska konjuger kan ses, inklusive de som består av endast en Jurkat-cell och flera Raji-celler, som är komplexa konjugater.
Minskande cell koncentrationer kommer att kringgå bildandet av komplexa cellulära konjugater men kanske inte ger tillräckligt med cell konjuger för den efterföljande analysen av polariserad trafik, vilket i sin tur kommer att minska chanserna att hitta och att bilden framväxande synaptiska konjuger. En deconvolution av GFP-CD63 fluorescens kanalbilder utförs med en lämplig deconvolution programvara med hjälp av det breda fältet optiska alternativet och rätt optiska parametrar. Denna deconvoluted kanal därefter samman till cell tracker blå bred kanal.
Det finns en förbättring av både signal-brus-förhållandet och skärpan. En representativ Z-stack av en fast immunologisk synapskonjugat visas här. Immunofluorescens utförs med phalloidin för att visualisera F-aktin, anti-CD63 för att visualisera MVB och anti-gamma-tubulin för att visualisera MTOC medan cell tracker blå märkt Raji cellerna.
Den valfria transfixing av Jurkat cellerna kommer att möjliggöra visualisering av trafiken av de sekretoriska granulerna i levande celler. När GFP-CD63 uttrycks kan till exempel rörelsen för de GFP-CD63-dekorerade vesiklarna spelas in. Protokollet är kompatibelt med slutpunktsfixeringsprotokoll som kommer att möjliggöra ytterligare immunofluorescensfärgningsprotokoll och analyser.
Produktivitet experimentella modeller finns som kan förenkla bildbehandling i immun synapsen men dessa modeller inte efterlikna den komplexa och oregelbundna ytan på antigen-presentatör celler som kan producera icke-fysiologiska interaktioner på immun synaps. Det tillvägagångssätt som beskrivs här är lämpligt att reproducera och bekräfta vissa biologiska komplexiteter som förekommer vid immunsynapsen. Superantigen är ett farligt toxin så var noga med att bära handskar, och släpp den använda spetsen på den farliga lådan.
