Name: dna origami-mediated substrate nanopatterning of inorganic structures for sensing applications
Uploaded: 2019-09-27T15:00:00
Duration: 8 min 59 s
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这项工作得到了芬兰科学院（项目286845、308578、303804、267497）、简和阿托斯·埃尔科基金会以及西格丽德·尤塞柳斯基金会的支持。这项工作是在芬兰科学院卓越中心方案（2014-2019年）下进行的。我们感谢阿尔托大学生物经济设施、OtaNano – 纳米显微镜中心 （Alto-NMC） 和微新星纳米制造中心提供的设施和技术支持。

1. DNA折纸的设计
注：在本协议中，使用二维（2D）弓形DNA折纸结构（图1）34描述纳米图案处理过程。要设计新的 DNA 折纸形状，请遵循以下准则：
<ol><li>使用caDNAno35设计所需的形状和所需的DNA折纸的主食链序列。要生成平面的单层折纸，请使用 caDNAno 的方形格子选项，并通过跳过设计中的一些基块（参见图 1和补充 caDNAno 文件）手动调整交叉间距，以删除产生的结构扭曲从方格包装36，37。</li>
	<li>用含有聚T（8 nt）悬伸的绞线延伸每个DNA螺旋的末端;这将防止通过钝端基堆叠交互（图 1和补充 caDNAno 文件）对对象进行多面化。</li>
	<li>运行设计的计算分析。CanDo38，39可用于预测 DNA 折纸的三维 （3D） 形状和结构刚度。CanDo 也是一个有用的工具，用于迭代扭曲校正所需的基本跳过数，并相应地调整设计。</li>
	<li>在 caDNAno 中，选择首选的脚手架长度并生成折叠结构所需的钉线。对于蝴蝶结结构，使用 7249 nt 长 M13mp18 脚手架和 205 根独特的钉线（参见补充 caDNAno 文件）。 注：还有其他计算工具可用于设计DNA折纸结构40，41，42，43。根据所选择的工具/软件，其他模拟工具也可以使用43，44。</li>
</ol>2. DNA折纸大会
<ol><li>通过混合弓形结构所需的所有寡核苷酸（共205个订书针）34，使主食绞线库存。寡核苷酸应具有相同的初始浓度（例如，在无RNase水中为100μM）。</li>
	<li>通过混合 20 μL M13mp18 支脚手架链（p7249 型，在 100 nM 时），40 μL 的订书针溶液，在 0.2 mL PCR 管中制备 100 μL 的 DNA 折纸折叠反应混合物，其中每股的订书针含量为 500 nM（与订书针相比，其产量为 10 倍摩尔多余到支架）和 40 μL 的 2.5x 折叠缓冲液 （FOB）。FOB含有三聚一苯乙烯-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TAE），辅以MgCl2。有关FOB成分浓度，见表1。</li>
	<li>在热循环器中从 90°C 到 27°C 中对反应混合物进行退火。使用表 2 中介绍的热折叠斜坡。
</li>
</ol>3. DNA折纸的纯化
注：使用无损聚（乙二醇）（PEG）纯化方法，可以从DNA折纸溶液中去除过量的主食链。该协议改编自斯塔尔等人45。
<ol><li>用600μL的1xFOB稀释组装的DNA折纸结构的200μL（见表1），以获得800μL的起始体积。</li>
	<li>将稀释后的DNA折纸溶液1：1与800 μL的PEG沉淀缓冲液（15% PEG 8000 （w/v）、1x TAE、505 mM NaCl）混合，并通过来回移液彻底混合。</li>
	<li>在 14，000 x g和室温下将混合物离心 30 分钟。</li>
	<li>使用移液器小心地去除上清液。</li>
	<li>加入 200 μL 的 1x FOB，通过移液轻轻混合。也可以添加不同量的1xFOB，以获得所需的DNA折纸浓度。</li>
	<li>要重新溶解DNA折纸结构（管底的小透明颗粒），在室温下孵育PEG纯化DNA折纸结构过夜。</li>
