Name: studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video at JoVE.com

लेखक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, बेथेस्डा एमडी, कैंसर और सूजन कार्यक्रम, और फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी - छोटे पशु इमेजिंग कार्यक्रम के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं, लीडोस बायोमेडिकल रिसर्च, इंक, फ्रेडरिक मैरीलैंड, यूएसए।

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	<li>Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+of+triple-negative+breast+cancer:+implications+for+therapy.">Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy.</a> Cancer. 121, 8-16 (2015).</li><li>Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+and+Microenvironment+Plasticity:+Double-Edged+Swords+in+Metastasis.">Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).</li><li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. 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V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Orthotopic+Mouse+Model+of+Spontaneous+Breast+Cancer+Metastasis.">An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).</li><li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth.">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).</li><li>Fletcher, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axillary+dissection+vs+no+axillary+dissection+in+women+with+invasive+breast+cancer+and+sentinel+node+metastasis:+a+randomized+clinical+trial.">Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).</li><li>Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+location+within+the+breast:+Does+tumour+site+have+prognostic+ability?.">Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability?.</a> Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).</li><li>Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. 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L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+augments+xenograft+transplantation+of+meningioma+cells+into+athymic+mice.">Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice.</a> Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).</li><li>Mullen, P., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+matrigel+in+the+establishment+of+ovarian+carcinoma+cell+lines+as+xenografts.">The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).</li><li>Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+matrigel+has+no+influence+on+tumor+development+or+PET+imaging+in+FaDu+human+head+and+neck+cancer+xenografts.">The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts.</a> BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).</li><li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines.">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).</li><li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models.">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

जानवरों में टीएनबीसी के अध्ययन के लिए, दो मूत्र मॉडल विकसित किए गए हैं: एमडीए-एमबी-231 मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाएं प्रतिरक्षा से समझौता चूहों (यानी एथिमिक न्यूड चूहों, एनएसजी चूहों) में और प्रतिरक्षा-सक्षम बीएबी/सी चूहों में 4T1। दोनों मॉडलों के अपने फायदे हैं। एक अध्ययन के लिए पशु मॉडल का चुनाव अनुसंधान लक्ष्यों पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एमडीए-एमबी-231 मॉडल इम्यूनोसमझौता चूहों में उगाई जाने वाली एक मानव टीएनबीसी सेल लाइन है जो इम्यूनोप्रेस्ड मानव स्तन कैंसर के रोगियों की नकल करती है। दूसरी ओर, बाल्ब/सी चूहों में ऑर्थोटोपिक 4T1 ट्रिपल-निगेटिव मोनीमूत्र स्तन कैंसर कोशिकाओं का आक्रामक फेनोटाइप मेटास्टैटिक प्रक्रिया की