Name: chronic, acute, and reactivated hiv infection in humanized immunodeficient mouse models
Uploaded: 2019-12-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por fundos internos da divisão clínica do IHV para a JCZ.

Neste trabalho, todos os cuidados e procedimentos para animais foram realizados de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland (números de protocolo 1018017, 1018018 e 0318009).
1. Enxertia humana de CD34+ HSC de camundongos recém-nascidos
<ol><li>Use sempre o equipamento de proteção pessoal descartável (PPE), incluindo esfrega estéreis, luvas, sapatas dedicadas, tam...

<ol>
	<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).</li><li>Koboziev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+humanized+mice+to+study+the+pathogenesis+of+autoimmune+and+inflammatory+diseases.">Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+An+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD/SCID/IL2+receptor+{gamma}+chain(null)+mice.">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li><li>Kim, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Engraftment+in+Humanized+Mice:+Impact+of+Granulocyte-Colony+Stimulating+Factor+Treatment+and+Transgenic+Mouse+Strain.">Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain.</a> Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell-Specific+siRNA+Delivery+Suppresses+HIV-1+Infection+in+Humanized+Mice.">T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice.</a> Cell. 134 (4), 577-586 (2008).</li><li>Victor Garcia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+for+HIV+and+AIDS+research.">Humanized mice for HIV and AIDS research.</a> Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).</li><li>Ara&#237;nga, M., Su, H., Poluektova, L. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD/LtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells.">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li><li>King, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Hu-PBL+model+for+the+study+of+human+islet+alloreactivity+based+on+NOD-scid+mice+bearing+a+targeted+mutation+in+the+IL-2+receptor+gamma+chain+gene.">A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene.</a> Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Covassin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+CD4+T+cell-engrafted+non-obese+diabetic-scid+IL2rgamma(null)+H2-Ab1+(tm1Gru)+Tg+(human+leucocyte+antigen+D-related+4)+mice:+a+mouse+model+of+human+allogeneic+graft-versus-host+disease.">Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease.</a> Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).</li><li>Heredia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+mTOR+catalytic+site+inhibits+multiple+steps+of+the+HIV-1+lifecycle+and+suppresses+HIV-1+viremia+in+humanized+mice.">Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).</li><li>Nair, A., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human.">A simple practice guide for dose conversion between animals and human.</a> Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li><li>Miller, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+parameters+that+affect+human+hematopoietic+cell+outputs+in+mutant+c-kit-immunodeficient+mice.">Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice.</a> Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).</li><li>Murphy, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+differentiation+and+lymphomagenesis+in+the+thymus+of+mice+with+severe+combined+immune+deficiency+(SCID).">Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID).</a> Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).</li><li>Poluektova, L. 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Avanços importantes foram alcançados no desenvolvimento de cepas de camundongos imunodeficientes para a humanização, com uma série de opções diferentes que podem ser usadas de acordo com o interesse da pesquisa1. Desde que aqui é um protocolo geral para a humanização de ratosnulos da cadeia de metodos e cepas geneticamente semelhantes a serem empregadas em três modelos diferentes para estudar a infecção pelo HIV. Na primeira abordagem experimental, camundongos recém-nascid...