	<li>使用 UV/Vis 分光光度计测量波长为 260 nm 的吸收率，估计 PEG 纯化后的 DNA 折纸浓度。使用比尔-兰伯特定律和1.1×108 M-1 cm-1的消光系数计算6。PEG纯化后的典型DNA折纸浓度为15-20 nM。</li>
	<li>将PEG纯化DNA折纸结构储存在4°C。DNA折纸结构通常稳定数月，因此可以准备大量库存供以后使用。 注：过量的主食绞线也可使用其他纯化技术46去除，如自旋过滤47、速率区离心48和甘蔗凝胶提取49。DNA折纸结构在各种缓冲液中稳定50，如果需要，储存介质可以通过自旋过滤51在PEG纯化后改变。</li>
</ol>4. 阿加玫瑰凝胶电泳
注：使用甘草凝胶电泳可以验证折叠和去除多余丝绞线的质量。
<ol><li>通过在 Erlenmeyer 烧瓶中加入 1 克腺胶和 45 mL 的 1x TAE，制备 ±2%（w/v）角胶。在微波炉中加热混合物，直到甘蔗完全溶解，并产生清晰的溶液。</li>
	<li>在自来水下冷却溶液，直到烧瓶能够舒适地触摸（50–60 °C）。</li>
	<li>将5 mL的110 mM MgCl2和40 μL的溴化铀溶液（0.58 mgmL-1）加入溶液中，轻轻摇动混合物。 注意：溴化铀是一种潜在的致癌物质，应谨慎处理。</li>
	<li>设置凝胶铸造托盘，将液体甘蔗倒入铸造托盘。让凝胶在室温下凝固至少30分钟。</li>
	<li>从铸造纸盒中取出凝胶并将其放入凝胶电泳室。用运行缓冲液填充腔室 （1x TAE 与 11 mM MgCl2.</li>
	<li>每5μL样品溶液加入1μL6倍凝胶加载染料，并彻底混合。通过小心地将所需数量的样品溶液移入单独的凝胶口袋，将样品装入样品。</li>
	<li>在95 V的恒定电压下运行角胶凝胶45分钟。将凝胶电泳室放在冰浴上，以避免凝胶受到热损伤。</li>
	<li>使用凝胶成像系统在紫外线下可视化凝胶（图2A）。</li>
</ol>5. 基板制备（图3A）
注： 除 SiO2增长（步骤 9）外，以下步骤都在洁净室中执行。如果此工艺不足以去除基材中的所有残留物，则还可以用基于天人鱼溶液的标准清洁步骤替代清洁步骤。
<ol><li>从用作基板的晶圆上切割 7 mm x 7 mm 芯片。对于 SiN，请使用硅锯、金刚石切割笔或类似机具。切割蓝宝石 （Al2O3） 需要专用工具或锯片。芯片尺寸不需要精确。</li>
	<li>清洁芯片。<ol>
<li>将切碎的芯片浸入热丙酮（丙酮加热至52°C）的玻璃杯中，并至少加热15分钟。根据基材的起始清洁度，可能需要较长的时间。</li>
		<li>当它们仍在热丙酮浴中时，用棉签轻轻擦拭片，以机械方式去除任何残留薄膜。</li>
		<li>使用钳子，从热丙酮中提起薯片，并使用洗瓶用室温丙酮冲洗。</li>
		<li>将芯片浸入玻璃中，用异丙醇和超声波浸泡2分钟。</li>
		<li>用钳子将芯片从异丙醇中提起，并立即使用氮流彻底干燥。只接触并握住芯片的侧面和边缘，因为钳子覆盖的区域不会正常干燥，在接触区域留下潜在的残留物和其他污染。为获得最佳效果，请使用尽可能高的流量，并保持芯片表面与流动方向平行。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将芯片存放在洁净室内的有盖容器中，以便日后使用。</li>
</ol>6. 非晶硅层的等离子体增强化学气相沉积（PECVD） （图3B）
<ol><li>将芯片放入 PECVD 设备中。</li>
	<li>设置沉积参数，以生长大约 50 nm 的无晶硅 （a-Si）。精确设置因设备型号和校准而异。有关此处使用的参数，请参阅表 3。运行 a-Si 沉积程序来增大图层。</li>
	<li>加工后，在标准洁净室条件下将芯片存放在有盖容器中。</li>
</ol>7. A-Si层的氧等离子体处理 （图 3B）
注：此步骤将使基板表面略带负电荷和亲水性，以便 DNA 折纸结构在以后能够借助额外的镁离子有效地吸附到表面。
<ol><li>将芯片放入无功式电气蚀刻 （RIE） 设备中。</li>
	<li>设置蚀刻参数以生成氧等离子体。同样，确切的设置因设备型号和校准而异。有关此处使用的参数，请参阅表 3。运行氧气等离子体治疗方案。</li>