बारीकी से नकल करता है क्योंकि यह चरण चतुर्थ मानव स्तन कैंसर के रोगियों में होता है । नसों में सेल इंजेक्शन दृष्टिकोण के विपरीत, मानव एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को इसी तरह मैममैरी फैट पैड11,,12 में ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल11,,13में इंजेक्ट किया गया था। लंबे समय तक ट्यूमर की वृद्धि और अर्जित मेटास्टैटिक क्षमता अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, इस प्रकार यह एक कृत्रिम मेटास्टैटिक कैंसर मॉडल4,,14नहीं है। इस तरह के एक सहज मेटाटैसिस मॉडल बारीकी से दीक्षा चरण के अलावा मानव स्तन कैंसर के विकास की नकल करता है । यह मेटास्टैटिक स्तन कैंसर में वीवो ड्रग स्क्रीनिंग और चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण मॉडल है।
माउस में ट्यूमर प्रत्यारोपण साइट एक माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है जो ट्यूमर के विकास को बनाए रखती है और मनुष्यों में होने वाले मेटास्टैटिक फेनोटाइप के चयन के समान है। समीपस्थ लिम्फ नोड और एडीपोस ऊतक की उपस्थिति स्तन कैंसर15,16की रोग प्रगति को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारक हैं । एक मानव रोगी में, लिम्फ नोड और एडीपोज ऊतक दोनों प्रमुख बातचीत कारक हैं जो स्तन कैंसर17,,18,,19की द्रोह और घटनाओं को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, इंजेक्शन साइट के लिए सही शारीरिक स्थान का चयन मानव रोग की तुलना में ट्यूमर मॉडल की प्रासंगिकता को अत्यधिक प्रभावित कर सकता है। इस अध्ययन में मुख्य रूप से उपर्युक्त आवश्यकताओं के कारण प्रत्यारोपण साइट के रूप में चौथी स्तन ग्रंथि का उपयोग किया गया और यह शारीरिक रूप से अधिक सुलभ और हेरफेर करने में आसान है।
विभिन्न ट्यूमर मात्रा गणना विधियों उपलब्ध हैं, और एक शोधकर्ता किसी भी वे फिट देख चुन सकते हैं । इस अध्ययन के लिए चयनित एल्गोरिदम Faustino-Rocha एट अल, जो अलग ट्यूमर मात्रा गणना फार्मूले की तुलना में निष्कर्षों पर आधारित है और निष्कर्ष निकाला है कि नीचे फार्मूला सबसे सटीक20है ।
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स एक महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स विभिन्न इन विट्रो21 में और वीवो22,,23 परख में उपयोग किया जाता है। ज़ेनोबेड़ा द्रोह पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के प्रभाव के बारे में22,,24,,25 विरोधाभासी रिपोर्टें हैं। ऐसा लगता है कि यह केवल विद्वेष की प्रारंभिक स्थापना को प्रभावित करता है और25के विद्वेष विकास पर आगे कोई प्रभाव नहीं पड़ता है । वर्णित विद्वेष प्रत्यारोपण के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कैंसर की कोशिकाओं के साथ मिलाया गया था सेल/जेल मिश्रण समाधान चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए प्रत्यारोपण से पहले । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उपस्थिति इंजेक्शन साइट से मिश्रण समाधान के नुकसान को कम कर देती है और प्रत्यारोपण साइट पर मिश्रण समाधान रखता है, इस प्रकार प्रत्यारोपित विद्वेष की मात्रा की एकरूपता को बढ़ाता है।
एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन एक घातक अमर मानव स्तन adenocarcinoma सेल लाइन है और अपनी ट्रिपल नकारात्मक स्थिति की वजह से स्तन कैंसर अनुसंधान में एक लोकप्रिय उपकरण है। दोहरी रिपोर्टर्स (लूसिफ़ेरेज़ और जीएफपी) सेल लाइन का उपयोग वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग में हैंडलिंग में अधिक लचीलापन की अनुमति देता है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल में जीएफपी संकेतों की तुलना में अधिक संवेदनशीलता, गहराई से पता लगाने की क्षमता और बेहतर विपरीत (सिग्नल-टू-शोर अनुपात) है। इस वजह से, यह पूरे शरीर इमेजिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल इमेजिंग तौर-तरीके है। दुर्भाग्य से, बायोल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन एक संकीर्ण समय खिड़की (~ 15−20 मिनट पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन) द्वारा सीमित है जिसके दौरान सिग्नल डिटेक्शन रैखिक है। BLI संकेत तेजी से घटता है