Name: studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd från Intramural Research Program vid National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program, och Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos biomedicinsk forskning, Inc, Frederick Maryland, USA.

Analys av tumörtillväxt genomfördes med hjälp av protokoll som godkänts av kommittén för etik djurförsök av National Cancer Institute och följde rekommendationerna i Usa National Research Council's "Guide for the Care and Use of the National Cancer Institute Laboratoriedjur", Förenta staternas folkhälsomyndighetens "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", och "Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals".
1. Beredning av celler för implantation
OBS: MDA-MB-231 mänskliga bröst adenokarcinom celler (kommersiellt förvärvade) var stabilt transfekterade med luciferas genen III och förbättrad grön fluorescerande protein (GFP) markör av lentivirus och odlas i närvaro av urvalet antibiotika (puromycin) .
<ol><li>Starta cellodlingen med 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP-celler och tillsätt 15 ml förkrigsmärkt (37 °C) RPMI 1640 medium med 10% fetala bovin serum (FBS) i en T75 kulturkolv. Håll cellerna växer i en temperaturkontrollerad cellodlingskuvös vid 37 °C med 5 % CO2. Byt ut hela mediet minst 2x i veckan. OBS: Stör inte celltillväxten och kontrollera cellens odlingsförhållanden dagligen. Cellerna måste subkultureras när de når 85%−90% sammanflödet för att upprätthålla spridningsfasen.</li>
	<li>En vecka före cellimplantationssteget, ta bort puromycin från cellodlingkolven genom att först ta bort allt medium i odlingskolven, sedan skölja 2x med 10 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och slutligen ersätta mediet med komplett medium med komplett medium utan puromycin. Under de mellanliggande och sköljande stegen ska du inte störa cellerna. Kom ihåg att inte använda hela mediet med valet antibiotika från och med nu för alla medelstora påfyllning steg.</li>
	<li>På dagen för att förbereda cellerna för implantation, ta bort allt komplett medium innan trypsinization för att undvika att inaktivera trypsin. Tillsätt 5 ml trypsin i kolven för att provapsinisera cellerna. Övervaka cellerna och kontrollera att de lossnar från kulturkolven.</li>
	<li>När majoriteten av cellerna lossnar, tillsätt 10 ml komplett medium för att neutralisera trypsinaktiviteten. Överför sedan cellupphängningen till ett 50 ml centrifugrör och centrifug på ~150 x g till pelletcellerna. Ta bort supernatanten efter centrifugeringen och tillsätt sedan 10 ml 1x PBS för att återsuspendera cellerna och förbereda för cellräkning.</li>
	<li>Räkna cellerna med en cellräknare och justera cellkoncentrationen till 20 x 106 celler/ml i kall 1x PBS som innehåller 25% källarmembranmatris. Injicera 2 x 106 celler i 0,1 mL 1x PBS med 25% källare membran matris i den fjärde bröst fett pad av varje mus. Ta med extra nålar och sprutor för cellimplantationen och håll cell-källaren-membrane-matrisblandningen på is före implantation. OBS: Det finns dött utrymme i sprutan och nålen. Beroende på valet av nål och spruta längd, typ och storlek, en tuberkulin spruta med en 0,5 i 26 G nål kan ha upp till 70 μL död utrymme10. Förbered 40%−50% mer cellimplantationsblandning för att kompensera för det döda utrymmet och eventuella andra oavsiktliga förluster.</li>
</ol>2. Orthotopic bröstcancer modell och tumör storlek mätning
<ol><li>Låt 6 veckor gamla kvinnliga athymiska nakenmöss acklimatisera sig till anläggningen i minst 1 vecka före cellimplantationen. OBS: Med hjälp av samma ålder möss kommer att minska datavariation.</li>
	<li>För varje runda söva fem möss med isofluran vid 4% med filtrerad (0,2 μm) luft med en flödeshastighet på 1 L/min i 3−4 min. Var uppmärksam på musens andningsfrekvens och mönsterförändring och använd en tå nypa för att säkerställa att mössen är under rätt anestesi. När de inte längre rör sig, ta bort en mus och placera en näsa kon över näsan och munnen med samma anestesi.</li>
	<li>Svabb den vänstra4: e bröstkörteln med alkohol. Lyft den4:e bröstkörteln något med hjälp av fina råtttandlycenser för att sätta in 25 G-nålen. Se till att nålen avfasning upp och sedan något dra kolven för att se till att nålen inte träffar några blodkärl. Om inget blod kommer in i sprutan, fortsätt att långsamt injicera 100 μL av cell-källaren-membran-matrisblandningen i bröstfettpadet. OBS: Ett runt, upphöjt område visas under huden.</li>
	<li>Vänta 10−15 s tills källarmembranmatrisen härdas och ta sedan bort nålen. Upprepa processen med de återstående mössen i induktionskammaren. Placera alla använda nålar och sprutor i en skarp låda.</li>
	<li>Använd samma bröstkörtel injektionsstället för alla möss. Håll ett vakande öga på injektionsstället och notera att eventuell cellimplantationsblandning läcker ut från injektionsstället. OBS: Inom några minuter börjar musen att återfå medvetandet.</li>
	<li>Låt xenograften växa fritt utan avbrott i 7−10 dagar före mätning av tumörstorlek.</li>
	<li>Undersök alla möss för xenograftstorleken. Mät tumörstorleken med ett ok. Bestäm tumörvolymen (mm3) med följande ekvation: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg"> där L är den längsta dimensionen och W är den kortaste dimensionen vinkelrätt mot L.</li>
	<li>Identifiera och ta bort extremvärden som överskrider en standardavvikelse för medelvärdet. Använd endast möss med jämförbara tumörstorlekar för experiment. Slumpmässigt dela mössen i olika behandlingsgrupper och börja behandlingar.</li>
	<li>Mät tumörstorleken med ok 2x i veckan. Observera alla fysiska förändringar av xenografts (dvs. nekros, laceration).</li>
</ol>3. In vivo bioluminescens och ex vivo fluorescens bildframställning
OBS: I denna studie utförs både tvådimensionell bioluminescens och fluorescensavbildning vid experimentets slutpunkt. Bioluminescens imaging (BLI) utfördes med hjälp av en kommersiell preklinisk optisk scanner utrustad med en 16-bitars kyld CCD kamera och uppvärmd bildbehandling skede.
<ol><li>Före avbildning söva upp till fem tumörbärande möss i induktionskammaren genom att ställa in isofluran vid 3% med filtrerad (0,2 μm) luft med en flödeshastighet på 1 L/min i 3−4 min. Bestäm anestesi med en tå nypa. Se till att induktionskammaren hålls inne i en ventilerad huva för att minimera personalens exponering för isofluran.</li>
