Name: chronic, acute, and reactivated hiv infection in humanized immunodeficient mouse models
Uploaded: 2019-12-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den internen Fonds der Klinischen Abteilung IHV an JCZ unterstützt.

Bei dieser Arbeit wurden alle Tierpflege- und -verfahren nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland School of Medicine überprüft und genehmigt wurden (Protokollnummern 1018017, 1018018 und 0318009).
1. Humane CD34+ HSC-Transplantation von neugeborenen Mäusen
<ol><li>Verwenden Sie immer Einweg-Personenschutzausrüstung (PPE), einschließlich steriler Peelings, Handschuhe, spezielle Schuhe, Schuhbezüge, ...

<ol>
	<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).</li><li>Koboziev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+humanized+mice+to+study+the+pathogenesis+of+autoimmune+and+inflammatory+diseases.">Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+An+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD/SCID/IL2+receptor+{gamma}+chain(null)+mice.">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li><li>Kim, K. 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Wichtige Fortschritte wurden bei der Entwicklung von immundefizienten Mausstämmen für die Humanisierung erzielt, mit einer Reihe von verschiedenen Optionen, die je nach Forschungsinteresse verwendet werden können1. Hier ist ein allgemeines Protokoll zur Humanisierung von NS-Kettenull Mäuse n und genetisch ähnliche Stämme in drei verschiedenen Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektion verwendet werden. Im ersten experimentellen Ansatz werden bestrahlte neugeborene Mäuse mit...