जब जानवरों इच्छामृत्यु कर रहे हैं । यह एक प्रयोगात्मक डिजाइन मुद्दा बन जाता है यदि कई चूहों को इच्छामृत्यु और कई ऊतकों या अंगों की कटाई की आवश्यकता होती है। इन अध्ययनों में, रक्त प्रत्यक्ष दिल पंचर, मस्तिष्क, प्राथमिक ट्यूमर, फेफड़े, और प्रभावित लिम्फ नोड द्वारा काटा गया था ४० चूहों में जांच की गई । जब तक अंगों को काटा गया और पूर्व वीवो इमेजिंग के लिए तैयार किया गया, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल अज्ञेय था। इसलिए, इन स्थितियों में जीएफपी का पता लगाना अधिक उपयुक्त है। जीएफपी सिग्नल का उत्सर्जन दृश्यमान रेंज में है, और इन तरंगदैर्ध्य में, रक्त (यानी हीमोग्लोबिन) के कारण सिग्नल अवशोषण काफी अधिक है। इसके अलावा, NADH, लिपो-पिगमेंट और फ्लेविन के कारण दिखाई देने वाली सीमा में ऑटोफ्लोरेसेंस एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि में परिणाम देता है जो निम्न स्तर के जीएफपी सिग्नल और ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि के बीच अंतर करना मुश्किल बनाता है। पारंपरिक फिल्टर-जोड़ी इमेजिंग के बजाय एक बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग दृष्टिकोण को नियोजित करना और स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग एल्गोरिदम का उपयोग करने से ब्याज के अंग में सच्चे जीएफपी सिग्नल की पहचान करने में मदद मिलती है। इसलिए, पूर्व वीवो अंग/ऊतक मूल्यांकनों में वीवो डिटेक्शन और मल्टीस्पेक्ट्रल जीएफपी इमेजिंग में पूरे शरीर में बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग की ताकत के संयोजन से, चूहों की एक बड़ी पलटन में मात्रात्मक डेटा को अधिकतम किया जा सकता है ।
कोई फर्क नहीं पड़ता कि पशु अध्ययन के लिए किस दृष्टिकोण का चयन किया जाता है, अंग/ऊतक पुनर्प्राप्ति से पहले सभी रक्त निकालने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से मेटास्टैटिक बोझ को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए । यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय पीसीआर assays द्वारा ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल में चूहों (नहीं दिखाए गए डेटा) से प्राप्त पूरे रक्त नमूनों से GFP संकेतों का पता लगाता है। अंगों/ऊतकों में रक्त की मात्रा को कम करने से लक्षित अंगों में झूठे सकारात्मक संकेत कम हो जाएंगे ।
निष्कर्ष में, एमडीए-एमबी-२३१-ल्यूक/जीएफपी कोशिकाओं का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल एक अत्यधिक प्रासंगिक पशु मॉडल है जो मानव टीएनबीसी रोगी की स्थिति की बारीकी से नकल करता है । यह मॉडल मनुष्यों के समान ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन, निगरानी और आकलन करने के लिए आवश्यक है। ड्यूल रिपोर्टर सेल लाइनों का इस्तेमाल इस ऑर्थोटोपिक ब्रेस्ट कैंसर मॉडल की व्यावहारिकता को और बढ़ाता है।

संयुक्त राज्य अमेरिका में आठ महिलाओं में से लगभग एक अपने जीवनकाल के दौरान आक्रामक स्तन कैंसर का विकास होगा, और इन महिलाओं के 10%−20% आक्रामक ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC) उपप्रकार के साथ का निदान किया जाएगा । जबकि प्राथमिक घावों को शल्य चिकित्सा से ज्यादातर मामलों में हटाया जा सकता है, उपनैदानिक माइक्रोमेटास्तासिस और कीमोरेजिस्टेंस इसे एक असभ्य बीमारी बनाते हैं। महत्वपूर्ण बात, मेटास्टैटिक टीएनबीसी के साथ ज्यादातर रोगियों को अंततः पतन, भले ही वे प्रारंभिक चरण1में इलाज से गुजरना पड़ा । इस प्रकार, कैंसर विषमता, माइक्रोमेटास्टेसिस, और चिकित्सीय प्रतिरोध तीन प्रमुख टीएनबीसी रोगियों के सफल नैदानिक परिणाम को सीमित चुनौतियां हैं । इसलिए, टीएनबीसी की बहुरूपी आणविक पृष्ठभूमि को बेहतर ढंग से समझने और मेटास्टैटिक रोग को सीमित करने वाले प्रभावी चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है।