	<li>Administrera D-luciferin (150 mg/kg) till de sövda mössen med en intraperitoneal väg med en 27 G-nål och överför en sövd mus till bildbehandlingskammaren. Vid skanneravbildningskammaren, håll isofluranen på 2%−2,5% med O2 som bärare med en flödeshastighet på 1 L/min. OBS: Håll musens kroppstemperatur vid ~37 °C under proceduren genom att hålla en uppvärmd dyna under anestesinduktionskammaren, bildbord (om scenen inte värms upp) och återhämtningsburen efter förfarandet.</li>
	<li>Innan avbildning av studien möss, få luciferin kinetik genom att avbilda tre extra tumörbärande möss (djur som inte tilldelats någon studiegrupper) med 2 min intervall för totalt 40 min med hjälp av följande parametrar: excitering filter-blockerad, utsläpp filter-öppen, f/stop 1, FOV-D, medium binning (8 x 8), och automatisk exponering. Använd den högsta bioluminescenssignalen som mäts för att definiera det optimala tidsfönstret för bildförvärv för alla efterföljande tidpunkter.</li>
	<li>När du utför metastasering imaging, skydda den höga BLI signalen från den primära tumören genom att täcka den med en hylsa utskuren från en svart handske. Skaffa bilden med samma parametrar som beskrivs i steg 3.3 med den ventrala sidan av musen vänd mot kameran för lungmetastasering imaging och den dorsala sidan av musen mot kameran för hjärnan metastasering imaging. OBS: Det är viktigt att testa några olika märken av svarta handskar för att välja en med minimal auto luminescens.</li>
	<li>Med hjälp av en scanner och dataanalys programvara, rita en standard form region av intresse (ROI) över brösthålan eller hjärnan se till att hela organ av intresse omfattas för att utvärdera metastaserande börda. Kvantifiera produktionen av bioluminescens (BL) som totalflöde (fotoner/sekund).</li>
	<li>Omedelbart efter BLI, avliva musen via CO2 kvävning (enligt ACUC riktlinjer och institution godkända djur protokoll) och extrahera lungan och hjärnan med dissekera sax och pincett för ex vivo imaging. OBS: Lungan extraheras för ex vivo imaging och lung metastasering nodule räkna kan inte utföras på samma mus på grund av oförenliga förfaranden.</li>
	<li>Skölj snabbt alla organ med 1x PBS för att ta bort eventuella ytliga blodfläckar och placera organ på en låg autofluorescens, svart plastplatta. Transportera organ till en multispektrala fluorescensskanner utrustad med spektralbllandande förmåga (fast tillståndssplint våglängdsjustering) med en 12-bitars CCD-kamera för GFP-detektering.</li>
	<li>Förvärva multispektrala GFP-bilder (excitationsfilter = 457 ± 23 nm; emissionsfilter = 490 nm långt pass) av de extraherade organen och icke-tumörbärande kontrollmöss genom att skanna genom 500−720 nm vid en stegstorlek på 10 nm. Använd strukna organ från icke-tumörbärande kontroll möss att korrigera för autofluorescens.</li>
	<li>Efter multispektrala GFP-avbildning, bestämma de optimala bildinställningarna. Utför bildinsamling av alla målorgan och genomföra bildanalys (t.ex. generera ett spektralbibliotek för autofluorescens och GFP för spektralbllandande förfarande) enligt tillverkarens protokoll.</li>
</ol>4. Molekylär detektion av metastaserande bröstcancerceller
<ol><li>Efter ex vivo-avbildningen, snap frysa hela hjärnan i flytande kväve och förvara på -80 °C i en frys tills redo för DNA-extraktion.</li>
	<li>För DNA-extraktion, lägg hela hjärnan i ett 5 ml homogeniserande rör med 2 ml DNA-lysbuffert. Använd en homogenisator med effektinställningen vid 50 för att homogenisera den snapfrysta hela hjärnvävnaden. När hjärnvävnaden är helt homogeniserad, överföra 1 ml suspension (lysate) till en DNase-fri och RNase-fri 2 ml mikrocentrifug röret och fortsätta att isolera DNA enligt tillverkarens protokoll. OBS: För att minimera DNA-kontamination genom överföring, rengör homogenisatorn noggrant efter varje prov genom att först skölja den med 75 % etanol i DNase-fritt och RNasfritt vatten, skölj sedan med 1 M NaOH-lösning, följt av en sköljning med 75% etanol i DNase-fritt och RNase-fritt vatten för att effektivt minska och förstöra dna-rester.</li>
	<li>Tillsätt 0,5 ml 100% etanol av DNA-lysbuffert till lysate. Blanda provet genom inversion och förvara i rumstemperatur i 3 min. OBS: Invertera inte för många gånger eller för kraftigt. DNA kommer att synas som en ullliknande fällning.</li>
	<li>Använd en pipettspets för att överföra DNA till ett färskt DNase-fritt och RNase-fritt 2 ml mikrocentrifugrör. Låt provluften torka i 1 min. Tillsätt 1 ml 75 % etanol och vänd in mikrocentrifugröret 3−6x för att tvätta DNA-provet. Kassera etanolen efter varje tvätt genom pipettering. Upprepa tvättsteget 2x.</li>
	<li>Lufttorka DNA-provet i 10 s. Tillsätt sedan 52 μL 8 mM NaOH för att lösa upp DNA-provet. Pipet 2 μL av DNA-provet för DNA-kvantation och använd de återstående 50 μL för en PCR-analys i realtid efter koncentrationsjustering. OBS: NaOH hjälper till att helt löslusifiera DNA-provet.</li>
	<li>Mängd 2 μL av varje DNA-prov med spektrofotometer och använd ett absorbansförhållande mellan A260/280 som referens för kvalitetskontrollen. Beräkna DNA-koncentrationen med denna formel: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg">
</li>
	<li>Justera DNA-koncentrationen till 50 ng/μL. För varje DNA-prov, använd 50 ng DNA som startmall för en PCR-analys i realtid. Använd 8 mM NaOH-lösning eller DNase-fritt och RNase-fritt vatten för att späda ut DNA-provet.</li>
	<li>Design primer par som är specifika för exogena gröna fluorescens protein (GFP) sekvens internt med hjälp av en öppen källkod primer design webbportal för realtid PCR upptäckt av GFP-taggen i ögonbevarande celler som invaderade och koloniserade distala platser. OBS: Denna studie används F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'.</li>
	<li>Använd ett snabbt PCR-reagens i realtid och en PCR-dator i realtid som stöder ett snabbt PCR-protokoll i realtid. Förutom de vanliga 30-cykelförstärkningsstegen lägger du till ett avvikelsekurvasteg i slutet av körningen för att upptäcka en ospecifik förstärkning. OBS: Följande villkor användes för molekylär detektering: 95 °C 2 min varmstart, 40 cykler av 95 °C 5 s, 60 °C 15 s och slutligen en analys av smältkurvan. GFP-ampliconen är 135 bp i storlek.</li>
	<li>Använd en naiv mus hjärnan DNA (inte en MDA-MB-231 cellimplantat) som en negativ kontroll. Använd DNA som extraherats från MDA-MB-231-GFP/Luc-cellerna som en positiv kontroll. Lägg till alla PCR-reagenser utan DNA-mall som en no template control (NTC). EN PCR-styrning behövs för varje PCR-analys.</li>
</ol>5. Metastaserande bröstcancer cell upptäckt i lungan
<ol><li>För den undergrupp av möss som valts för den ögonbevarande lungnogäkbulräkningen bedövar möss med isofluran (som i steg 2.2) omedelbart efter ex vivo-avbildningen en hjärtpunktering för blodinsamling och avliva sedan genom cervikal störning.</li>