	<li>继续下一步立即，因为治疗的效果将迅速恶化。通常，在血浆处理后，应在后 30 分钟内使用基板。</li>
</ol>8. DNA折纸的沉积 （图 3C）
<ol><li>通过将5μL的折叠/纯化DNA折纸溶液（±20 nM）与4μL的1xFOB和1μL的1MMgCl2混合，制备DNA折纸混合物进行沉积。所得溶液含有[10 nM DNA折纸]和约100 mM Mg2+。</li>
	<li>将DNA折纸混合物的10μL沉积在氧等离子处理芯片上，并在室温下孵育5分钟。覆盖可防止意外干燥，并有助于以后去除多余的盐和DNA折纸结构。</li>
	<li>孵育后，通过在芯片上先移液100μL蒸馏水（例如MilliQ）来清洗表面。用移液器来回冲洗水几次，同时避免接触芯片中心。用移液器将大部分水从表面清除。这会导致只有正确吸附的折纸留在表面上。</li>
	<li>重复此洗涤周期（步骤 8.3） 3 至 4 次。</li>
	<li>洗涤后，立即用氮气流干燥样品。这样做的方式与基板制备中的干燥方式相同（步骤 5）。尽可能彻底地干燥样品非常重要。 注：通过调整沉积溶液中DNA折纸和Mg2+的浓度，可以改变沉积结构的密度和金属纳米结构的密度。较高的Mg2+浓度可改善DNA折纸粘附，从而增加密度，但最终也会导致DNA折纸结构的聚集。因此，主要应首先调整DNA折纸浓度。</li>
</ol>9. SiO2掩膜的生长 （图 3D）
注： 此步骤可在洁净室外执行。以下版本将生成负色调模式，但可以修改过程以生成正色调模式。SiO2的生长过程改编自Surwade等人52，作者53进一步开发，最后针对该协议进行了优化。
<ol><li>取一个可密封的干燥器（1.5 L），一个适合干燥器内的培养皿（可选），以及一个穿孔板，可以充当干燥器内的平台。</li>
	<li>取100克硅胶，在培养皿中或直接在干燥器中与30克蒸馏水混合。最好至少提前24小时执行此步骤，以使硅胶稳定。 注：这用于控制干燥器内的湿度，因此也用于控制 SiO2薄膜的生长速率和形态。较高的湿度会导致更高的速率和更粗糙的结构。或者，硅胶可以在气候试验室中固化。</li>
	<li>将硅胶放在干燥器中，并将其与穿孔板分离。</li>
	<li>将芯片与吸附DNA折纸以及打开小瓶（新鲜）10 mL的四乙基正交硅酸盐（TEOS）和另一瓶10 mL的25%氢氧化铵（NH4OH）放在干燥器，在穿孔平台上。将小瓶设置在样品的近侧和对面。最好使用烧瓶软木塞或类似的扁平底座，从平台上稍微提高芯片。 注意：NH4OH 和 TEOS 在皮肤接触时都是有害的，它们的蒸汽会刺激眼睛和呼吸器官。在通风良好的区域使用，并佩戴防护手套、护目和防护服。</li>
	<li>密封腔室并在室温下孵育20小时。这将在DNA折纸结构未定位的区域生长SiO2膜，创建一个10-20nm图案的面膜，带有DNA折纸形状的孔（图4）。</li>
	<li>孵育后从腔室中取出样品。存放在有盖的容器中。可在此处暂停处理。处置用过的 TEOS 和 NH4OH。如果硅胶在使用间密封在干燥器内，并在2-3周内使用，则可使用2-3次。</li>
</ol>10. SiO2和 a-Si 的活性电子蚀刻 （RIE） （图 3E）
<ol><li>将芯片放入无功式电气蚀刻 （RIE） 设备中。</li>
	<li>将蚀刻参数设置为仅蚀刻 SiO2的 2-5 nm，以显示 SiO2掩膜中孔下方的 a-Si 层。必须针对单个设备进行实验确定精确设置。此处使用的参数位于表 3中。运行各向异性 SiO2等离子蚀刻程序。</li>
	<li>设置蚀刻参数以穿透 50 nm a-Si 层。此处使用的参数再次显示在表 3中。运行各向异性 a-Si 等离子蚀刻程序。</li>
	<li>从 RIE 设备和覆盖的存储中取出样品。可以在此处再次暂停处理。</li>
</ol>11. 金属的物理气相沉积 （PVD） （图 3F）
<ol><li>将芯片加载到 PVD 仪器的蒸发室中。</li>
	<li>选择目标金属。首先，选择粘合剂金属。在这里，使用 2 nm 的铬 （Cr）。</li>
	<li>设置目标材料和厚度的厚度控制程序。控制方法与仪器相关。在这里，使用石英晶体微平衡（QCM）。测量的厚度由目标材料密度和 Z 因子调整，需要通过针对设备和每个目标材料的实验确定的工具因子进行校正。</li>
