Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

نشكر البرت بان و أردت Sieakmann علي هدايا الأسماك المحورة وراثيا. نشكر كويشي كاواكامي في المعهد الوطني لعلم الوراثة ، المشروع الوطني للموارد البيولوجية التابع لوزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان علي هديه الHGn39bالمحورة وراثيا. ونشكر أيضا فاطمة ميرشانت وكاثلين غايجوسكي علي المساعدة في المجهر البؤري ، وعلي تريسي ثيرتيولت للصور الفوتوغرافية.
وقد دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم P30ES023512 ورقم العقد HHSN273201500010C). وقد دعمت الرابطة زمالة من برنامج البيولوجيا الحاسوبية للسرطان (Keck) (اتحاد ساحل الخليج كبريت منحه RP140113) ومن قبل صندوق هبات هيو روي وليلي. وقد دعمت مؤسسه روبرت ا. ويلش (0004).

تمت الموافقة علي العمل الحيواني المعروض هنا من قبل المؤسسات المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها (Acucs) في جامعه هيوستن وجامعه إنديانا.
1-تربيه الأسماك
ملاحظه: يتطلب العمل مع نماذج فقاري بروتوكول معتمد IACUC. وينبغي ان تجري وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والدولي?...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

ويرد هنا طريقه متصاعدة لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة. الخطوة الأكثر اهميه بالنسبة لطريقه التركيب هي تحديد التركيز الأمثل للنشا الذي سيسمح بنمو الجنين الزبرفيش غير المقيد ، وفي الوقت نفسه إبقاء الاجنه في وضع ثابت تماما للتصوير البؤري. ونظرا لان التركيز الأمثل للاغ?...

ومنذ فتره طويلة كان الزبرافيش كائنا نموذجيا لعلم الاحياء التنموي ، والمجهر هو الطريقة الرئيسية لتصور التطور الجنيني. وتشمل مزايا استخدام الاجنه الزبرافيش للدراسات التنموية صغر الحجم ، والوضوح البصري ، والتطور السريع ، والخصوبة العالية للأسماك البالغة. وقد سمح الجيل من خطوط الزرد المحورة وراثيا التعبير عن الفلوري في بعض الانسجه أو الخلايا لتصور مباشر لتطوير الانسجه بطرق غير ممكنة مع أكبر الفقاري الحيوانية. الاقتران مع المجهر الزمني ، يمكن دراسة تفاصيل وديناميكيات تطور الانسجه بسهوله.
صعوبة مع التصوير التنمية الزرد هو ان الاجنه تنمو بشكل كبير في الطول; يمدد الجنين طوله أربعه أوقات ضمن الاولي 3 أيام الحياة1. كما ان جسم الجنين المبكر لين ، ويصبح مشوها بسهوله إذا كان النمو مقيدا. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر البؤري ، يجب ان يتم شل الجنين. للحفاظ علي الاجنه في وضع ثابت للتصوير الفاصل الزمني البؤري ، يتم تخديرها بانتظام وتركيبها في 0.3-1 ٪ منخفضه الذوبان التي نشات. هذا له ميزه السماح لبعض النمو اثناء التصوير لفتره معينه من الزمن ، في حين تقييد تحركات الجنين. يمكن ان تكون أجزاء من الجنين فعاله مثل هذا. ومع ذلك ، عند استخدام هذه الطريقة لتصوير الجنين بأكمله لفترات زمنيه طويلة ، لوحظت تشوات بسبب النمو المحدود الناجم عن الاجنه. التالي ، هناك حاجه إلى أساليب التركيب الأخرى. وقد وصف كوفمان وزملاءه بديلا لتركيب الاجنه الخفيفة للحصول علي المجهر المجهري للضوء ، مثل المجهر الضوئي الانتقائي للطائرة (SPIM) ، عن طريق تركيب الاجنه في أنابيب الاثيلين البروبيلين (إثراء) المشبعة بالفلور التي تحتوي علي تركيزات منخفضه من الاغثار أو ميثيل سيلولوز2. وتنتج هذه التقنية تصورا رائعا لتولد الاجنه علي مر الزمن. ويصف شميد وآخرون تركيب ما يصل إلى سته أجنه في الأنابيب المجهرية للضوء بالورقة الخفيفة3 التي تقدم تصورا لعده أجنه في جلسة تصوير واحده. وقد استخدمت قوالب لإنشاء صفائف الاجنه لتركيب فعال لاعداد أكبر من الاجنه4. وقد شيدت masselkink وآخرون قوالب البلاستيك المطبوعة 3d التي يمكن استخدامها لجعل يلقي السيليكون ان الاجنه الزرد في مراحل مختلفه يمكن وضعها في ، وتمكين تصاعد في موقف ثابت للتصوير ، بما في ذلك التصوير البؤري5. وقد استخدمت الطباعة 3d أيضا لجعل قوالب لتحديد المواقع متسقة من الاجنه الزرد في شكل 96-بئر6. يتم تخصيص بعض القوالب لمراحل معينه ، وقد لا تسمح النمو غير المقيد لفترات زمنيه طويلة ، في حين ان قوالب أخرى أكثر مرونة. وفي الاونه الاخيره ، نشرت Weijts et al. تصميم وتصنيع طبق من أربعه ابار للتصوير الحي لأجنه الزيبرافيش7. في هذا الطبق ، يتم وضع ذيل وجذع الاجنه السمكية التخدير يدويا تحت سقف السيليكون واضحة المرفقة فقط فوق الزجاج غطاء لتشكيل جيب. ثبتت الجنين بعد ذلك في هذا موقعه بالاضافه من 0.4% [اغبرز]. هذا التصاعد يسمح للتصوير حوالي 2 مم الجزء الخلفي طويلة (الجذع والذيل) من الجنين ، وبما يصل إلى 12 الاجنه يمكن تركيبها في بئر ، وطريقه يسمح للتصوير من عينات متعددة. المثل ، قدم Hirsinger و Steventon مؤخرا طريقه حيث يتم تركيب راس السمكة في اجنشا ، في حين ان الذيل يمكن ان تنمو بحريه ، وهذا الأسلوب أيضا يسهل بكفاءة التصوير من الجذع ومنطقه الذيل من الجنين8.
توضح هذه المقالة طريقه متصاعدة من الطبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركات الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. مزايا هذه الطريقة المتصاعدة هي انها طريقه منخفضه التكلفة وسريعة وسهله لتحميل الاجنه من مختلف المراحل للتصوير باستخدام اي المجهر المقلوب. التركيب يسمح التصوير علي المدى الطويل من الجسم كله (الراس والجذع والذيل) اثناء تطوير الجنين. لعرض قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا. وقد أصيب اثنان من الاجنه في الدورة الواحدة ، في فترتين موجيتين ثلاثيتي الابعاد ، بالمجهر الزمني لمده 55 ساعة متتالية لتقديم أفلام عن تطور الانسجه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