	<li>Öppna brösthålan med dissekerande sax och skär förbi hjärtat och brässen för att exponera luftstrupen.</li>
	<li>För in en 10 ml-spruta med en 22 G nål som innehåller Bouins lösning i luftstrupen. Tryck på sprutkolven tills de kollapsade lungorna är svullna med ~2 ml av Bouins lösning. Ta bort sprutan och nålen när lungorna har blåsts upp.</li>
	<li>Placera hela lungan i ett 15 ml-rör som innehåller Bouins lösning, vänd försiktigt in röret några gånger och låt dra i 24 timmar vid rumstemperatur.</li>
	<li>Efter 24 timmar, ta bort Bouins lösning från röret, skölj lungan med vatten och placera den sedan tillbaka i röret med 70% etanol. Räkna metastasering (vita fläckar eller knölar) på lungornas ytor med hjälp av ett dissekerande mikroskop.</li>
</ol>6. Insamling och analys av uppgifter
<ol><li>Registrera tumörvolymdata, samt in vivo- och ex vivo-bilddata, på ett elektroniskt kalkylblad för enkel datainmatning, insamling och hantering.</li>
	<li>I slutet av experimentet, överföra alla data till den elektroniska kalkylblad och statistisk programvara för data plottning och statistiska analyser.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+of+triple-negative+breast+cancer:+implications+for+therapy.">Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy.</a> Cancer. 121, 8-16 (2015).</li><li>Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+and+Microenvironment+Plasticity:+Double-Edged+Swords+in+Metastasis.">Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).</li><li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+bone+metastasis.">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).</li><li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model.">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).</li><li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer.">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).</li><li>Lim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tumor+metastases+and+osteolytic+lesions+with+bioluminescence+and+micro+CT+imaging.">Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).</li><li>Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-modal+imaging+of+angiogenesis+in+a+nude+rat+model+of+breast+cancer+bone+metastasis+using+magnetic+resonance+imaging,+volumetric+computed+tomography+and+ultrasound.">Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).</li><li>Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+a+Murine+Orthotopic+Metastatic+Breast+Cancer+Model+and+Performing+Murine+Radical+Mastectomy.">Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).</li><li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model?.">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model?.</a> Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).</li><li>Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inadvertent+overdosing+of+neonates+as+a+result+of+the+dead+space+of+the+syringe+hub+and+needle.">Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).</li><li>Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+Injection+of+Breast+Cancer+Cells+into+the+Mice+Mammary+Fat+Pad.">Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).</li><li>Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+less+invasive+method+for+orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mouse+mammary+gland.">A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland.</a> Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).</li><li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Orthotopic+Mouse+Model+of+Spontaneous+Breast+Cancer+Metastasis.">An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).</li><li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth.">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).</li><li>Fletcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+adipose+tissue:+characterization+of+factors+that+change+during+tumor+progression+in+human+breast+cancer.">Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).</li><li>Giuliano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axillary+dissection+vs+no+axillary+dissection+in+women+with+invasive+breast+cancer+and+sentinel+node+metastasis:+a+randomized+clinical+trial.">Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).</li><li>Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+location+within+the+breast:+Does+tumour+site+have+prognostic+ability?.">Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability?.</a> Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).</li><li>Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+tumor+location+on+breast+cancer+prognosis.">Influence of tumor location on breast cancer prognosis.</a> International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).</li><li>Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+laterality+and+primary+tumor+site+on+cancer-specific+mortality+in+breast+cancer:+a+SEER+population-based+study.">The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study.</a> PLoS One. 9, e94815 (2014).</li><li>Faustino-Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+rat+mammary+tumor+volume+using+caliper+and+ultrasonography+measurements.">Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements.</a> Lab Animal. 42, 217-224 (2013).</li><li>Mullen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Matrigel+to+facilitate+the+establishment+of+human+cancer+cell+lines+as+xenografts.">The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).</li><li>Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+augments+xenograft+transplantation+of+meningioma+cells+into+athymic+mice.">Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice.</a> Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).</li><li>Mullen, P., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+matrigel+in+the+establishment+of+ovarian+carcinoma+cell+lines+as+xenografts.">The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).</li><li>Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+matrigel+has+no+influence+on+tumor+development+or+PET+imaging+in+FaDu+human+head+and+neck+cancer+xenografts.">The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts.</a> BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).</li><li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines.">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).</li><li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models.">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