ट्यूमर मेटास्टेसिस एक मल्टीस्टेप प्रक्रिया है जहां ट्यूमर सेल अपने सूक्ष्म वातावरण को नियंत्रित करता है और प्राथमिक घाव से झिल्ली क्षरण और ट्यूमर सेल भागने के माध्यम से अपने स्वयं के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, में प्रवेश के माध्यम से (यानी, इंट्रावेशन) और से बाहर निकलें (यानी, विलोम) vasculature, और अंततः अनुकूलन और डिस्टल ऊतक बेड के भीतरउपनिवेशीकरण 2। स्तन कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल विकसित किए गए हैं, जहां दो पद्धतियों को आमतौर पर लागू किया जाता है: प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण। प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन के लिए आमतौर पर नियोजित तरीकों में पूंछ नस इंजेक्शन शामिल है, जबकि प्रत्यक्ष हृदय इंजेक्शन3,प्रत्यक्ष मस्तिष्क इंजेक्शन4और प्रत्यक्ष जिगर इंजेक्शन5 सहित अन्य दृष्टिकोणों को भी नियोजित किया गया है। प्रत्यक्ष रक्त परिसंचरण इंजेक्शन को अक्सर कृत्रिम मेटाटैसिस मॉडल के रूप में जाना जाता है, जो त्वरित और आसान लेकिन कम शारीरिक रूप से सटीक होता है क्योंकि यह प्राथमिक घाव और इंट्रावेशन6,7,7,8से ट्यूमर से बचने को दरकिनार करता है। जब प्रत्यक्ष इंजेक्शन मॉडल की तुलना में, ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल फेफड़ों जैसे दूरदराज के अंगों में पता लगाने योग्य मेटास्टैटिक घावों की घटना के लिए अधिक समय लेता है, लेकिन यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह मनुष्यों में होने वाली मल्टीस्टेप मेटास्टैटिक प्रक्रिया की बारीकी से नकल करता है। महत्वपूर्ण बात, एक २०१३ अध्ययन9 पूंछ नस इंजेक्शन और ऑर्थोटॉपिक मॉडल की तुलना में और पाया कि स्तन कैंसर की कोशिकाओं पूंछ नस में इंजेक्शन और फेफड़ों मेटास्टैटिक घावों से अलग उन पूंछ नस इंजेक्शन के बाद इसी तरह के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का प्रदर्शन किया । इसके विपरीत, ऑर्थोटोपरिक रूप से इंजेक्ट किए गए स्तन कैंसर कोशिकाओं की वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल ऑर्थोटोटोपरी इंजेक्शन कोशिकाओं9से उत्पन्न होने वाले फेफड़ों के मेटास्टैटिक घावों की तुलना में नाटकीय रूप से अलग थी। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि ऑर्थोटोपिक मॉडल अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि मेटास्टैटिक घाव मेटास्टेसिस की मल्टीस्टेप प्रक्रिया के समान चयन प्रक्रिया से गुजरते हैं जैसा कि मनुष्यों में होता है।
यह काम नग्न चूहों में एक ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर (एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी) मॉडल का वर्णन करता है जिसे इमेजिंग डिटेक्शन तकनीकों के लिए हमारी प्रयोगशाला में अनुकूलित किया गया था और साथ ही उपन्यास बायोमार्कर की पहचान और लक्षित कीमोथेरेपी एजेंटों के विकास का वर्णन किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bouins Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT10132-1L</td>
			<td>Lung metastatic nodule staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10503027</td>
			<td>DNA extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizer</td>
			<td>Virtis</td>
			<td>Cyclone Virtishear</td>
			<td>For tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS SPECTRUM scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence and BLI imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatriGel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Store at -20C and keep old (4 C) when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line</td>
			<td>GenTarget</td>
			<td>SC044</td>
			<td>Dual Reporter human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS</td>
			<td>histology image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer3</td>
			<td>MIT</td>
			<td></td>
			<td>Primer Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113803</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870127</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeniFAST SYBR Lo-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-94020</td>
			<td>Fast Real-Time PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Plus Real-Time PCR system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Real-Time PCR machine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model