Das humanisierte Mausmodell NOD/SCID/interleukin (IL)-2-Rezeptor-Chain null (im Folgenden als huNS-Kettenullbezeichnet) wurde häufig zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen, Autoimmunität und Krebs sowie für präklinische Studien von Medikamenten und humanzellbasierten Therapien1,2verwendet. Diese Mäuse basieren auf einem nicht-fettleibigen Diabetiker (NOD) Hintergrund, mit der scid-Mutation und gezielten Mutation am IL-2-Rezeptor-Ketten-Lokus (gemeinsame Kette für IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21), die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B-, und natürlichen Killerzellen (NK) verursachen, die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B- und natürlichen Killerzellen (NK)verursachen. So unterstützen sie die Engraftierung von menschlichem Gewebe, humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)3,4,5. Darüber hinaus fördert die transgene Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren, wie Stammzellenfaktor (SCF), Granulozyt/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), und IL-3 die Engraftmentierung menschlicher Myeloidpopulationen6,7,8.
Für HIV-Studien wurden mehrere huNS-Kette Null-Maus-Modelle beschrieben, die sich in der Maus Stamm, Art der verwendeten menschlichen Zellen, Art des Gewebes für die Engraftment und Herkunft der Zellen (d.h. gesund vs. HIV-infizierter Spender)9,10. Der ursprüngliche Stamm ist jedoch aufgrund der hohen Konzentration menschlicher Zellen und der Virusreplikation nach einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm11,12,13weit verbreitet. Ähnliche immundefiziöse Mausstämme mit transgener Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren (z. B. NOG-EXL oder NSG-SGM3) oder mit Implantaten menschlicher Leber- und Thymusgewebe (Knochenmark-Leber-Thymus [BLT]-Mäuse) sind nützlich für die Bewertung der Rolle von Myeloidpopulationen bei der Anti-HIV-Immunantwort, den Auswirkungen von HIV auf diese Gewebe und deren Beteiligung als Virusreservoir14,15. Darüber hinaus können einige Stämme mit transgener Expression von humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Molekülen sowie BLT-Mäusen zur Untersuchung der T-Zell-Reaktion auf HIV-Infektionen16,17verwendet werden.
Im Allgemeinen hängt die Humanisierung bei diesen Mäusen vom zellulären Ursprung, dem Verabreichungsweg (intraperitoneal, intrahepatisch, intravenös, intrakardial) und dem Mausalter zum Zeitpunkt der Transplantation18,19,20ab. In Bezug auf den Zellursprung können menschliche CD34+ HSC aus Nabelschnurblut, fetaler Leber oder mobilisiertem peripherem Blut bei neugeborenen oder jungen Mäusen injiziert werden3,21. Darüber hinaus können erwachseneNull-Mäuse durch Injektion von PBMC (hier als hu-PBL-NS-Kettenull-Mäuse bezeichnet) humanisiert werden, was die zeitliche Zirkulation dieser Zellen im Blut, sekundären Lymphorganen und entzündeten Geweben22,23,24ermöglicht.
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von huNS-Kette Null-Maus-Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektionen beschrieben. Das erste ist das chronische Modell, bei dem menschliche CD34+ HSCs, die aus Nabelschnurblut von einem gesunden Spender stammen, bei neugeborenen Mäusen injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 14 Wochen Rekonstitution des menschlichen Immunsystems. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von Mäusen für bis zu 36 Wochen nach der Infektion. Das zweite Modell ist ein akutes Modell, bei dem PBMCs, die von einem gesunden Spender abgeleitet wurden, in erwachsene NS-Kettenull Mäuse injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 3 Wochen menschlicher T-Zell-Expansion in der Maus. Das dritte Modell schließlich ist das Reaktivierungsmodell, bei dem PBMCs, die von einem HIV-infizierten Spender im Rahmen einer unterdrückenden antiretroviralen Therapie (ART) abgeleitet wurden, in adulte NS-Kettenull Mäuse injiziert werden. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung eine virale Reaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die beiden letztgenannten Modelle ermöglichen eine Überwachung von bis zu 9 Wochen nach der Transplantation.
Insgesamt sind diese drei Modelle nützlich für virologische Studien, präklinische Studien neuartiger Medikamente und die Bewertung der Auswirkungen von HIV-Infektionen auf die globale Immunantwort. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass die Verwendung von HIV-infizierten humanisierten Mäusen vor jedem Experiment eine Überprüfung und Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC) sowie durch den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erfordert. Dadurch wird sichergestellt, dass die Studie alle internen und externen institutionellen Vorschriften für die Verwendung von gefährlichem biologischem Material und den humanen Umgang mit Versuchstieren befolgt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0. 5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>3735.S.X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>3745.S.X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serologial pipetes</td>
			<td>stellar sceintific</td>
			<td>VL-4090-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Stellar scientific</td>
			<td>T15-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Serologial pipetes</td>
			<td>stellar sceintific</td>
			<td>VL-4090-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serologial pipetes</td>
			<td>stellar sceintific</td>
			<td>VL-4090-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Stellar scientific</td>
			<td>T50-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Quality biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-669-62</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 clone UCHT1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300439</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317420</td>
			<td>AF488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 clone 2D1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368522</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 clone SK1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344710</td>
			<td>PerCP-Cy5.5 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafaty cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonnet</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17-100-900</td>
			<td>Single use cap for basic protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Metrex</td>
			<td>13-1000</td>
			<td>Surface desinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34+ cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2C-101</td>
			<td>As many vials available from a single donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>65-6KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear jar</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>77977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze pad</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-415-468</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable lab coats</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>19-472-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA micro tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Mask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17-100-897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS lysing solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>340202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS premium HI</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S1115OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE health one</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used FACS Aria II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>5 ml polystyrene and round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV BaL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in our uQUANT core facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PBMCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HIV positive and negative volunteers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared warming pad</td>
			<td>Venet scientific</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>Temporary therapeutic warming pad for small animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isentress (Raltegravir)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NSC 0006-0227061</td>
			<td>Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark I irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment belonging to university of Maryland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear tags</td>
			<td>National Band &#38; Tag company</td>
			<td>1005-1L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natelson blood collection tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>02-668-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOG-EXL</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>HSCFTL-13395-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSG mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>5557</td>
			<td>Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSG-SGM3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>13062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>100-10-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantistudio qPCR machine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>QS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media 1640 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoe covers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17-100-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gloves</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>SUF-524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10080-400</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 28-G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>329-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 29-G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>324-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truvada (Emtricitabine and Tenofovir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td>NDC 61958-0701-1</td>
			<td>Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Cell count and viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vick Vaporub</td>
			<td>School health</td>
			<td>43214</td>
			<td>Ointment based on menthol and eucalyptus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water molecular biology grade</td>
			<td>Quality biological</td>
			<td>351-029-131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chronic, acute, and reactivated hiv infection in humanized immunodeficient mouse models