För studien av TNBC hos djur har två murinemodeller utvecklats: MDA-MB-231 humana bröstadenokarcinomceller hos immunkomprometterade möss (dvs. athymiska nakna möss, NSG-möss) och 4T1 hos immun-kompetenta BALB/c-möss. Båda modellerna har sina fördelar. Valet av djurmodell för en studie beror på forskningsmålen. Till exempel är MDA-MB-231-modellen en mänsklig TNBC-cellinje som odlas i immunkomprometterade möss som efterliknar immunsupprimerade patienter med bröstcancer. Å andra sidan, den invasiva fenotyp av orthotopic 4T1 trippel-negativa murine bröstcancerceller i BALB/c möss härmar nära ögonbevarande processen som det sker i steg IV mänskliga bröstcancerpatienter. Till skillnad från den intravenösa cell injektion strategi, mänskliga MDA-MB-231 bröstcancerceller var på samma sätt injiceras i bröst fett pad11,12 i ortoptoppic bröstcancer modell11,13. Ju längre tumörtillväxt och förvärvad ögonbevarande förmåga är mer fysiologiskt relevant, så det är inte en konstgjord metastaserande cancer modell4,14. En sådan spontan metastasering modell härmar nära mänskliga bröstcancer utveckling med undantag för initieringsstadiet. Detta är en avgörande modell för in vivo läkemedelsscreening och terapeutisk effektbedömning vid metastaserande bröstcancer.
Tumör implantation webbplats i musen spelar en avgörande roll för att ge en mikromiljö som upprätthåller tumörtillväxt och val av ögonbevarande fenotyp liknar den som förekommer hos människor. Den proximala lymfkörteln och förekomsten av fettvävnad är de viktigaste faktorerna som påverkar sjukdomsprogressionen av bröstcancer15,16. Hos en mänsklig patient, lymfkörteln och fettvävnad är båda viktiga interagerande faktorer som påverkar malignitet och incidensen av bröstcancer17,18,19. Således kan valet av rätt anatomisk plats för injektionsstället starkt påverka tumörmodellens relevans jämfört med den mänskliga sjukdomen. Denna studie använde den fjärde bröstkörteln som implantationsstället främst på grund av ovannämnda krav och att det är anatomiskt mer tillgängligt och lättare att manipulera.
Olika tumörvolymberäkningsmetoder finns tillgängliga, och en forskare kan välja vad de vill. Algoritmen som valts ut för denna studie är baserad på resultaten av Faustino-Rocha et al., som jämförde olika tumör volym beräkning formler och drog slutsatsen att formeln nedan är den mest exakta20.
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
Källarmembran matris är en viktig extracellulär matris som används i olika in vitro21 och in vivo22,,23 analyser. Det finns motstridiga rapporter22,24,25 om påverkan av källaren membran matris på xenograft malignitet. Det verkar bara påverka den ursprungliga etableringen av xenograft och har ingen ytterligare effekt på xenograft tillväxt25. För xenograft implantation beskrivs, källaren membran matris blandades med cancerceller för att öka cellen / gel blandning lösning viskositet före implantation. Närvaron av källarmembranmatrisen minskar förlusten av blandningslösning från injektionsstället och håller blandningslösningen vid implantationsstället, vilket ökar enhetligheten hos den implanterade xenograftvolymen.
MDA-MB-231 cellinjen är en malign förevigade mänskliga bröst adenokarcinom cellinje och är ett populärt verktyg i bröstcancer forskning på grund av dess trippel-negativ status. Användningen av dubbla reportrar (luciferas och GFP) cellinje ger större flexibilitet i hanteringen av in vivo och ex vivo imaging. Det är väl etablerat att bioluminescenssignalen har större känslighet, djup detekterbarhet och överlägsen kontrast (signal-brus-förhållande) än GFP-signaler. På grund av detta är det en allmänt använd bildbehandling modalitet för hela kroppen imaging. Tyvärr begränsas bioluminescensdetektering av ett smalt tidsfönster (~15−20 minuter efter luciferininjektion) under vilken signaldetekteringen är linjär. BLI-signalen minskar snabbt när djuren avlivas. Detta blir en experimentell design fråga om många möss behöver avlivas och skörd flera vävnader eller organ krävs. I dessa studier skördades blod av direkt hjärtpunktering, hjärnan, primära tumör, lunga och drabbade lymfkörteln undersöktes i 40 möss. När organen skördades och redo för ex vivo imaging, bioluminescens signalen var omöjlig att upptäcka. Därför är GFP-detektion mer lämplig i dessa situationer. Utsläppet av GFP-signalen är i det synliga området, och vid dessa våglängder är signalabsorptionen på grund av blod (dvs. hemoglobin) betydligt högre. Autofluorescens i det synliga intervallet på grund av NADH, lipopigment och flavins resulterar också i en betydande bakgrund som gör det svårt att skilja mellan en låg nivå GFP-signal och autofluorescens bakgrund. Använda en multispektrala fluorescens bildbehandling strategi i stället för traditionella filter-par imaging och använda spektrala oblandande algoritmer hjälper till att identifiera sann GFP-signal i organ av intresse. Genom att kombinera styrkan hos bioluminescensavbildning i helkroppsin vivo-detektering och multispektrala GFP-avbildning i ex vivo-utvärderingarna av organ/vävnad kan kvantifierbara data maximeras i en stor kohort av möss.
Oavsett vilket tillvägagångssätt som väljs ut för en djurstudie rekommenderas starkt att extrahera allt blod före hämtning av organ/vävnader, särskilt för studier som är inriktade på den metastaserande bördan. Detta protokoll detekterar GFP-signaler från hela blodprover som erhållits från möss (data som inte visas) i den ortoptopiska bröstcancermodellen genom PCR-analyser i realtid. Minimera blodvolymen i organ/vävnader kommer att minska den falska positiva signalen i målorganen.
Sammanfattningsvis är den ortotopiska bröstcancermodellen med MDA-MB-231-Luc/GFP-cellerna en mycket relevant djurmodell som nära efterliknar det mänskliga TNBC-patientens tillstånd. Denna modell är nödvändig för att studera, övervaka och bedöma terapeutisk effekt i en tumör mikromiljö som liknar människor. Användningen av dubbla reporter cellinjer ytterligare förbättrar det praktiska i denna ortoptopediska bröstcancer modell.