O modelo humanizado de camundongos nod/SCID/interleucina (IL)-2 receptor diminuidor (doravante referido como huNS γ-cadeianulo)modelo de camundongo tem sido amplamente utilizado para estudar a patogênese de infecções, autoimunidade e câncer, bem como para estudos pré-clínicos de drogas e terapias baseadas em células humanas1,2. Estes camundongos são baseados em um fundo diabético não obeso (NOD), com a mutação cidacada e mutação direcionada no locus il-2 receptor matador-cadeia (massa de turma comum de turma t-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que induzem um grave prejuízo no desenvolvimento de células t-, b-e-assassino natural (NK) do ratoT-,B-e natural (NK) . Assim, eles suportam o enxerto de tecido humano, CD34 humano+ células-tronco hematopoiéticas (HSCs), e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs)3,4,5. Além disso, a expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos, como fator de células-tronco (SCF), fator estimulante da colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e IL-3 promove o enxerto das populações mieloides humanas6,7,8.
Para estudos de HIV, vários modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS foram descritos, que diferem na cepa do camundongo, tipo de células humanas usadas, tipo de tecidos para o enxerto e origem das células (ou seja, saudável vs. Doador infectado pelo HIV)9,10. A cepa original, no entanto, é amplamente utilizada devido aos altos níveis de enxerto de células humanas e replicação viral após a infecção com uma referência da cepa HIV11,12,13. Cepas de camundongos imunodeficientes semelhantes com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos (por exemplo, RATOS NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou com implantes de tecidos do fígado humano e do timo (camundongos de medula óssea-fígado-timo [BLT]) são úteis para avaliar o papel das populações mieloides na resposta imune anti-HIV, efeitos do HIV nesses tecidos e sua participação como reservatórios virais14,15. Além disso, algumas cepas com expressão transgênica de moléculas de antígeno leukócito humano (HLA), bem como camundongos BLT, podem ser usadas para estudar a resposta das células T à infecção pelo HIV16,17.
Em geral, nesses camundongos, a humanização depende da origem celular, da rota de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiac) e da idade do rato no momento do enxerto18,19,20. Em relação à origem celular, CD34+ HSC humano derivado de sangue do cordão umbilical, fígado fetal ou sangue periférico mobilizado pode ser injetado em camundongos recém-nascidos ou jovens3,21. Além disso, camundongosnulos adultos da cadeia de γ podem ser humanizados pela injeção de PBMC (aqui, referido como camundongosnulos da cadeia de metodolses de cadeia de metodolses hu-PBL-NS), permitindo a circulação temporal dessas células no sangue, órgãos linfoidos secundários e tecidos inflamados22,23,24.
Descrito aqui é um protocolo detalhado para o estabelecimento de modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS para o estudo da infecção pelo HIV. O primeiro é o modelo crônico, em que cd34 humanos+ HSCs derivados do sangue do cordão umbilical de um doador saudável são injetados em camundongos recém-nascidos, seguido de infecção com uma cepa de REFERÊNCIA HIV após 14 semanas de reconstituição do sistema imunológico humano. Este modelo permite a monitoração dos ratos por até ~36 semanas após a infecção. O segundo modelo é um modelo agudo, no qual pbmcs derivados de um doador saudável são injetados em adultos ns- cadeia de ratosnulos, seguido por infecção com uma referência da estirpe de HIV após 3 semanas de expansão de células T humanas no mouse. Finalmente, o terceiro modelo é o modelo de reativação, no qual os PBMCs derivados de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral supressiva (TARV) são injetados em camundongosnulos adultos da cadeia de metodols. Neste caso, um ambiente livre de drogas permite a reativação viral e aumento da carga viral. Os dois últimos modelos permitem o monitoramento por até ~9 semanas após o enxerto.
No geral, esses três modelos são úteis para estudos virológicos, estudos pré-clínicos de novos medicamentos e avaliação dos efeitos da infecção pelo HIV na resposta imune global. Também é importante considerar que o uso de camundongos humanizados infectados pelo HIV requer revisão e aprovação pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC), bem como pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) antes de qualquer experimento. Isso garante que o estudo siga todas as regulamentações institucionais internas e externas para o uso de material biológico perigoso e manuseio humano de animais experimentais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0. 5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>3735.S.X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>3745.S.X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serologial pipetes</td>
			<td>stellar sceintific</td>
			<td>VL-4090-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Stellar scientific</td>
			<td>T15-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Serologial pipetes</td>
			<td>stellar sceintific</td>
			<td>VL-4090-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serologial pipetes</td>
			<td>stellar sceintific</td>
			<td>VL-4090-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Stellar scientific</td>
			<td>T50-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Quality biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-669-62</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD3 clone UCHT1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300439</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD4 clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317420</td>
			<td>AF488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD45 clone 2D1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>368522</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human CD8 clone SK1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344710</td>
			<td>PerCP-Cy5.5 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafaty cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonnet</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17-100-900</td>
			<td>Single use cap for basic protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide</td>
			<td>Metrex</td>
			<td>13-1000</td>
			<td>Surface desinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34+ cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2C-101</td>
			<td>As many vials available from a single donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>65-6KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear jar</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>77977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze pad</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-415-468</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable lab coats</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>19-472-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA micro tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Mask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17-100-897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS lysing solution</td>
			<td>BD</td>
			<td>340202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS premium HI</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S1115OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE health one</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used FACS Aria II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td>5 ml polystyrene and round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV BaL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in our uQUANT core facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PBMCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HIV positive and negative volunteers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared warming pad</td>
			<td>Venet scientific</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>Temporary therapeutic warming pad for small animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isentress (Raltegravir)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NSC 0006-0227061</td>
			<td>Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark I irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment belonging to university of Maryland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear tags</td>
			<td>National Band &#38; Tag company</td>
			<td>1005-1L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natelson blood collection tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>02-668-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOG-EXL</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>HSCFTL-13395-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSG mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>5557</td>
			<td>Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSG-SGM3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>13062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>100-10-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantistudio qPCR machine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>QS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media 1640 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shoe covers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17-100-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable Gloves</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>SUF-524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10080-400</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 28-G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>329-461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 29-G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>324-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truvada (Emtricitabine and Tenofovir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td>NDC 61958-0701-1</td>
			<td>Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>Cell count and viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vick Vaporub</td>
			<td>School health</td>
			<td>43214</td>
			<td>Ointment based on menthol and eucalyptus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water molecular biology grade</td>
			<td>Quality biological</td>
			<td>351-029-131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chronic, acute, and reactivated hiv infection in humanized immunodeficient mouse models