ट्रिपल-निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर (टीएनबीसी) सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ एक आक्रामक स्तन कैंसर उपप्रकार है। जब कम आक्रामक स्तन ट्यूमर के साथ रोगियों की तुलना में, टीएनबीसी रोगियों के 5 साल के जीवित रहने की दर ७७% उनकी विशेषता दवा प्रतिरोधी फेनोटाइप और मेटास्टैटिक बोझ के कारण है । इस छोर की ओर, murine मॉडल TNBC ट्यूमर विकास और मेटास्टैटिक प्रसार सीमित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने के उद्देश्य से स्थापित किया गया है । यह काम टीएनबीसी ऑर्थोटोपिक मॉडल के लिए एक व्यावहारिक गाइड का वर्णन करता है जहां एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में निलंबित चौथे स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है, जो मनुष्यों में कैंसर सेल व्यवहार की बारीकी से नकल करता है। कैलिपर द्वारा ट्यूमर की माप, वीवो और पूर्व वीवो इमेजिंग के माध्यम से फेफड़ों के मेटास्टेसिस मूल्यांकन, और आणविक पता लगाने पर चर्चा की जाती है। यह मॉडल चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है और प्राथमिक ट्यूमर और डिस्टल मेटास्टैटिक साइटों के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।

कैलिपर द्वारा ट्यूमर की मात्रा माप उपचार प्रभावकारिता(चित्रा 1)का आकलन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, माइक्रोबायोम, सुविधा स्वच्छता, और इंजेक्शन साइट का उपयोग ट्यूमर विकास दर को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारक हैं।
जीएफपी इमेजिंग के विपरीत, BLI को BLI इमेजिंग से पहले कम से कम 15−20 min को कम से कम ल्यूसिफ़ेरेस सब्सट्रेट के प्रशासन की आवश्यकता थी। इसके अलावा, माउस तनाव, सेल लाइन, उपचार, और लूसिफ़ेरेरिपोर्टर सभी बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल स्तर को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, अध्ययन समूहों के बीच तुलनीय संकेतप्राप्त करने के लिए, सबसे अच्छा इमेजिंग समय सीमा(चित्रा 2)निर्धारित करने के लिए एक पूर्व इमेजिंग BLI गतिज अध्ययन किया जाना चाहिए।
बेहतर सिग्नल-टू-बैकग्राउंड रेशियो26,27के कारण वीवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में पूरा शरीर जीएफपी अप्रोच(चित्रा 3)की तुलना में निम्न स्तर के मेटास्टेसिस सिग्नल का पता लगाने में काफी संवेदनशील था । इसके अलावा, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल ने कुछ मिलीमीटर तक जीएफपी की तुलना में गहरी पैठ प्रदान की। हालांकि, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल उत्पादन के लिए एटीपी की आवश्यकता होती है, जो पूर्व वीवो ऊतक नमूनों के मूल्यांकन में एक सीमित कारक है। यदि जानवरों को जल्दी से संसाधित किया जाता है, तो BLI मेटाटैसिस पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण हो सकता है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने का एक तरीका एक समय में एक जानवर को संसाधित करना है। हालांकि, इस अध्ययन के लिए यह दृष्टिकोण व्यवहार्य नहीं था क्योंकि चूहों की एक बड़ी पलटन का उपयोग किया गया था। BLI संकेत का पता नहीं चला जब अंगों ४५ मिन पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन के आसपास चित्रित किया गया । इस स्थिति में ड्यूल रिपोर्टर सेल लाइन का इस्तेमाल उपयोगी होता है। GFP अणु की स्थिर प्रकृति के कारण, शोधकर्ताओं को लक्ष्य अंगों(चित्रा 4)से GFP संकेतों पर कब्जा करने से पहले शव को संसाधित करने के लिए पर्याप्त समय होगा ।
चित्रा 5 कैसे कैलिपर ट्यूमर आकार माप डेटा व्याख्या विकृत सकता है की एक वास्तविक जीवन उदाहरण प्रदान करता है, क्योंकि विद्वेष व्यवहार्य ट्यूमर सेल सामग्री के सबसे खो दिया है लेकिन अभी भी अपने बड़े द्रव्यमान और आकार बनाए रखा । उन विद्वेष की हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा ने द्रव्यमान के अंदर परिगलन का संकेत दिया(चित्रा 5बी)।