Ungefär en av åtta kvinnor i USA kommer att utveckla invasiv bröstcancer under sin livstid, och 10%−20% av dessa kvinnor kommer att diagnostiseras med den aggressiva trippelnegativ bröstcancer (TNBC) subtyp. Medan primära skador kan avlägsnas kirurgiskt i de flesta fall, den subkliniska mikrometerastaser och chemoresistance gör det till en svårbehandlad sjukdom. Viktigt, de flesta patienter med ögonbevarande TNBC så småningom återfall, även om de genomgick behandling i ett tidigt skede1. Således, cancer heterogenitet, mikrometastaser, och terapeutisk resistens är tre stora utmaningar som begränsar det framgångsrika kliniska resultatet av TNBC patienter. Därför finns det ett akut behov av att bättre förstå den polymorfa molekylära bakgrunden av TNBC och utveckla effektiva terapeutiska medel som begränsar ögonbevarande sjukdom.
Tumör metastasering är en multistep process där tumörcellen styr och tillskansar sig sin mikromiljö för att främja sin egen spridning via membran nedbrytning och tumör cell fly från den primära lesion, via inträde i (dvs intravasation) och utträde från (dvs extravasation) vaskulaturen, och slutligen anpassning och kolonisering inom distala vävnadssängar2. Djurmodeller har utvecklats för att studera metastasering av bröstcancer, där två metoder vanligen implementeras: direkt blodcirkulationsinjektion och orthotopic implantation. Vanligen används metoder för direkt blodcirkulation injektion inkluderar svans ven injektion, medan andra metoder inklusive direkt hjärt injektion3, direkt hjärninjektion4, och direkt lever injektion5 har också använts. Den direkta blodcirkulationen injektion kallas ofta en konstgjord metastasering modell, vilket är snabbt och enkelt men mindre fysiologiskt korrekt eftersom det kringgår tumör fly från den primära lesion och intravasation6,7,8. Jämfört med direktinsprutningsmodeller tar den ortotoppic bröstcancermodellen längre tid för förekomsten av påvisbara ögonbevarande lesioner i avlägsna organ som lungan, men det är mer fysiologiskt relevant eftersom den nära efterliknar multistep ögonbevarande process som det förekommer hos människor. Viktigt, en 2013 studie9 jämfört svansen ven injektion och ortopic modeller och fann att bröstcancerceller injiceras i svansen venen och de isolerade från lung ögonbevarande skador efter svans ven injektion uppvisade liknande globala gen uttryck profiler. Däremot var den globala genuttrycksprofilen för ortotopiskt injicerade bröstcancerceller dramatiskt annorlunda än för metastaserande lesioner i lunganfalligenhet som härrörde från ortopotopiskt injicerade celler9. Dessa observationer tyder på att den ortotopiska modellen är mer fysiologiskt relevant, eftersom ögonbevarande skador genomgår en urvalsprocess som liknar multistep processen för metastasering som det förekommer hos människor.
Detta arbete beskriver en orthotopic bröstcancer (MDA-MB-231-Luc/GFP) modell i nakna möss som optimerades i vårt laboratorium för bildframställning detektionstekniker samt identifiering av nya biomarkörer och utveckling av riktade kemoterapeutiska medel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bouins Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT10132-1L</td>
			<td>Lung metastatic nodule staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10503027</td>
			<td>DNA extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizer</td>
			<td>Virtis</td>
			<td>Cyclone Virtishear</td>
			<td>For tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS SPECTRUM scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence and BLI imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatriGel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Store at -20C and keep old (4 C) when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line</td>
			<td>GenTarget</td>
			<td>SC044</td>
			<td>Dual Reporter human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS</td>
			<td>histology image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer3</td>
			<td>MIT</td>
			<td></td>
			<td>Primer Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113803</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870127</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeniFAST SYBR Lo-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-94020</td>
			<td>Fast Real-Time PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Plus Real-Time PCR system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Real-Time PCR machine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model