	<li>启动电子束，将光束与目标对齐，并增加光束电流，直到沉积速率达到 0.05 nm/s。蒸发，直到达到2nm的最终厚度。</li>
	<li>选择第二个目标金属（如黄金），而不通风腔室或中断工艺。中断或排气将使粘合剂金属开始氧化，并降低其作为粘合剂的可用性。</li>
	<li>重复步骤 11.3 到 11.4。蒸发至 20 nm。这将通过总高度为 22 nm 的 SiO2掩膜孔创建 DNA 折纸形状的金属结构。</li>
	<li>通风室并取出样品。</li>
	<li>如果样品被覆盖，可以在此处暂停处理。</li>
</ol>12. 氢氟酸（HF）的升空（图3G）
<ol><li>将 50% 基于 HF 的蚀刻液倒入合适的塑料容器中。不应将 HCl 用于混合物，因为 HCl 会在样品中蚀刻 Cr。 注意：HF 具有极强的腐蚀性，会导致严重的刺激和灼伤，在皮肤接触或吸入时可能致命。仅在专用烟罩或带防护围裙、耐化学性手套和面罩的通风湿凳中使用 HF，或提供全面的化学保护。</li>
	<li>将样品浸入基于 HF 的蚀刻剂中，用塑料钳轻轻搅拌。</li>
	<li>等待 SiO2层完全蚀刻，金属层分离。时间会根据掩膜孔的密度而明显变化。孔数越大，蚀刻速度越快。如果金属层难以剥离，可以使用 5 到 10 s 的短暂超声。</li>
	<li>金属薄膜分离后，用双蒸馏水和异丙醇冲洗样品。</li>
	<li>洗水后，用氮气流干燥样品，方式与基板制备的指示相同（步骤 5）。避免钳子与芯片中心接触，因为这可能会破坏形成的纳米结构。 注：样品可以在这里存储和处理暂停。</li>
</ol>13. 剩余 a-Si 的 RIE （图 3H）
<ol><li>将芯片放入无功式电气蚀刻 （RIE） 设备中。</li>
	<li>设置蚀刻参数，以彻底去除所有 50 nm 的 a-Si。参数可以与步骤 10 中相同，但可以使用稍长的蚀刻时间 （40 s） 来确保删除所有 a-Si。有关此处使用的参数，请参阅表 3。 运行各向异性 a-Si 等离子蚀刻程序，以去除剩余的 a-Si。</li>
	<li>从 RIE 设备和覆盖的存储中取出样品。这将完成样品处理。</li>
</ol>14. 原子力显微镜
注：原子力显微镜和扫描电子显微镜可用于监测薄膜生长和图案的成功，以及图像折叠的DNA折纸结构（图2B，C）。如果对步骤 5-13 中的处理样本进行成像，则可以跳过以下示例准备步骤。
<ol><li>AFM 样品制备<ol>
<li>要对折叠的DNA折纸进行成像，请取一块云母基质的芯片。</li>
		<li>使用粘合剂将云母芯片连接到玻璃显微镜幻灯片上。</li>
		<li>通过在 1x FOB 中稀释 ±20 nM DNA 折纸 50 次，以约 0.4 nM 的浓度制备 10 μL DNA 折纸溶液。进行稀释是为了防止基板过度拥挤。</li>
		<li>用弱胶带剥去云母片的顶层，以获得刚切出的带电表面。</li>
		<li>将稀释的DNA折纸溶液沉积在刚切出的云母上，并在室温下孵育覆盖1分钟的样品。</li>
		<li>孵育后，使用移液器用100μL蒸馏水清洗表面3-4次。这会导致只有正确吸附的折纸留在表面上。</li>
		<li>将 100 μL 蒸馏水沉积在云母表面。</li>
		<li>倾斜并尖锐地敲击桌子上的显微镜滑块，以分离大部分水。</li>
		<li>重复此洗涤周期 3-4 次。</li>
		<li>清洗后立即用氮气将样品彻底干燥。然后，该示例已准备好进行 AFM 成像。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将DNA折纸样品或加工过的芯片放入AFM中，并进行扫描。扫描尺寸为 1-10 μm，适合正确解析结构。</li>
</ol>15. 扫描电子显微镜（SEM）
<ol><li>将样品放入 SEM 中。加工过的芯片可以根据需要使用（无需进一步制备样品）。</li>
	<li>选择加速度电压。由于样品基板（Al2O3或 SiN）是绝缘体，因此使用低电压 （5-10 kV） 来降低充电效果。</li>
	<li>扫描任何感兴趣的领域。最小化扫描时间，以减少充电，避免污染沉积。</li>
</ol>

