Name: a macrophage reporter cell assay to examine toll-like receptor-mediated nf-kb/ap-1 signaling on adsorbed protein layers on polymeric surfaces
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces at JoVE.com

作者感谢加拿大卫生研究院研究项目（PTJ 162251）、皇后大学参议院咨询委员会以及加拿大创新基金会约翰·埃文领导基金（项目34137）和安大略省研究与创新部研究基金（项目34137）提供的基础设施支持。L.A.M.得到了皇后大学R.塞缪尔·麦克劳克林奖学金、加拿大加拿大研究生奖学金硕士学位和安大略省研究生奖学金的支持。作者要感谢Myron Szewczuk博士慷慨地赠送了NF-+B/AP-1报告人大噬细胞系和迈克尔·布伦纳哈塞特博士和桑德拉·洛伦森博士，感谢他们的凝胶成像系统和板阅读器的使用。

1. 介质和试剂制备
<ol><li>准备成纤维细胞介质。结合450 mL的Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM），50 mL的胎儿牛血清（FBS），和5 mL的青霉素/链霉素。储存在4°C下长达3个月。</li>
	<li>准备记者巨噬菌体生长介质在50 mL等分。结合45 mL的DMEM，5 mL的FBS，5μg/mL支原虫消除试剂（材料表）和200μg/mL phleomycin D1（材料表）。储存在4°C下长达3个月。</li>
	<li>准备记者巨噬菌体测定介质在50 m...

我们实验室的一个主要重点是对固体生物材料软组织植入物的宿主响应，特别是植入过程中发生的细胞损伤如何影响宿主响应。这里介绍的初步实验使用报告宏噬细胞细胞系和体外生成的DAMP包含细胞解酶，以研究细胞损伤（即从植入手术）释放的分子对生物材料的巨噬细胞反应的影响。纤维细胞解酶用于模拟由于生物材料放置而导致的细胞损伤和DamPs的释放。由于软组织中成纤维细胞的流行，以?...

异物反应（FBR）是一种慢性宿主反应，通过持续释放炎症介质和阻碍植入物质与周围组织1的整合，会对植入的物质或装置（如药物输送装置、生物传感器）的性能产生负面影响。这种先天免疫反应是由植入程序引起的，其特点是先天免疫细胞和纤维胶囊在植入物1周围长期存在。在物质宿主响应的上下文中，巨噬菌体-材料相互作用对宿主响应的进展和FBR1的发展有显著影响。巨噬细胞是一种多样化的先天免疫细胞群，从组织居民巨噬细胞群或从血液中提取的单细胞衍生巨噬细胞被招募到植入部位。它们在植入后不久开始在植入部位积累，并在几天内成为植入微环境中的主要细胞群。物质粘附性巨噬细胞，以及通过巨噬细胞融合形成的异体巨细胞（FBGC），可以在植入物2、3的寿命内在材料表面保持。因此，巨噬细胞被认为是异体反应的关键参与者，因为它们的作用是协调FBR的特征步骤：急性炎症反应、组织重塑和纤维化组织形成1。
收费受体（TTL）是一个模式识别受体家族，由许多免疫细胞（包括巨噬细胞）表达，并已被证明在炎症和伤口愈合中发挥重要作用。除了病原体衍生的配体外，TDR 能够结合内源性分子，称为损伤相关分子模式 （DAMPs），这些分子在细胞坏死期间释放并激活炎症信号通路，导致产生亲炎细胞因子4。我们和其他人提出，软组织生物材料植入过程中发生的损伤释放DAMPs，然后吸附到生物材料表面，除了血液蛋白和调节随后的细胞-物质相互作用5，6。当巨噬细胞与植入物上的吸附蛋白层相互作用时，其表面TVR可以识别吸附的DamPs并激活亲炎信号级联，导致NF-βB和AP-1转录因子的激活和原炎细胞因子的产生。我们之前已经表明，与仅吸附血清或血浆表面（即不存在DAMPs）相比，小鼠巨噬细胞显著地增加了NF-β-B/AP-1活性和肿瘤坏死因子α（TNF-α，前激细胞因子）分泌物，以响应各种聚合物表面的含DAMP吸附蛋白层，而仅吸附血清或血浆的表面（即，不存在DAMPs），而这种反应主要是由TLR2调节的。
该协议中使用的NF-+B/AP-1报告宏噬细胞细胞系（材料表）是测量巨噬细胞5、7、8中相对NF-+B和AP-1活性的便捷方法。结合TLR通路抑制剂，该细胞系是研究TLR激活及其在炎症中作用的有用工具，对各种刺激5，7，8。报告细胞是经过修饰的小鼠巨噬细胞样细胞系，可在NF-βB和AP-1转录因子活化9时稳态产生分泌的胚胎碱性磷酸酶（SEAP）。然后，可以使用色度酶碱性磷酸酶测定（材料表）来量化相对量的SEAP表达，作为NF-βB/AP-1活性的间接测量。由于NF-βB和AP-1是许多细胞信号通路的下游，因此可用于验证特定通路的作用，用于验证特定途径的作用，以靶向特定TVR（例如TLR2）或TLR适配器分子（本文中描述的方法提供了一种简单而快速的方法，用于评估 TLR 信号在小鼠巨噬细胞反应中对各种聚合物表面的贡献，其中吸附的蛋白质层同时含有血液蛋白和 DAMPs，作为植入生物材料的体外模型。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse/human CD282 (TLR2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLI-095 (TLR4 inhibitor)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-CLI95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin</td>
			<td>InnovativeResearch</td>
			<td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td>
			<td>Mouse plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), research grade</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>98150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-EKLPS</td>
			<td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ANT-MPP</td>
			<td>Mycoplasma elimination reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW-Blue cells</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>raw-sp</td>
			<td>NF-&#954;B/AP-1 reporter macrophage cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express enzyme (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ANT-ZN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Kits and assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA precoated plates, mouse IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>B213022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA precoated plates, mouse TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>B220233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE)</td>
			<td>Associates of Cape Cope Inc.</td>
			<td>E0005-5</td>
			<td>Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL water, 100 mL</td>
			<td>Associates of Cape Cope Inc.</td>
			<td>WP1001</td>
			<td>Used with chromogenic endotoxin assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA protein assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit</td>
			<td>Associates of Cape Cope Inc.</td>
			<td>C1500-5</td>
			<td>Chromogenic endotoxin assay reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>rep-qb2</td>
			<td>Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-&#954;B/AP-1 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Polymeric coating reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006EAAN</td>
			<td>Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight tapered fine tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-40 solvent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9755-100ML</td>
			<td>Fluorinated solvent for fPTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water (endotoxin-free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30529LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methyl methacrylate) (PMMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>182230-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50822180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon-AF (fPTFE)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>469610-1G</td>
			<td>Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PS 48-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TCPS 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear TCPS 48-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks, T25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated flasks, T150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a macrophage reporter cell assay to examine toll-like receptor-mediated nf-kb/ap-1 signaling on adsorbed protein layers on polymeric surfaces