Triple-negativ bröstcancer (TNBC) är en aggressiv bröstcancer subtyp med begränsade terapeutiska alternativ. Jämfört med patienter med mindre aggressiva brösttumörer är 5-års överlevnaden för TNBC-patienter 77% på grund av deras karakteristiska läkemedelsresistenta fenotyp och ögonbevarande börda. Mot detta ändamål, murine modeller har upprättats som syftar till att identifiera nya terapeutiska strategier som begränsar TNBC tumör tillväxt och ögonbevarande spridning. Detta arbete beskriver en praktisk guide för TNBC orthotopic modell där MDA-MB-231 bröstcancerceller svävande i en källare membran matris implanteras i den fjärde bröst fett pad, som nära härmar cancer cell beteende hos människor. Mätning av tumörer av bromsok, lung metastasering bedömning via in vivo och ex vivo imaging och molekylära upptäckt diskuteras. Denna modell ger en utmärkt plattform för att studera terapeutisk effekt och är särskilt lämplig för studier av samspelet mellan den primära tumören och distala metastaserande platser.

Tumörvolymmätning med ok är en väletablerad metod för att bedöma behandlingseffekten (figur 1). Antalet celler implanteras, användning av källaren membran matris, mikrobiomet, anläggning renlighet, och injektionsstället är de viktigaste faktorerna som påverkar tumörtillväxt.
Till skillnad från GFP-avbildningen krävde BLI administrering av luciferassubstratet minst 15−20 min före BLI-avbildning. Dessutom påverkar musstammen, cellinjen, behandlingar och luciferasreporter alla bioluminescenssignalnivåerna. För att få jämförbara signaler mellan studiegrupperna måste därför en bli-kinetisk studie före avbildning genomföras för att fastställa den bästa bildtidsramen (figur 2).
På grund av det överlägsna signal-till--bakgrund-förhållandet26,27, var hela kroppen in vivo bioluminescensavbildning ganska känslig för att upptäcka låg nivå metastasering signal jämfört med GFP-metoden ( Figur3). Dessutom gav bioluminescenssignalen djupare penetration än GFP med några millimeter. Bioluminescenssignalproduktion kräver dock ATP, vilket är en begränsande faktor vid utvärdering av ex vivo-vävnadsprover. Om djuren bearbetas snabbt, då BLI kan vara en livskraftig metod för att få kvantitativa resultat på metastasering. Ett sätt att uppnå detta är genom att bearbeta ett djur i taget. Detta tillvägagångssätt var dock inte möjligt för denna studie eftersom en stor kohort av möss användes. BLI signal upptäcktes inte när organen avbildades runt 45 min post luciferin injektion. Användningen av en dubbel reporter cellinje är användbar i denna situation. På grund av GFP-molekylens stabila karaktär skulle forskarna ha tillräckligt med tid för att bearbeta slaktkroppen innan de fångar in GFP-signalerna från målorgan (figur 4).
Figur 5 ger ett verkligt exempel på hur mätningar av kalibertumörstorlek kan förvränga datatolkningen, eftersom xenograften förlorade det mesta av det livskraftiga tumörcellinnehållet men ändå behöll sin stora massa och form. Histopatologiska undersökning av dessa xenografts anges nekros inuti massan (Figur 5B).
För forskare som utmanar bildframställningsresultaten avseende hjärnmetastasering i den ortotopiska bröstcancermodellen kan molekylär detektion genom PCR i realtid ge övertygande bevis (figur 6). I detta fall var den exogena GFP DNA-sekvensen det bästa sättet att lösa detta problem, eftersom den transfected GFP DNA-sekvensen inte naturligt finns hos människor eller gnagare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> Figur 1: Mätning av tumörvolym. Tumör volym/lastning mätning med ett ok började dag 10 efter xenograft implantation och sedan mättes 2x i veckan fram till slutet av experimentet. Felstaplar beräknas med SEM-värde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> Figur 2: Bestämning av optimalt bildinsamlingsfönster. Lämnat: En mus med en stor xenograft och en mus med en liten xenograft var utvalda för den optimala luciferinkinetic spänner beslutsamhet. Höger: Luciferin kinetisk kurva erhålls genom att förvärva bilderna var 2 min i 40 min. En platå observerades mellan 15−22 min, som användes som en optimal bild förvärvstid för alla efterföljande bildbehandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> Figur 3: Helkropps- BLI-avbildning. L: Hela kroppen BLI imaging. M: Ventral vy med underkroppen täckt med en hylsa av en svart handske. R: Dorsal vy med underkroppen täckt med en hylsa av en svart handske. En axillary lymfkörteln metastasering upptäcks i ventrala vyn av BLI imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> Figur 4: Ex vivo BLI/GFP-signaldetektering. GFP signaler upptäcktes i hjärnan och lungan från samma mus 20 min efter musen offrades. BLI signal upptäcktes inte 45 min post luciferin injektion. Ingen GFP signal upptäcktes i naiva mus hjärnan och lungan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> Figur 5: Fördelar med optisk bildteknik jämfört med bromsmått. (A) Representativ bild som visar in vivo GFP signaldetektering i en primär tumör. Endast en mindre del av xenograft visade GFP signal, vilket tyder på att en betydande del av massan var stroma. Detta kan inte bestämmas av traditionella bromsmått och kan leda till en felaktig slutsats. I det här exemplet framhålls vikten av optisk avbildning för djurmodellstudien. (B) Histopathology delen av samma mus som visar att den nekrotiska regionen (dvs. inre regionen) också bidragit till tumörstorlek beräkningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> Figur 6: Analys av smältkurvan. Smältkurvområdet som visar GFP-amplicons specificitet. DNA från hjärnan som erhållits från MDA-MB-231-Luc/GFP-implanterade möss och DNA isolerade från MDA-MB-231-Luc/GFP celler odlas i kultur (positiv kontroll) analyserades. Pcr-analysen i realtid utfördes för att bedöma GFP-halten i hjärnvävnaden. (A,B) Smältkurvorna för den positiva kontrollen och DNA som extraherats från mushjärnan respektive. (C)De överlappande kurvorna på panelerna A och B, som anger toppsignalerna från rårna för mushjärnan, är specifika för den exogena GFP-sekvensen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video at JoVE.com