शोधकर्ताओं के लिए जो ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल में मस्तिष्क मेटास्टेसिस के बारे में इमेजिंग परिणामों को चुनौती देते हैं, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आणविक पता लगाने ठोस सबूत प्रदान कर सकते हैं(चित्रा 6)। इस मामले में, एक्सोजेनस जीएफपी डीएनए अनुक्रम इस समस्या को दूर करने का सबसे अच्छा तरीका था, क्योंकि ट्रांससंक्रमित जीएफपी डीएनए अनुक्रम स्वाभाविक रूप से मनुष्यों या कृंतक में मौजूद नहीं है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> चित्रा 1: ट्यूमर मात्रा माप। ट्यूमर की मात्रा/एक कैलिपर के साथ माप लोड करने के लिए 10 दिन पर शुरू विद्वेष प्रत्यारोपण के बाद और फिर 2x एक सप्ताह प्रयोग के अंत तक मापा गया था । त्रुटि सलाखों की गणना एसईएम मूल्य द्वारा की जाती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> चित्रा 2: इष्टतम छवि अधिग्रहण खिड़की का निर्धारण। बाएं: एक बड़े विद्वेष के साथ एक माउस और एक छोटे से विद्वेष के साथ एक माउस इष्टतम ल्यूसिफ़ेरिन गतिज रेंज निर्धारण के लिए चुना गया था। सही: लूसिफ़ेरिन गतिज वक्र 40 मिन के लिए हर 2 मिन छवियों को प्राप्त करके प्राप्त की। 15−22 मिन के बीच एक पठार मनाया गया था, जिसे बाद के सभी इमेजिंग के लिए इष्टतम छवि अधिग्रहण समय के रूप में इस्तेमाल किया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> चित्रा 3: पूरे शरीर BLI इमेजिंग । एल: पूरे शरीर BLI इमेजिंग । एम: एक काले दस्ताने की आस्तीन के साथ कवर निचले शरीर के साथ वेंट्रल दृश्य। आर: एक काले दस्ताने की आस्तीन के साथ कवर निचले शरीर के साथ पृष्ठीय दृश्य । ब्लिम इमेजिंग द्वारा वेंट्रल व्यू में एक एक्सिलरी लिम्फ नोड मेटास्तासिस का पता लगाया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> चित्रा 4: पूर्व वीवो BLI/GFP सिग्नल डिटेक्शन । माउस की बलि देने के बाद इसी माउस 20 मिन से दिमाग और फेफड़ों में जीएफपी सिग्नल का पता चला। BLI सिग्नल का पता नहीं चला 45 मिन पोस्ट लूसिफ़ेरिन इंजेक्शन। भोली माउस मस्तिष्क और फेफड़ों में कोई GFP संकेत का पता चला था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> चित्रा 5: कैलिपर माप पर ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के फायदे। (A)एक प्राथमिक ट्यूमर में वीवो जीएफपी सिग्नल डिटेक्शन में दिखाई देने वाले प्रतिनिधि छवि। केवल विद्वेष के एक छोटे से हिस्से ने जीएफपी सिग्नल दिखाया, जिसमें सुझाव दिया गया था कि द्रव्यमान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा स्ट्रोमा था। यह पारंपरिक कैलिपर माप द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है और एक गलत निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह उदाहरण पशु मॉडल अध्ययन के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग के महत्व पर प्रकाश डालता है। (ख)इसी माउस के हिस्टोपैथोलॉजी सेक्शन में दिखाया गया है कि परिगलित क्षेत्र (यानी, आंतरिक क्षेत्र) ने भी ट्यूमर आकार गणना में योगदान दिया। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> चित्रा 6: पिघलने वक्र विश्लेषण । पिघल वक्र भूखंड GFP एम्प्लिक्स की विशिष्टता दिखा रहा है। एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी प्रत्यारोपित चूहों से प्राप्त मस्तिष्क से डीएनए और संस्कृति में उगाए गए एमडीए-एमबी-231-ल्यूक/जीएफपी कोशिकाओं से अलग डीएनए को परख दिया गया । मस्तिष्क के ऊतकों में जीएफपी सामग्री का आकलन करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर परख का प्रदर्शन किया गया था। (ए, बी) सकारात्मक नियंत्रण के पिघलने घटता है और डीएनए माउस मस्तिष्क से निकाला, क्रमशः । (ग)पैनलों ए और बी के छा-लक घटता, माउस मस्तिष्क DNAs से चोटी संकेतों का संकेत एक्सोजेनेस जीएफपी अनुक्रम के लिए विशिष्ट हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

यह काम हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और बायोल्यूमिनेसेंस संकेतों के साथ-साथ मात्रात्मक आणविक पहचान तकनीक के एकीकरण का पता लगाकर ट्यूमर लोडिंग का सही आकलन करने के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल को पूर्वनिर्धारित करता है।

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