Humanisierte NOD/SCID/IL-2-Rezeptor-Null-Mäuse rekapitulieren einige Merkmale der menschlichen Immunität, die in der grundlegenden und präklinischen Forschung an Infektionskrankheiten genutzt werden können. Hier sind drei Modelle von humanisierten immundefizienten Mäusen beschrieben, um die Dynamik einer HIV-Infektion zu untersuchen. Die erste basiert auf der intrahepatischen Injektion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen bei neugeborenen Mäusen, die die Rekonstitution mehrerer Blut- und Lymphgewebezellen ermöglicht, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von bis zu 36 Wochen nach der Infektion und wird daher als chronisches Modell bezeichnet. Das zweite und dritte Modell werden als die akuten und Reaktivierungsmodelle bezeichnet, bei denen periphere mononukleäre Blutzellen intraperitoneal in erwachsene Mäuse injiziert werden. Im akuten Modell werden Zellen eines gesunden Spenders über den intraperitonealen Weg transplantiert, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Schließlich werden im Reaktivierungsmodell Zellen eines HIV-infizierten Spenders unter antiretroviraler Therapie über den intraperitonealen Weg transplantiert. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung in der Maus eine Virusreaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben den konventionellen experimentellen Ansatz für humanisierte, immundefizienten Mausmodelle einer HIV-Infektion.

Wie oben beschrieben, werden die Mäuse nach 14 Wochen nach der HSC-Injektion (chronisches Modell) oder nach 3 Wochen nach der PBMC-Injektion (akute und Reaktivierungsmodelle) zum Screening des Niveaus der Enpfropz menschlicher Zellen durch Durchflusszytometrie ausgeblutet. Eine repräsentative Gating-Strategie für die Bewertung von 1) menschlichen CD45+ Zellen Rekonstitution und 2) Prozentsatz von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist in Abbildung 1Ad...