ويمكن ان يعقب ديناميات التنمية المجهر الزمني الفاصل بين الاجنه الحية المحورة وراثيا التي تعبر عن الفلورية في انسجه أو خلايا محدده. صعوبة في التصوير تطوير الجنين كله هو ان الاجنه الزرد تنمو بشكل كبير في الطول. عندما شنت علي النحو الذي تم بانتظام في 0.3-1 ٪ ذوبان منخفضه نشات ، والاجنه يفرض قيود النمو ، مما يؤدي إلى تشوات في جسم الجنين لينه. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر الزمني الفاصل ، يجب ان يتم شل الجنين. توضح هذه المقالة طريقه تركيب طبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركيه الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه. لإثبات قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا لمده 55 ساعات متتالية. ويمكن استخدام هذه الطريقة المتصاعدة للتصوير سهله ومنخفضه التكلفة من الاجنه الزرد كله باستخدام المجاهر المقلوبة دون متطلبات قوالب أو المعدات الخاصة.

تطوير طريقه التركيب وكان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تطوير تقنيه التركيب منخفضه التكلفة للتصوير بالفواصل الزمنيه للتطوير الإشعاعي لفترات طويلة من الزمن. تم تطوير أسلوب التركيب الطبقي للسماح بالنمو الكامل للجسم الجنيني الهش ، مع تقييد تحركاته. إذا كان تركيز الطبقة 1 مرتفعا جد...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