Camundongosanulosos humanizados no nod/scid/il-2 receptor nulos recapitulam algumas características da imunidade humana, que podem ser exploradas em pesquisas básicas e pré-clínicas sobre doenças infecciosas. Aqui estão três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV. O primeiro é baseado na injeção intrahepática de CD34+ células-tronco hematopoiéticas em camundongos recém-nascidos, o que permite a reconstituição de várias células confinadas no sangue e tecido linfóide, seguida de infecção por uma cepa de HIV de referência. Este modelo permite o monitoramento por até 36 semanas após a infecção e, portanto, é chamado de modelo crônico. O segundo e o terceiro modelos são referidos como os modelos agudos e de reativação, nos quais as células mononucleares periféricas do sangue são injetadas intraperitoneally em camundongos adultos. No modelo agudo, as células de um doador saudável são enxertadas através da rota intraperitoneal, seguidas de infecção por uma cepa de HIV de referência. Finalmente, no modelo de reativação, as células de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral são enxertadas através da rota intraperitoneal. Neste caso, um ambiente livre de drogas no mouse permite a reativação do vírus e um aumento na carga viral. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a abordagem experimental convencional para modelos de camundongos humanizados e imunodeficientes da infecção pelo HIV.

Conforme descrito acima, em 14 semanas de injeção pós-HSC (modelo crônico) ou em 3 semanas de injeção pós-PBMC (modelos agudos e de reativação), os ratos são sangrados para a triagem do nível de enxerto de células humanas por citometria de fluxo. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação de 1) CD45 humano+ células reconstituição e 2) porcentagem de CD4+ e CD8+ Células T é mostrado na Figura 1A. Normalmente, ...