对植入的生物材料（称为异物反应）的持续炎症宿主反应是生物医学设备和组织工程结构开发和实施方面的一个重大挑战。巨噬细胞，一种先天免疫细胞，是异物反应的关键参与者，因为它们在设备的寿命期间停留在植入部位，并且经常被研究，以理解这种有害的宿主反应。许多生物材料研究人员已经表明，在植入材料上吸附蛋白质层会影响巨噬菌体行为，进而影响宿主反应。本文的方法描述了一种体外模型，利用在聚合物生物材料表面含有细胞损伤分子的吸附蛋白层来评估巨噬细胞反应。NF-*B/AP-1报告器巨噬细胞系和相关色度碱性磷酸酶测定作为一种快速方法，间接检查NF-*B/AP-1转录因子活性，以响应含有血液蛋白和损伤相关分子模式的复杂吸附蛋白层，作为在体内生物材料表面形成的复杂吸附蛋白层的模型。

对聚合物涂层表面的清洁方法进行了测试，以确保涂层不会中断，这被视为水接触角度与未涂布玻璃盖玻片的变化（图2）。在70%乙醇中浸泡PMMA涂层显微镜滑片1小时，可去除PMMA涂层（图2，左侧面板），这可能是由于PMMA在80wt%乙醇13中的溶解性，因此仅使用30分钟的紫外线灭菌就清洗PMMA涂层表面。PMMA涂层的浓度以前已经优化<sup class="xr...

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A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

该协议为研究人员提供了一种快速、间接的方法，用于测量小鼠巨噬细胞系中与TLR相关的NF-B/AP-1转录因子活性，以响应各种聚合物表面和吸附蛋白层，这些蛋白质层为生物材料植入微环境建模。