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Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Dieses Verfahren beschreibt drei Modelle humanisierter immundefiziater Mäuse für die Untersuchung der Dynamik einer HIV-Infektion. NSG humanisierte Mäuse rekapitulieren auf Merkmale der menschlichen Immunität. In diesem Fall, die Untersuchung der chronischen, akuten und reaktivierten HIV-Infektion in präklinischen Umgebungen.Demonstriert wird das Zellpräparat sverfahren: Sandra Medina-Moreno, Laborforschungsleiterin aus unserer Gruppe. Verwenden Sie bei dieser Durchführung dieses Verfahrens immer persönliche Einwegschutzausrüstung, einschließlich steriler Peelings, Handschuhe, spezielle Schuhe, Schuhbezüge, Maske, Brille, Haar- und Barthauben und einen sterilen Labormantel. Für das chronische Modell, resuspend eine Million gefrorene CD34 + menschliche Stammzellen in 10 Milliliter RPMI 1640 Medien mit 10%FBS unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank und halten sterile Bedingungen.Verwenden Sie 10 Mikroliter der Suspension, um die Zelllebensfähigkeit durch Trypan Blue-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer zu zählen und zu überprüfen. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 400 mal g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in kalten 1X PBS in der erforderlichen Konzentration wieder aus.Halten Sie die Zellen auf Eis bis zur Injektion. Reiben Sie saubere Bettwäsche zwischen den Händen, um alle anderen fremden Gerüche auf den EmpfängerWelpen zu maskieren. Dann legen Sie Welpen in eine sterile 100 Quadratmillimeter Petrischale zusammen mit einer kleinen Menge Vonstreumaterial aus dem Züchterkäfig.Legen Sie die Petrischale in einen sauberen Transportkäfig und legen Sie den Käfig dann in einen Carboy Transportkäfig, um Welpen vor direktem Licht und Lärm zu schützen. Bedecken Sie den Transportkäfig mit einem Abdeck, um die Exposition von Tieren gegenüber der Umwelt während des Transports zum Bestrahlungsraum zu vermeiden. Nach der Anästhesisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Transplantation durch Leberinjektion vor.Um die Zeit der Mauszurückhaltung zu minimieren, lassen Sie einen Prüfer die Spritze mit der Stammzellsuspension beladen und lassen Sie den zweiten Prüfer den Welpen halten und die Injektion verabreichen. 50 Mikroliter der CD34+human entoserten Stammzellsuspension mit einer beigefügten Nadel unter den zertifizierten Biosicherheitsschrank in die Spritze geben. Halten Sie die Welpen mit Daumen und Zeigefinger zurück und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol.Verwenden Sie einen flachen Nadelwinkel, um 50 Mikroliter Zellen direkt in die Leber zu liefern, um die Leber nicht vollständig zu durchbohren. Die Schale mit einem Infrarot-Wärmepolster für Nagetiere bei 20 Grad Celsius vorwärmen, um sicherzustellen, dass die Welpen nicht überwärmt werden. Legen Sie die Welpen auf die Petrischale mit steriler Gaze für ein bis fünf Minuten bedeckt, um eine Erholung zu ermöglichen.Unmittelbar vor der Rückgabe der Welpen an ihre Eltern, wenden Sie eine kleine Menge Menthol und Eukalyptus-basierte Salbe mit dem Daumen und Zeigefinger auf die Schnis beider Eltern, um Kannibalismus oder Ablehnung der Welpen zu vermeiden. Überprüfen Sie Käfige jeden Tag, auf der Suche nach Anzeichen von Transplantat versus Wirtskrankheit in den Welpen wie trockene Haut, keine Fütterung, Hautausschlag, oder Alopezie. Entwöhnen Sie die Welpen im Alter von drei Wochen und beherbergen sie in verschiedenen Käfigen.Verifizieren Sie die Engraftmentierung im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie im Alter von 14 Wochen. Es wird eine repräsentative Gating-Strategie für die Bewertung der menschlichen CD45+Zell-Rekonstruktion und des Prozentsatzes der CD4+- und CD8+T-Zellen angezeigt. Die Erfolgsrate der Engraftmentistin liegt zwischen 80% und 100%Verwenden Sie menschliche periphere mononukleäre Blutzellen, die von einem gesunden Spender für das akute Modell oder von einem HIV-infizierten Patienten abgeleitet wurden, der sich für das Reaktivierungsmodell einer antiretroviralen Therapie unterzog.15 Milliliter Vollblut in fünf Millilitern steriler Dichte schichte medium in eine 50 Milliliter konische Röhre. Zentrifuge bei 400 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Pausen, um zu vermeiden, dass sich das buffy Fell mit dem Dichtegradientenmedium vermischt. Sammeln Sie vorsichtig den Anteil der mononukleären Zellen zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem Überstand.