لقد طورنا طريقة تصاعد لتصوير الوقت الفاصل الذي يسمح للنمو غير المقيد لأجنة حمار وحشي هشة وفي الوقت نفسه يبقيها في وضع ثابت تماما. هذه الطريقة تصاعد سريع وسهل ورخيص ويعمل على التصوير المختبري على أي مجهر مقلوب. لقد طورنا هذه الطريقة لتصوير أجنة الحمار الوحشي الحية ، ولكن يمكن تعديلها لتصوير نماذج الحيوانات المائية المائية الصغيرة الأخرى.ابدأ بتربية الحمار الوحشي البالغ. في فترة ما بعد الظهر، ضع الأسماك في خزانات التربية بنسبة الذكور إلى الإناث من واحد إلى اثنين. ثم إعداد محلول الأسهم من 1٪ تذوب منخفضة agarose في وسائل الإعلام الجنين وتذوب عن طريق تسخينه في فرن الميكروويف.Aliquot حل agarose في أنابيب 1.5 ملليلتر. جعل حل الأسهم من 4٪ tricaine في الماء المقطر وتخزين agarose والتريكايين في أربع درجات مئوية. Tricaine هو سام ويجب أن يكون وزنه وأعدت في غطاء الدخان.بعد التزاوج، حصاد أجنة الحمار الوحشي في E3 في طبق بيتري واحتضان لهم في 26.5 درجة مئوية لحوالي 28 ساعة قبل تصاعد. تخدير الأجنة مع 0.02٪ tricaine وdehorionate لهم تحت المجهر عن طريق تجتاح بلطف وسحب chorion بعيدا لاطلاق سراح الجنين. قبل التركيب فقط، قم بتسخين محلول agarose إلى 65 درجة مئوية ثم اتركه يبرد إلى ما يقرب من 30 درجة مئوية حتى لا يتضرر الجنين من الحرارة ويضيف ثلاثية الأجاجين إلى محلول أغاروز.استخدام 35 ملليمتر الأطباق أسفل الزجاج مع عدد صفر غلاف زجاجي القاع. ضع بلطف جنينًا مُغَفّلًا مع أحد جوانبه الجانبية تجاه الجزء السفلي من الطبق مع ماصة زجاجية أو ميكروبيبيت ، ثم قم بإزالة أي E3 متبقية بعناية باستخدام ميكروبيبيت. أضف أول حل agarose إلى البئر الصغير الذي تم إنشاؤه بواسطة الغطاء الزجاجي المرفق بأسفل الطبق لتغطية الجنين للتأكد من أن الأغاروز يغطي البئر الصغير ولكنه لا يفيض عليه.غطي البئر الصغير بغطاء زجاجي لإنشاء مساحة ضيقة مليئة بالأغاروز مع الجنين بين نظارتي الغطاء. وضع طبقة من 1٪ agarose حل على رأس الغطاء في جميع أنحاء الجزء السفلي من الطبق الذي سوف تبقي الغطاء في مكان كما أنه يقوي. ثم تعبئة الجزء المتبقي من الطبق مع E3 التي تحتوي على 0.02٪ tricaine للحفاظ على النظام رطب.لتحديد التركيز الأمثل للأغاروز للطبقة الأولى، قم بتركيب الأجنة في تركيزات متزايدة من الأاروز وقم بتصوير الفاصل الزمني لتحديد التركيز الذي يقلل من تشويه الجنين وحركته، ثم اختبر مجموعة أدق من التركيزات استنادًا إلى النتائج. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تحديد التركيز الأمثل من agarose للطبقة الأولى. اختبار تركيزات نانو مختلفة من agarose مثل 0.030٪0.032٪الخ.لإيجاد التركيز الأمثل. لإجراء التصوير الفاصل الزمني للأجنة، استخدم مرحلة المجهر مع حاضنة تعيين إلى 28.5 درجة مئوية والصورة لمدة تصل إلى 55 ساعة. لتصوير عدة أجنة في وقت واحد، استخدم محول خشبة يحمل عدة أطباق ويدور الأطباق واحدا تلو الآخر بحيث يتم وضع الأجنة أفقيا.حدد هدف التكبير المنخفض، ثم حدد مكان الأجنة باستخدام العدسة وقم بمحاذاتها أفقيًا في النهاية عن طريق تدوير الأطباق. تسجيل موقع embryos'في البرنامج وإنشاء اسم ملف لحفظ البيانات تلقائيًا. قم بتعيين حجم الثقب وسرعة المسح الضوئي وحجم الصورة والتكبير/التصغير.