巨噬细胞报告器细胞分析，以检查聚合物表面的吸附蛋白层上的收费类似受体介导NF-kB/AP-1信号

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

该协议能够快速评估在吸附蛋白层培养的记者巨噬细胞中的NF-kappa-B和AP-1活性，以及细胞信号通路（如收费受体）对该反应的贡献。该技术的主要优点是它的简单性，允许细胞培养超自然使用直接酶分析快速分析NF-kappa-B和AP-1活性。首先在烟罩中以每毫升20毫克的最终浓度溶解氯仿中的PMMA。在小瓶中放置一个磁搅拌棒，搅拌混合物至少两个小时。当所有固体溶解后，将 PMMA 溶液的 400 微升转移到每个玻色玻璃显微镜的中央，每个玻色玻璃显微镜在旋转涂布器上按照计划条件滑动，然后以每分钟 3，000 次旋转的速度将 PMMA 旋转到幻灯片上两分钟。然后将旋转涂层的幻灯片存放在 70% 乙醇喷洒的清洁盒中。接下来，在生物安全柜中，使用无菌钳子和无菌技术将八室粘井连接到 PMMA 涂层滑轨上，用力压在每口粘井的顶部，以确保它们牢固地连接。注意将粘性孔与显微镜幻灯片的边缘对齐，以便所有孔都连接到幻灯片上，并且不会泄漏。在37摄氏度下孵育粘性良好的滑梯过夜，以确保密封。然后在每口井中加入200微升细胞培养级无内毒素水，在室温下进行60分钟的孵育，第二天早上测试密封。在孵化结束时，吸水，注意不要打扰PMMA涂层。每井用300微升新鲜无内毒素水清洗三次，每次洗涤一小时，然后一次12小时和一次24小时清洗，然后使用以去除任何剩余的溶剂。然后紫外线对幻灯片进行消毒 30 分钟。为了获得3T3细胞解酶，当3T3细胞培养物在T150培养瓶中达到70%的汇合时，用5毫升PBS洗涤每个培养物，并在37摄氏度下用5毫升动物源性重组细胞分离酶处理，每瓶37度，用3至5分钟。在孵育结束时，轻轻倾斜每个烧瓶来回几次，以分离细胞，然后用每培养的五毫升PBS中和酶。将分离的细胞集中到一个50毫升的离心管中，并使用移液器分解任何细胞团。计数后，通过离心收集细胞。吸升液，并在新鲜PBS中以每毫升浓度的1倍10再给6个细胞。然后将细胞冷冻在零下80摄氏度的冰柜中至少两个小时，直到样品完全冷冻，然后将冷冻细胞溶液放入37摄氏度的水浴中，直到完全解冻。为了评估吸附蛋白层对收费样受体中继的NF-kappa-B/AP-1活性的影响，在适当大小的烧瓶中将记者巨噬细胞生长到70%汇合后，使用适当的酶分离溶液分离细胞，如所证明的。在测定介质中，每毫升浓度的细胞浓度为7.3倍至5个细胞，并在三根管子之间均匀地将细胞等匀。用每毫升一微克的TLR4抑制剂治疗第一管细胞，在室温下60分钟，用每毫升50微克抗TLR2抗体治疗第二管，在室温下30分钟，在室温下将第三管留在室温下，无需治疗。当细胞孵育时，每个情况在三个粘性孔中加入200微升的乳酸和10%的胎儿牛血清。允许蛋白质在37摄氏度下吸附，在适当的实验期间，然后用新的巴斯德移液器为每井吸进蛋白质溶液，并洗涤粘性井表面三次，每井用250微升PBS，每次洗涤5分钟。在记者宏噬细胞治疗结束时，每井加入200微升细胞溶液。将 Pam3CSK4 添加到每毫升 150 毫微克的最终浓度中，以两个孔作为 TLR2 正对照，如示意图所示。对于 TLR4 阳性控制，将脂多糖添加到每毫升 1.5 微克的最终浓度中，以两口井。在37摄氏度下20小时后，每口井中20微升的上经液在96孔的板块中重复，包括三口井，每口有20微升的检测介质，以及背景控制。接下来，在每口井中加入200微升的SEALP检测试剂，用胶粘剂密封覆盖板，在37摄氏度下孵育2个半小时。将上经液的剩余部分转移到每粘井一个1.5毫升的管中，通过离心沉淀碎屑。然后将超级钠转移到新的1.5毫升管中，用于零下80摄氏度的储存，由ELISA进行下游的发炎细胞因子分析。在孵化结束时，从板中取出胶粘剂密封，并在 635 纳米的板读卡器上读取吸光度。将 PMMA 涂层显微镜浸泡在 70%乙醇中一小时，可去除 PMMA 涂层，而 70% 乙醇和紫外线灭菌均不会影响 fPTFE 涂层盖玻片的水接触角度。西方对3T3 lysates的印迹分析揭示了HMGB1和热休克蛋白60的存在，这两种有据可查的损伤相关分子模式。TLR配体从赖酸盐吸附到聚合物表面，可以通过在蛋白质吸附的聚合物表面培养记者巨噬细胞20小时，然后通过酶测定间接评估NF-kappa-B/AP-1活性来证实。在抑制TLR2或TLR4信号后，此活性降低。此外，与吸附的FBS或血浆相比，记者巨噬细胞显著增加了NF-kappa-B/AP-1活性，以响应吸附的赖酸盐，并且没有预吸附的蛋白质。此外，与血清相比，血清中稀释的少量酸盐诱导的NF-kappa-B/AP-1反应显著增加，有效稀释程度最低取决于聚合物表面。为避免涂层表面的内毒素污染，在清洁区域工作，不使用时覆盖表面，并使用细胞培养分级水和缓冲液进行冲洗。按照这个程序，可以对剩余的超级物进行免疫测定，以评估蛋白质分泌，巨噬细胞可以通过流细胞测定和qPCR基因表达分析进行分析。

Research

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