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

Detta arbete förinställda ett avancerat protokoll för att noggrant bedöma tumör lastning genom detektion av gröna fluorescerande protein och bioluminescens signaler samt integration av kvantitativa molekylära detektionsteknik.

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Vårt protokoll övervinner den begränsade bioluminescens imaging fönster genom att inkludera en GFP tagg som också underlättar detektion och kvantifiering av micrometastasis genom PCR-analys. Eftersom GFP-taggen kringgår det begränsade fönstret för bioluminescence-förvärv kan fler motiv avbildas utan signalförlusten och potentialen för falska negativa resultat är begränsad. Denna studie kommer att vara användbar för forskare för utvärdering av terapeutisk effekt av anti-cancer agenter.Denna metodik ger en användbar modell för forskare som är intresserade av EMT, läkemedelsresistens, och cancer stamceller mekanismer relaterade till den metastaserande processen samt för anti-cancer läkemedelsutveckling. Efter att ha bekräftat en brist på svar på pedal reflex, svabb vänster fjärde bröstkörtel med alkohol och använda fina rat-tooth-forceps för att lyfta den fjärde bröstkörteln något. Se till att spetsen är avfasning upp, sätt in en 25 gauge nål fäst vid en en milliliter spruta som innehåller 100 mikroliter av cell källaren membran matris mix och något dra in kolven för att se till att nålen inte kontakta några blodkärl.För jämförande resultat måste injektionsstället för tumörcell vara konsekvent bland alla mottagardjur. Om inget blod kommer in i sprutan, injicera långsamt hela volymen av lösningen i bröstfettet pad. En rund upphöjd massa kommer att visas under huden.Vänta 10 till 15 sekunder för källaren membran matrisen att härda innan du tar bort nålen och låta xenograft att växa fritt utan avbrott i sju till 10 dagar innan de utför en tumör storlek mätning. Använd sedan bromsok för att mäta storleken på xenograft i alla möss och bestämma tumörvolymen med hjälp av ekvationen som anges. Innan de avbildar studiedjuren, bild ytterligare tre tumörlager möss i 40 minuter med två minuters mellanrum med hjälp av parametrarna som anges för att få luciferin kinetik för studien.Använd den topp uppmätta bioluminescenssignalen för att definiera det optimala fönstret för bildanskaffningstid för alla efterföljande tidspunkter. För att utföra metastasering imaging, täcka den primära tumören med en ärm skuren från en svart handske och placera en sövd mus i skannern sedan bilden luciferin signalen med samma parametrar som just visat med den ventrala sidan av musen vänd mot kameran för lung metastasering imaging och den dorsala sidan av musen mot kameran för hjärnan metastasering imaging. Med hjälp av en skanner och dataanalys programvara, dra en region av intresse över det avbildade området för att säkerställa att hela organet av intresse omfattas för att möjliggöra utvärdering av den metastaserande bördan och kvantifiera bioluminescens produktionen som den totala flux och fotoner per sekund.Omedelbart efter bioluminescens signal kvantifiering, skörda hjärnan och lungvävnad och snabbt skölja organen i PBS för att ta bort eventuella ytliga blodfläckar. Placera organen på en låg auto fluorescens svart plastplatta och transportera proverna till en multi-spektral fluorescens scanner utrustad med spektrala oblandande förmåga för GFP upptäckt. För att förvärva multispektrala GFP-bilder av de extraherade organen, skanna organen från 500 till 720 nanometer med stegstorlek på 10 nanometer.För att få vävnad auto fluorescens profil, skanna strukna organ av uninjected kontroll möss. Dessutom bilden GFP positiva vävnader såsom primära tumör att förvärva auto fluorescens blandade GFP profil. Bearbeta dessa spektra enligt tillverkarens protokoll för att upprätta ett spektralbibliotek med rena GFP och auto fluorescensprofiler.Efter att ha bekräftat noggrannheten i spektrala biblioteket och separera GFP signal från vävnad auto fluorescens bakgrund, utnyttja samma bibliotek att oblanda alla bilder på studien. För DNA-extraktion efter snap frysning, placera hela hjärnan i en fem milliliter homogeniserande rör som innehåller två milliliter DNA-lysbuffert och använda en homogenisator inställd på 50 för att homogenisera vävnaden. När vävnaden har blivit helt homogeniserad, överför en milliliter av lysaten till ett DNAse och RNAse fritt två milliliter mikrocentrifugrör och isolera DNA-na enligt tillverkarens protokoll.Tillsätt 500 mikroliter med 100%etanol till isolatet och blanda provet genom inversion. Efter tre minuter i rumstemperatur, använd en pipett för att överföra ullliknande DNA-fällningen till en ny två milliliter DNAse och RNAse gratis tub. Låt provet lufttorka i en minut innan du lägger till en milliliter av 75%etanol till röret och invertera