该协议在生产纳米结构的形状上提供了极大的自由度和准确性。通过改变DNA折纸的设计，可以控制金属纳米结构的形状。金属结构的最终、精确形状由掩膜生长步骤（步骤 9）以及掩膜蚀刻（步骤 10）在较小程度上确定，如果它不是各向异性。如果掩膜的生长时间足够延长，掩模中的孔将开始关闭。这可以用来省略某些结构和控制间隙尺寸最薄的特征，如Shen等人34所示，弓形折纸的三角形分离（图5B）。相反，通过缩短氧化物的生长时间，可以更好地保存较薄的形状。这意味着可以调整图 6中显示的光学特性，不仅通过更改使用的折纸设计，还可以调整 SiO2胶片的生长。

如果蒙版厚度显著变化，则该更改还必须反映在 SiO2 RIE 步骤中。只有一层非常薄的 SiO2应蚀刻（2-5 nm），以勉强刺穿面罩孔。这是整个过程中最敏感和最关键的部分。由于蚀刻时间极短，只有 10-20 s，因此在首次尝试使用新设备时，必须通过实验确定确切的设置。步骤 10.4 也是如此，因为某些 SiO2在 a-Si 蚀刻过程中也进行了蚀刻。蚀刻 SiO2的范围取决于所用 a-Si 蚀刻参数、设备甚至单个设备校准的选择性。在这两个过程中，应小心不要蚀刻整个 SiO2层。