Übertragen Sie das buffy Mantel in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit 10 Milliliter 1X PBS. Zentrifuge bei 300 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen, indem Sie mit fünf Millilitern ACK-Lysepuffer, der den Pelletzellen zugesetzt wird, lysieren.Vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Zentrifugieren wieder wie zuvor, entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren in 10 Milliliter 1X PBS oder RPMI 1640 medium. Verwenden Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit durch Trypan Blue-Ausschlussfärbung in einem Hämozytometer zu überprüfen.Typischerweise werden für jeden Milliliter Blut ein bis zwei Millionen Zellen mit mehr als 95% Lebensfähigkeit erhalten. Nach der Zentrifugation wie bisher, entsorgen Sie den Überstand und passen Sie die Zellzahl an die erforderliche Konzentration an. Laden Sie 3,5 Millionen periphere mononukleäre Blutzellen in 200 Mikroliter 1X PBS in eine Spritze mit einer beigefügten Nadel unter einem zertifizierten Biosicherheitsschrank.Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und halten Sie sie am Schwanz, damit sie das Netz mit sanfter Traktion nach hinten greifen kann. Legen Sie dann den Zeigefinger und den Daumen auf die Schultern des Tieres, das die lockere Haut des Halses packt und den Mittelfinger benutzt, um seinen Rücken zu stabilisieren. Schieben Sie den Mauskopf nach hinten, so dass sein Rücken über seinem Kopf ist.Dadurch kann die Eingeweide in der Bauchhöhle nach hinten verschoben werden und das Risiko, während der Injektion innere Organe zu durchkreuzen, reduziert werden. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Alkohol. Durchdringen Sie die vorbereitete Spritze durch die Bauchwand und aspirieren Sie, bevor Sie die Zellen injizieren.Wenn Material angesaugt wird, entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie sie. Andernfalls injizieren Sie die Zellen langsam in die intraperitoneale Höhle, bevor Sie die Spritze entfernen und entsorgen. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überprüfen Sie die Transplantation im peripheren Blut durch Durchflusszytometrie nach drei Wochen nach der Injektion.Identifizieren Sie Mäuse durch Ohrmarkierungen. Beobachten Sie die Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet werden, zweimal pro Tag nach jedem Eingriff bei klinischen Anzeichen von Not. Fahren Sie dann mit der HIV-Injektion fort, wie im Textprotokoll beschrieben.Nach der HIV-Injektion ist eine schnelle Zunahme der Plasmaviruslast in der Regel nach zwei bis drei Wochen nach der Infektion sowohl bei den chronischen als auch bei den akuten Modellen mit ähnlicher Kinetik im Reaktivierungsmodell nachweisbar. Die Zunahme der Viruslast fällt mit einem Rückgang des CD4:CD8-Verhältnisses zusammen. Diese Veränderungen werden bei Kontrollmäusen nicht beobachtet.Bemerkenswert ist, dass im humanisierten PBMC NSG Adult Mouse Modell eine anfängliche Umkehrung des CD4:CD8-Verhältnisses beobachtet und entlang der Überwachungszeit rekonstituiert wird. Wenn HIV-infizierten Mäusen eine antiretrovirale Therapie verabreicht wird, traten eine Unterdrückung der Viruslast sowie eine Erholung im CD4:CD8-Verhältnis erwartungsgemäß auf und erreichten ähnliche Werte wie bei nicht infizierten Kontrollen. Typischerweise wird nach zwei bis drei Wochen Behandlung eine Abnahme der Viruslast und eine Erhöhung des CD4:CD8-Verhältnisses in den chronischen, akuten und Reaktivierungsmodellen beobachtet.Verwenden Sie die empfohlene Bestrahlungsdosis, um eine tödliche Überdosierung oder Abstoßung transplantierter Zellen zu vermeiden. Durchbohren Sie die Leber während der Injektion nicht vollständig und verwenden Sie Bettwäsche, um Gerüche zu maskieren, die der Damm als fremd wahrnimmt. Diese drei Modelle ermöglichen tests von antiviralen Verbindungen, Anti-HIV-Antikörpern oder anderen biologischen Substanzen, die die Virusreplikation beeinflussen.Darüber hinaus ermöglichen sie adaptive Transferexperimente für die HIV-Immuntherapie. NSG humanisierte Mäuse können teilweise oder vollständig mit menschlichen Zellen rekonstituiert werden, um auf Krankheitserreger oder Medikamente zu reagieren, was die Komplexität des menschlichen Immunsystems imitiert. Alle grundlegenden biologischen Maßnahmen müssen strikt befolgt werden, da nSG humanisierte Mäuse sowohl mit murinen als auch mit menschlichen Krankheitserregern infiziert werden können, insbesondere in diesem Fall, in dem HIV-Virus manipuliert wird.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

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Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

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Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering Jurkat Reporter Modelle für HIV-1-Infektion mit ausgewählten proviralen Integration Websites generieren

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...