röret tre till sex gånger för att tvätta provet.Kasta etanol efter den sista inversion innan du tvättar DNA ytterligare två gånger med färsk etanol per tvätt som just visat. Efter den sista tvätten lufttorkar du provet i 10 sekunder innan DNA:t i 52 mikroliter av åtta millimolarnatriumhydroxid upplöses. Överför en två mikroliter alikvot av DNA till en spektrofotometer injektionsflaska och kvantifiera koncentrationen av DNA i provet med hjälp av en absorbanskvot mellan A260 och 280 enligt formeln.Justera DNA-koncentrationen av provet till 50 nanogram per mikroliter med ytterligare åtta millimolar natriumhydroxid och utforma primerparet som är specifikt för den exogena gröna GFP-sekvensen i egen regi med hjälp av en webbportal för design av öppen källkod för realtids-PCR-påvisande av GFP-taggen och de metastaserande celler som har invaderat och koloniserat tumörens distala platser. Använd sedan en snabb realtids-PCR-reagens och en realtids-PCR-maskin som stöder ett snabbt REALTID PCR-protokoll för realtids kvantitativ PCR-analys av provet. För upptäckt av metastaserande bröstcancerceller i lungan, använd dissekera sax för att öppna brösthålan och skär förbi hjärtat och bräss för att exponera luftstrupen.Sätt in en 22 gauge nål som är fäst vid en 10 milliliter spruta som innehåller Bouinlösning i luftstrupen och tryck ned kolven tills de kollapsade lungorna blir svullna med cirka två milliliter av lösningen. Ta bort sprutan och nålen när lungorna har pumpats upp och överför hela lungan till ett 15 milliliter rör som innehåller färsk Bouinlösning. Försiktigt invertera röret några gånger innan du lämnar vävnaden att suga i 24 timmar vid rumstemperatur.Nästa dag, skölj lungan med vatten och placera provet i ett rör av 70%etanol. Använd sedan ett dissekerande mikroskop för att räkna antalet metastaserande vita fläckar och knölar på ytorna i lungorna. Tumörvolymmätning genom bromsok är en väletablerad metod för att bedöma behandlingseffekt.För att få jämförbara signaler mellan studiegrupperna måste en pre-imaging BLI-kinetikstudie genomföras för att fastställa den bästa tidsramen för bildåtergivning. På grund av den överlägsna signal-till-bakgrund förhållandet, hela kroppen in vivo BLI är ganska känslig för att upptäcka låg nivå metastasering signaler jämfört med GFP-metoden. Men på grund av den stabila karaktären hos GFP-molekylen har forskarna tillräckligt med tid för att bearbeta kadavret innan de fångar upp GFP-signalerna från målorgan i studier med dubbla reporter.Detta verkliga livet exempel visar hur bromsok tumör storlek mätningar kan förvränga data tolkningen som denna xenograft förlorat de flesta av livskraftig tumör cell innehåll samtidigt som dess stora massa och form. Molekylär detektion genom realtids-PCR kan också ge övertygande bevis på hjärnmetastas i den ortopiska bröstcancermodellen med exogen GFP DNA-sekvensering då den transfekterade GFP DNA-sekvensen inte naturligt existerar hos människor eller gnagare. Implantationsstället bör vara fysiologiskt och anatomiskt relaterat till cancer malignitet.Både tumörgen och proteinuttryck kan utvärderas vid primära och distala platser och metastaserande celler kan isoleras för ytterligare karakterisering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer Video (Video) | JoVE

Fluorescerande Orthotopic musmodell för cancer i bukspottskörteln

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

En portådern Injection modell för att studera levermetastaser av bröstcancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema Video (Video) | JoVE

Ultraljud av bröstcancer relaterade lymfödem

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish Video (Video) | JoVE

Invasiv Beteende av humana bröstcancerceller i embryonal zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad Video (Video) | JoVE

Ortotop injektion av bröstcancerceller i möss mjölkkörtlar fettet Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Performing Data Mining And Integrative Analysis Of Biomarker in Breast Cancer Using Multiple Publicly Accessible Databases

Performing Data Mining And Integrative Analysis Of Biomarker in Breast Cancer Using Multiple Publicly Accessible Databases Video (Video) | JoVE

Utföra data mining och integrativ analys av Biomarker i bröst Cancer med hjälp av flera allmänt tillgängliga databaser

In recent years, emerging databases were designed to lower the barriers for approaching the intricate cancer genomic datasets, thereby, facilitating ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Ortopisk transplantation av brösttumörer som prekliniska modeller för bröstcancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

Använda datorbaserad bildanalys för att förbättra kvantifiering av lung metastasering i 4T1 Bröstcancermodellen

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...