另一个敏感的步骤是 SiO2增长。生长过程取决于腔室湿度和所用TEOS的当前活性。TEOS在吸附空气中的水时会降解，导致其随着年龄的老化而变得不那么有效。即使适当储存化学品，这在几个月内也会明显缓慢、可控。34如果生成的 SiO2层比预期薄，这可能表示 TEOS 有问题，而不是腔室湿度。虽然较低的湿度也会导致较低的生长速率和更薄的薄膜，但产生的薄膜也应比正常表面更光滑。同时，粗粒度和粗糙的层将相反地表示高湿度问题。

也可以在任何其他自由选择的基材上执行此协议，有两个要求：它必须同时承受 HF 蚀刻（步骤 12）和 PECVD 的 200-300 °C 温度（步骤 6）。如果使用更灵敏的基板，a-Si的PECVD温度可以安全降至100°C，但如果按照所述协议执行，则无法避免HF。为了规避高频，需要应用额外的牺牲层。如果去除HF蚀刻的要求，该协议将与其他更广泛的基材材料和金属选择兼容。

由于该协议由常用和坚固的微和纳米制造工艺组成，因此可以与需要小特征尺寸和复杂金属形状的任意数量的其他微制造协议结合使用。在不久的将来，特别是随着低成本DNA折纸大规模生产31的到来，这种方法有可能促进基于界面的纳米光子和质子的一般使用和高通量纳米图案55.

结构DNA纳米技术在近十年中迅速发展，该领域最具影响力的发展可以说是DNA折纸3，4的发明。DNA折纸技术允许制造几乎任何纳米形状与准确的结构特征3，4。这种强大的方法可用于（子）纳米精确空间布置和其他纳米物体的锚定，如碳纳米管5，金属纳米粒子6，7，8， 9， 酶/蛋白质10，11，12，13和治疗材料14，15，16，17.重要的是，这些结构不仅仅是静态的，而且它们也可以被编程成以动态的方式作用18，19。脱氧核糖核酸折纸的无数应用范围从药物交付20，21，22到分子电子/质子5，23，24 25和从材料科学26，27到新颖的成像和校准技术28。

除了上述应用外，DNA折纸形状的极端空间分辨率可以在纳米图案和精致的纳米尺度光刻29、30中加以利用。该协议描述了一种使用DNA折纸模板在基材上创建离散和精确的无机纳米结构的光刻方法。这些模板可以有效地生产各种形状和大量的31，并毫不费力地沉积在选定的基材在大尺度32。这些特性允许一步高度并行地制造数十亿个纳米结构，而不是通常使用但比较慢的电子束光刻或其他基于扫描的纳米制造技术。

在此，通过在氮化硅和蓝宝石基板上创建金弓形结构来证明制造工艺;换句话说，DNA折纸的空间信息被转移到完全金属纳米结构。如本文所述，该技术并不限于选定的弓形DNA折纸结构，因为该方法允许使用几乎任何DNA折纸形状。此外，通过有条不紊的修改，该技术可以扩展到不同的金属和基材，为元表面33的制造铺平道路。

以DNA折纸为中介的制造表面可用作多功能传感器;例如，它们可用于表面增强拉曼光谱（SERS）。由于单个纳米形状的小尺寸，所创建的曲面可能在可见波长范围内在光学和质子应用中找到用途。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1256px;" width="1255">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Acetone</td>
			<td style="width:205px;">Honeywell</td>
			<td style="width:165px;">40289H</td>
			<td style="width:535px;">Semiconductor grade ULSI, &#8805; 99.5 %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>1036603</td>
			<td>Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>10652251</td>
			<td>25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BRANSON 5510</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimension Icon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Atomic force microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron-beam evaporator IM-9912</td>
			<td>Instrumentti Mattila</td>
			<td></td>
			<td>Evaporator for PVD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8751</td>
			<td>Fluorescent dye for DNA staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eon Microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Doc XR+ Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Loading Dye, Blue (6&#215;)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7021S</td>
			<td>Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-storm GS1 Thermal cycler</td>
			<td>Gene Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBR 4</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td>Heating bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>40213H</td>
			<td>Semiconductor grade, 49.5-50.5 %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>40301H</td>
			<td>Semiconductor grade VLSI, &#8805; 99.8 %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Anhydrous, &#8805; 98 %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmalab 80+ PECVD</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>PECVD system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmalab 80+ RIE</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>RIE system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>BioUltra, 8,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sapphire substrate (Al2O3)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness: 430 &#956;m, Polish: DSP, Size: 50.8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica gel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1019691000</td>
			<td>With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Single-stranded Scaffold DNA, type p7249</td>
			<td>Tilibit Nanosystems</td>
			<td></td>
			<td>At 100 nM concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>ACS reagent, &#8805; 99.0 %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staple strands (oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TAE buffer (50&#215;) pH 8.0</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>444125D</td>
			<td>Electran Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Take3 micro-volume plate</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Used for DNA origami concentration measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetraethyl orthosilicate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86578</td>
			<td>&#8805; 99.0 % (GC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna origami-mediated substrate nanopatterning of inorganic structures for sensing applications