ثم حدد تكبير أعلى لالتقاط الصور وقنوات التألق ليتم تصويرها. لكل قناة، ضبط قوة الليزر والجهد العالي للكشف التأكد من جمع أفضل نطاق ممكن مع تجنب التشبع والحد من تبييض الصور. بعد ذلك ، لتصوير الجنين بأكمله بهدف 10X ، قم بتعيين إعدادات التقاط الصور الكبيرة في البرنامج لصورة العديد من حقول الرؤية وخيطها معًا لضبط موضع الجنين للتأكد من أنه يناسب منطقة الصورة الكبيرة هذه.تكوين الإعدادات لالتقاط مكدسات Z وفقاً لتوجيهات المخطوطة. من أجل الحفاظ على تركيز الأجنة المتعددة خلال التصوير طويل الأجل الفاصل الزمني ، استخدم تركيزًا آليًا وضبط مستويات الإزاحة الفردية لكل جنين للتركيز على المستوى المرجعي. ثم قم بإعداد معلمات الفاصل الزمني في برنامج المجهر على صورة لمدة 55 ساعة على فترات ساعة واحدة.في كل دورة، التقاط مجموعتي بيانات الجنين بشكل تسلسلي وحفظ البيانات تلقائيا. استخدام برنامج المجهر لمعالجة الصور. إذا تم تصوير أكثر من جنين واحد، قم بإنشاء ملفات مستقلة لكل جنين عن طريق تقسيم مجموعات البيانات استنادًا إلى موقع التصوير.قم بتحويل مجموعات البيانات الزمنية ثلاثية الأبعاد إلى مجموعات بيانات زمنية 2D باستخدام إسقاطات الحد الأقصى للكثافة أو أداة مشابهة. وأخيراً، قم بإنشاء ملفات الأفلام عن طريق الحفظ كـ AVI وتحديد الخيار لا ضغط مع فواصل زمنية 200 مللي ثانية لسرعة تشغيل خمسة إطارات في الثانية. هذه الطريقة التركيب الطبقات يجعل من الممكن لصورة الأجنة حمار وحشي في حين تسمح لهم بالنمو ولكن في نفس تقييد حركتهم.إذا كان تركيز الأاروز مرتفعًا جدًا ، تصبح الأجنة مشوهة. ولكن إذا كان منخفضا جدا، فإنها سوف تتحرك من مجال الرؤية خلال المجهر الفاصل الزمني. تم العثور على التركيز الأمثل agarose ليكون بين 0.028 و 0.034٪ حية المحارم الزبرئية المعدلة وراثيا التعبير عن RFP في الجنين بأكمله وGFP في الخلايا البطانية من الأوعية الدموية تم تصويرها لمدة 55 ساعة خلالها انبت السفينة بين الطوائف، وضعت تحت الأمعاء والرأس الأوعية الدموية، والتكثيف الضفير الوريدي السد مع تمديد الجذع حدث.تم تصوير الأجنة التي تعبر عن GFP والخلايا العصبية الحركية لتصور تطور الخلايا العصبية الحركية. تنبت محاور الخلايا العصبية الحركية من الأنبوب العصبي البطني فوق السونيت نحو الجانب البطني للجنين. تم تصوير التطوير المشترك لـ dorsal من محاور عصبية المحرك فيما يتعلق بموقف الأوعية بين الطوائف باستخدام تكبير أعلى.هذا جعل من الممكن تصور أدق التفاصيل من محور عصبي البطن تنبت وكذلك محور الدوران الظهرية تنبت من الأنبوب العصبي. كما زادت أعداد somite، و somites تمتد أيضا في الطول والعرض. وقد صورت هذه العملية باستخدام أجنة المعدلة وراثيا تعبر عن GFP في العضلات.لأن التركيز الأمثل من agarose ضيقة جدا، أنها حساسة جدا للاختلافات الصغيرة في القياسات عند إعداد حل الأسهم من agarose وأنه يحتاج إلى إعادة تعريف لكل دفعة جديدة من حل agarose. من المهم بعناية تعيين المعلمات التصوير بما في ذلك حجم الصورة والقرار، وسرعة المسح الضوئي، والتكبير، وكاشف الجهد العالي، وقوة الليزر لضمان الاتساق بين التجارب وأيضا للحد من إمكانية سمية الصورة وتبييض الصور خلال التصوير الفاصل الزمني على المدى الطويل. باستخدام هذه الطريقة تصاعد لأجنة الحمير الوحشية المعدلة تليها التصوير الفاصل الزمني الموسعة للكائن الحي كله، يمكننا تصور كيفية تطور الأنسجة المختلفة معا.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

خلية واحدة القياس الكمي لمعدلات تحلل البروتين بالأسفار الوقت الفاصل بين الفحص المجهري في ثقافة الخلية ملتصقة

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...