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Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Este procedimento descreve três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para o estudo da dinâmica da infecção pelo HIV. Ratos humanizados NSG recapitulam características de imunidade humana. Neste caso, permitindo o estudo da infecção crônica, aguda e reativada do HIV em ambientes pré-clínicos.Demonstrando o procedimento de preparação celular estará Sandra Medina-Moreno, supervisora de pesquisa laboratorial do nosso grupo. Ao realizar este procedimento, use sempre equipamentos de proteção pessoal descartáveis, incluindo esfoliantes estéreis, luvas, sapatos dedicados, capas de sapato, máscara, óculos, capô de cabelo e barba, e um jaleco estéril. Para o modelo crônico, resuspenque um milhão de células-tronco CD34+humanas congeladas em 10 mililitros de mídia RPMI 1640 com 10% de FBS sob um armário de biossegurança certificado e mantenha condições estéreis.Use 10 microliters da suspensão para contar e verificar a viabilidade celular pela mancha de exclusão trypan blue em um hemócito. Em seguida, centrifufique a suspensão da célula a 400 vezes g por 15 minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernasciente e resuspenque as células no frio 1X PBS na concentração necessária.Mantenha as células no gelo até a injeção. Esfregue a roupa de cama limpa entre as mãos para mascarar quaisquer outros odores estranhos nos filhotes receptores. Em seguida, coloque os filhotes em uma placa de Petri de 100 milímetros quadrados estéril, juntamente com uma pequena quantidade de material de cama da gaiola do criador.Coloque a placa de Petri em uma gaiola de transporte limpo e, em seguida, coloque a gaiola em uma gaiola de transporte Carboy para proteger os filhotes da luz direta e do ruído. Cubra a gaiola de transporte com uma almofada de cobertura para evitar a exposição dos animais ao ambiente enquanto estiver em trânsito para a sala de irradiação. Após a anestesia, conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para o enxerto por injeção hepática.Para minimizar o tempo de contenção do rato, deixe um investigador carregar a seringa com a suspensão das células-tronco e fazer com que o segundo investigador segure o filhote e administre a injeção. Carregue 50 microliters da suspensão de células-tronco CD34+humanas na seringa com uma agulha anexada sob o armário de biossegurança certificado. Contenha os filhotes com polegar e dedos indicadores e limpe o local da injeção com 70% de álcool.Use um ângulo de agulha raso para entregar 50 microliters de células diretamente no fígado para não perfurar completamente o fígado. Pré-aqueça o prato usando uma almofada de aquecimento infravermelho para roedores a 20 graus Celsius para garantir que os filhotes não serão mais aquecidos. Coloque os filhotes na placa de Petri coberta com gaze estéril por um a cinco minutos para permitir a recuperação.Imediatamente antes de devolver os filhotes aos seus pais, aplique uma pequena quantidade de pomada à base de mentol e eucalipto usando o polegar e os dedos indicadores no focinho de ambos os pais para evitar o canibalismo ou a rejeição dos filhotes. Verifique as gaiolas todos os dias, procurando qualquer sinal de enxerto versus doença hospedeira nos filhotes, como pele seca, sem alimentação, erupção cutânea ou alopecia. Desmamar os filhotes com três semanas de idade e casá-los em gaiolas diferentes.Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo aos 14 semanas de idade. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação da reconstrução celular CD45+e percentual de células CD4+e CD8+T é mostrada. A taxa de sucesso do enxerto é entre 80% a 100% Uso de células mononucleares de sangue periféricos humanos derivadas de um doador saudável para o modelo agudo ou de um paciente infectado pelo HIV que estava sob terapia antirretroviral para o modelo de reativação.Camada 15 mililitros de sangue inteiro em cinco mililitros de gradiente de densidade estéril em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente sem pausas para evitar que o casaco buffy fique misturado com o meio gradiente de densidade. Colete cuidadosamente a fração de células mononucleares entre o gradiente de densidade médio e o sobrenante.Transfira o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 1X PBS. Centrifugar a 300 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernascimento e remova os glóbulos vermelhos restantes, lise com cinco mililitros de tampão de lise ACK adicionados às células pelladas.Incubar por quatro minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifuging novamente como antes, descarte o supernaspe e resuspend em 10 mililitros de 1X PBS ou RPMI 1640 médio. Use 10 microliters da suspensão celular para contar as células e verificar a viabilidade pela mancha de exclusão trypan blue em um hemótmetro.Normalmente, de um a dois milhões de células são obtidas para cada um mililitro de sangue com mais de 95% de viabilidade. Após a centrifugação como antes, descarte o sobrenante e ajuste o número da célula à concentração necessária. Carregue 3,5 milhões de células mononucleares de sangue periféricos em 200 microliters de 1X PBS em uma seringa com uma agulha presa sob um armário de biossegurança certificado.Retire o mouse da gaiola e segure-o pela cauda para que ele possa segurar a malha aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o dedo indicador e o polegar sobre os ombros do animal agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar suas costas. Deslize a cabeça do mouse para trás para que suas costas estão acima de sua cabeça.Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfurar órgãos internos durante a injeção. Limpe o local da injeção com 70% de álcool. Penetre a seringa preparada através da parede abdominal e aspire antes de injetar as células.Se algum material estiver aspirado, remova a seringa e descarte-a. Caso contrário, injete as células lentamente na cavidade intraperitoneal antes de remover a seringa e descartá-la. Devolva o animal à sua gaiola e verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo em três semanas após a injeção.Identifique ratos por marcação de ouvido. Observe os camundongos utilizados nesses experimentos de perto, duas vezes por dia após cada procedimento para sinais clínicos de angústia. Em seguida, proceda à injeção de HIV, conforme descrito no protocolo de texto.Após a injeção do HIV, há um rápido aumento da carga viral plasmática geralmente sendo detectável após duas a três semanas após a infecção em ambos os modelos crônicos e agudos com cinética semelhante no modelo de reativação. O aumento da carga viral coincide com uma diminuição na proporção CD4:CD8. Essas alterações não são observadas em camundongos de controle.Note-se que, no modelo humanizado de mouse adulto PBMC NSG, observa-se uma inversão inicial da razão CD4:CD8 e reconstituída ao longo do tempo de monitoramento. Quando a terapia antirretroviral é administrada em camundongos infectados pelo HIV, a supressão da carga viral, bem como a recuperação na razão CD4:CD8 ocorreram como esperado atingindo níveis semelhantes aos dos que não foram infectados. Normalmente, após duas a três semanas de tratamento, observa-se uma diminuição da carga viral e aumento da razão CD4:CD8 nos modelos crônicos, agudos e de reativação.Use a dose de irradiação recomendada para evitar overdose letal ou rejeição de células transplantadas. Não fure completamente o fígado durante a injeção e use roupa de cama para mascarar odores que a barragem vai perceber como estranho. Esses três modelos permitem o teste de compostos antivirais, anticorpos anti-HIV ou outras substâncias biológicas que afetam a replicação viral.Além disso, permitem experimentos de transferência adaptativa para a imunoterapia do HIV. Camundongos humanizados NSG podem ser reconstituídos parcial ou integralmente com células humanas para responder a patógenos ou drogas, imitando a complexidade do sistema imunológico humano. Todas as medidas biológicas básicas precisam ser rigorosamente seguidas, uma vez que os camundongos humanizados do NSG podem ser infectados com patógenos murinos e humanos, particularmente neste caso que usa manipulação do vírus HIV.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

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Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...