结构DNA纳米技术提供了一个可行的途径，从下到上，使用DNA作为建筑材料。最常见的DNA纳米制造技术称为DNA折纸，它允许高通量合成精确和高度通用的结构与纳米级精度。在这里，它展示了如何通过将自下而上的DNA折纸与常规使用的自上而下的平版印刷方法相结合，将DNA折纸的空间信息转移到金属纳米结构。这样，就可以一步一步地将数十亿的微小纳米结构制造到选定的基材上。该方法使用弓形DNA折纸在氮化硅或蓝宝石基板上创建金属弓形天线结构。该方法依赖于折纸沉积基板上氧化硅层的选择性生长，从而形成用于后续光刻步骤的图案掩模。这些配备纳米结构的表面可进一步用作分子传感器（例如，表面增强的拉曼光谱（SERS）））和在可见波长范围内的各种其他光学应用，由于小特征尺寸（低于10纳米）。该技术可以通过方法修改扩展到其他材料;因此，产生的光学活性表面可能会用于超材料和元表面的开发。

弓形DNA折纸设计的示意图及其结构细节如图1所示。阿加玫瑰凝胶电泳和AFM用于分析DNA折纸折叠和PEG纯化的质量（图2）。纳米光刻步骤的工艺流程如图3所示。图 4显示了 SiO2掩膜生长后的代表性 AFM 图像（此步骤如图3D所示），而最终金属纳米结构的 SEM 图像如图5所示（此步骤在图 3H.图 6显示了由弓形 DNA 折纸模板的金属纳米结构的光学功能。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">折叠缓冲液 （FOB） 组件浓度 [mM]</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>特里斯</td>
			<td>醋酸</td>
			<td>Edta</td>
			<td>氯化镁</td>
			<td>Ph</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5x FOB</td>
			<td>100</td>
			<td>47.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>31.25</td>
			<td>¥8，3</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x FOB</td>
			<td>40</td>
			<td>19</td>
			<td>1</td>
			<td>12.5</td>
			<td>¥8，3</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：折叠缓冲器（FOB）的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>温度范围 [oC]</td>
			<td>冷却速率</td>
		</tr>
<tr>
<td>90-70</td>
			<td>-0.2 °C / 8 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>70-60</td>
			<td>-0.1 °C / 8 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>60-27</td>
			<td>-0.1 °C / 2 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>保持直到停止</td>
		</tr>
</tbody></table>表2：蝴蝶结折纸折叠的热斜坡。退火后，折纸将储存在 12 oC，直到程序手动停止。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>PECVD 和 RIE 参数</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>气体</td>
			<td>气体流量 [sccm]</td>
			<td>腔室压力 [mTorr]</td>
			<td>射频功率 [W]</td>
			<td>温度 [oC]</td>
			<td>持续时间 [s]</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-Si 的 PECVD</td>
			<td>5% SiH4 in N2
</td>
			<td>500</td>
			<td>1000</td>
			<td>15</td>
			<td>250</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>O2等离子处理</td>
			<td>O2
</td>
			<td>50</td>
			<td>40</td>
			<td>200</td>
			<td>30</td>
			<td>1200</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SiO2的 RIE
</td>
			<td>CHF3
</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ar</td>
			<td>25</td>
			<td>30</td>
			<td>100</td>
			<td>25</td>
			<td>10-22</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-Si 的 RIE</td>
			<td>O2
</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>SF6
</td>
			<td>100</td>
			<td>90</td>
			<td>50</td>
			<td>30</td>
			<td>35</td>
		</tr>
<tr>
<td>剩余 a-Si 的 RIE</td>
			<td>O2
</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>SF6
</td>
			<td>100</td>
			<td>90</td>
			<td>50</td>
			<td>30</td>
			<td>35-40</td>
		</tr>
</tbody></table>表3：等离子体增强化学气相沉积（PECVD）和活性电子蚀刻（RIE）的工艺参数。这些设备的工艺参数特定于单个仪器，在使用时可能需要进行调整。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig1.jpg"> 图1：弓形DNA折纸的设计。（A） 弓形折纸设计的原理表示，其中核心结构显示为双螺旋，多T悬垂被描绘成波浪线。（B） caDNAno 软件中弓形折纸部分设计的屏幕截图。红色十字表示用于扭曲校正的基对跳过，并添加 T8悬垂以防止钝端基堆叠。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig2.jpg"> 图2：弓形DNA折纸结构的表征。（A） 在聚（乙二醇）（PEG）纯化前后，弓形结构的甘蔗糖凝胶电泳。7249核苷酸长支架用作参考。（B） 原子力显微镜 （AFM） 在净化前的弓形结构图像。（C） PEG纯化后弓形结构的AFM图像.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig3.jpg"> 图3：制造工艺流程方案（尺寸不在比例范围内）。（A） 切碎并清洁基板.（B） 通过等离子体增强的化学气相沉积 （PECVD） 沉积 a-Si 层。*可以在 a-Si 下使用额外的牺牲层，以便使用 HF 以外的蚀刻剂进行提升。（D） 在干燥器中生长 SiO2掩膜。（E） 蚀刻 SiO2的薄层，并通过反应式 ion 蚀刻 （RIE） 穿过其下方的 a-Si。（F） 通过物理气相沉积 （PVD） 将金属通过掩膜沉积。（G） 用 HF （H） 升空，由 RIE 移除剩余的 a-Si。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig4.jpg">
图4：具有DNA折纸形状图案的SiO2胶片的代表性AFM图像。 （A） 10 μm x 10 μm 扫描区域显示了图案形成的高收率。（B） 更近的 3 μm x 3 μm 扫描显示 SiO2胶片中的准确单个模式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig5.jpg"> 图5：具有代表性的扫描电子显微镜（SEM）图像的金属纳米结构模板与结构不同的DNA折纸。（A） 十字形DNA折纸，即所谓的西曼瓷砖折纸54。（B） 鲍蒂天线.（C） 奇性双L （CDL） 结构.内展显示箱体尺寸为 150 nm x 150 nm 的单个结构。精确结构的制造产量高达76%的弓形折纸和+50%的其他结构显示这里34。这个数字已由沈等人34年改编和修改。该图经作者许可转载，由美国科学促进协会出版，2018年出版。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60313/60313fig6.jpg"> 图6：产生纳米结构的代表性光学/功能特性。（A） 不同极化（颜色编码为橙色和蓝色）的单个金弓形结构的局部表面质子共振 （LSPR） 测量。实线是测量光谱，虚线是模拟结果。入内图显示测量粒子的 SEM 图像（左图）和用于模拟的模型（右图）。（B） 在覆盖着弓形纳米结构的表面测量的罗达明6G和2，2-bipyridine的表面增强拉曼光谱（SERS）。每个样本的基线显示纳米结构不存在时的信号电平。这个数字已由沈等人34年改编和修改。该图经作者许可转载，由美国科学促进协会出版，2018年出版。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/60313fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Supplemental File 1" src="/files/ftp_upload/60313/60313sup1.jpg"> 补充文件1：CaDNAno文件<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/bowtie_poly-T.json" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
<img alt="Supplemental File 2" src="/files/ftp_upload/60313/60313sup2.jpg"> 补充文件2：m13mp18序列<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/m13mp18_sequence.txt" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
<img alt="Supplemental File 3" src="/files/ftp_upload/60313/60313sup3.jpg"> 补充文件 3： 装订线序列<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60313/bowtie_staple_sequences.xlsx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>

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DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

在这里，我们描述了一种使用DNA折纸形状作为指导模板在基材上创建离散和精确的无机纳米结构的协议。该方法通过在透明基板（蓝宝石）上创建质质金弓形天线来证明。

脱氧核糖核酸介导基板无机结构纳米图案用于传感应用

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

该协议将自下而上的DNA折纸技术与自上而下的纳米制造方法相结合，允许在不同基材上并行制造具有低于10纳米特征尺寸的无机纳米结构。这种技术可用于一次创建数十亿精确的纳米结构，几乎以任何形状，而无需昂贵的图案方法。这种方法具有在表面增强拉曼光谱等传感应用中的潜力，并具有创造新型光学元表面的潜力。虽然此协议相当简单，但需要更多的学科制造技能，因此，视觉演示对于具有各种背景的研究人员非常有用。与佩特里·皮斯库宁一起演示这个程序的将是索菲亚·朱林，我们实验室的另一位研究生。为了制造主食链的库存，将领结结构所需的所有寡核苷酸混合，在 200 微升 PCR 管中混合 M13 MP18 脚手架链的 20 微升和 40 微升 2.5 X 折叠缓冲液。然后将反应混合物从90摄氏度到27摄氏度的热循环器中退火，如表中所示。要准备基材，将从蓝宝石晶圆中切割的大约 7 x 7 毫米的芯片浸入 52 摄氏度丙酮的玻璃容器中至少 15 分钟，然后将芯片转移到异丙醇的玻璃容器中，进行两分钟的声波化。在声波化结束时，使用钳子从异丙醇中去除芯片，并在芯片表面与流的方向平行时，立即用氮气在最高流量下干燥芯片。对于非晶硅层的等离子体增强化学气相沉积，将干燥芯片放入等离子增强化学气相沉积仪器中，根据仪器模型和校准设置沉积参数，以生长约50纳米的非晶硅。对于非晶硅层的氧等离子体处理，将芯片放入反应离子蚀刻仪中，根据仪器模型和校准设置蚀刻参数以产生氧等离子体。然后运行氧气等离子体治疗程序。在氧气等离子体处理后30分钟内，将5微升折叠和纯化的DNA折纸溶液与4个微升折叠缓冲液和1微升的氯化摩尔镁混合。将 10 微升的 DNA 折纸混合物沉积到每个氧气等离子体处理芯片上，并在室温下覆盖芯片进行 5 分钟的孵育。在孵化结束时，用100微升蒸馏水清洗芯片表面，用移液器来回冲洗水几次，同时避免接触芯片的中心。在再次吹了两到三次后，立即用氮流干燥芯片。要种植二氧化硅面膜，请将 100 克硅胶与 30 毫升蒸馏水混合。将硅胶混合物放入干燥器中，用穿孔板分离凝胶。24小时后，将含有吸附DNA折纸的芯片放在干燥器的穿孔平台上，在芯片的一侧放置含有10毫升四乙基矫酸的小瓶，将含有10毫升氢氧化铵的小瓶放在芯片的另一侧。然后在室温下密封室20小时。在孵化结束时，在没有DNA折纸结构的区域上会形成二氧化硅薄膜，形成一个10到20纳米的图案面膜，并形成DNA折纸形状的孔。对于二氧化硅的活性离子蚀刻，将芯片放入反应离子蚀刻仪器中，将蚀刻参数设置为仅蚀刻二氧化硅的两到五个气压计，以揭示二氧化硅掩膜孔下无定形硅层。所有蚀刻参数都应针对所选仪器进行优化，因为正确的参数取决于设备类型和特定设置。可能需要一些迭代。运行各向异性二氧化硅等离子体蚀刻程序后，将蚀刻参数设定为穿透50纳米非晶硅层。然后运行等向硅质蚀刻程序。对于物理气相沉积，将芯片加载到物理气相沉积仪的蒸发室中，并选择粘合目标金属。设置目标材料和厚度的厚度控制程序，启动电子束，将光束与目标对齐，并增加光束电流，直到达到 0.05 纳米/秒的沉积速率。然后蒸发，直到达到两纳米的最终厚度。在蒸发结束时，选择第二个目标金属而不通风室或中断过程并设置厚度。将电子束与目标对齐，直到达到 0.05 纳米/秒沉积速率，然后蒸发，直到达到 20 纳米厚度。DNA折纸形状的金属结构将形成通过总高度为22纳米的二氧化硅面罩孔。排出腔室后，取出样品。对于氢氟酸的升空，将样品浸入氢氟酸基蚀刻中，并使用塑料钳子轻轻搅拌样品。等待二氧化硅层完全蚀刻和金属层分离，然后再用双蒸馏水和异丙醇冲洗样品。然后用氮液干燥样品，如所证明的。对于剩余非晶硅的活性离子蚀刻，将芯片放入反应离子蚀刻仪器中，并通过去除所有50纳米的非晶硅来设置蚀刻参数。运行同向非晶硅等离子体蚀刻程序以去除剩余的非晶硅。然后从反应离子蚀刻设备中去除样品，并将其存放在带盖的容器中。阿加罗斯凝胶电泳和原子力显微镜可用于分析DNA折纸折叠和聚乙烯二醇纯化的质量。在这里，显示了二氧化硅掩膜生长后具有代表性的原子力显微镜图像。在这些图像中，可以观察到最终金属纳米结构的电子显微镜。在这些图形中，分析了金属纳米结构的光学功能，由领结DNA折纸模板化。二氧化硅掩码生长对过程至关重要，对TEOS的湿度和反应性相当敏感。因此，应仔细控制这些参数，以进行可重复性。如果DNA折纸技术进一步与高有序的DNA模式相结合，它可能为在可见波长范围内制造超材料和表面铺平道路。

Research

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Chemistry

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微流控芯片上捕获环加成反应可逆地固定小分子或多组分结构的生物传感器应用

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