Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Vi takker Albert pan og Arndt Sieakmann for gaver af transgene fisk. Vi takker Koichi kawakami på National Institute of Genetics, det nationale bioresource projekt fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan for gaven af den transgene Zebra HGn39b. Vi takker også Fatima Merchant og Kathleen Gajewski for assistance i forbindelse med confokal mikroskopi og Tracey Theriault for fotografier.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Environmental Health Sciences af National Institutes of Health (tilskudsnummer P30ES023512 og kontraktnummer HHSN273201500010C). SU blev støttet af et stipendium fra Keck Computational Cancer Biology program (Gulf Coast konsortier CPRIT Grant RP140113) og af Hugh Roy og Lillie begavelse fund. J-Å G blev støttet af Robert A. Welch Foundation (E-0004).

Det dyre arbejde, der præsenteres her, blev godkendt af de institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg (IACUCs) på universitetet i Houston og Indiana University.
1. fiskeopdræt
Bemærk: arbejde med hvirveldyr modeller kræver en IACUC godkendt protokol. Den bør gennemføres i overensstemmelse med relevante nationale og internationale retningslinjer.
<ol><li>Vedligehold voksen Zebra som beskrevet i tidligere publiceret litteratur9.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Her beskrives en monteringsmetode til udvidet tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebra-embryoner. Det mest kritiske skridt for monteringsmetoden er at identificere den optimale koncentration af agopstod, der vil give mulighed for ubegrænset Zebra embryo vækst, og samtidig holde embryonerne i en helt fast position for confokale Imaging. Fordi den optimale koncentration af agat er meget smal, denne værdi er meget følsom over for fejl i målingen af vægten af agopstået og mængden af E3 under forberedelsen af op...

Zebra har længe været en model organisme for udviklingsmæssige biologi, og mikroskopi er den vigtigste metode til at visualisere embryonale udvikling. Fordelene ved at bruge Zebra embryoner til udviklingsstudier omfatter lille størrelse, optisk klarhed, hurtig udvikling, og høj afføring af voksne fisk. Generering af transgene Zebra linjer, der udtrykker fluorescens i visse væv eller celler, har givet mulighed for en direkte visualisering af vævs udvikling på måder, der ikke er muligt med større hvirveldyr. I kombination med tidsforskudt mikroskopi kan detaljer og dynamik i vævs udviklingen let undersøgt.
Et problem med billeddannelse Zebra udvikling er, at embryonerne vokser betydeligt i længden; embryonet udvider sin længde fire gange inden for de første 3 dage af livet1. Også, kroppen af det tidlige embryo er blødt, og let bliver forvrænget, hvis væksten er begrænset. For at udføre Konfokal mikroskopi skal embryonet dog være immobiliseret. For at holde embryoner i en fast position for konfokale time-lapse Imaging, er de regelmæssigt bedøvet og monteret i 0,3-1% lavsmelte agopstået. Det har den fordel, at det giver mulighed for en vis vækst under billeddannelse i en vis periode, samtidig med at embryoens bevægelser begrænses. Dele af embryonet kan effektivt blive afbildet som dette. Men ved anvendelse af denne metode til billeddannelse af hele embryonet i længere perioder, er forvridninger observeret på grund af begrænset vækst forårsaget af aghas. Således er andre monteringsmetoder påkrævet. Kaufmann og kollegerne har beskrevet en alternativ montering af Zebra-embryoner til mikroskopi af lysplader, såsom mikroskopi med selektiv flybelysning (spim), ved at montere embryonerne i de fluorerede ethylenpropylen (FEP)-rør, der indeholder lave koncentrationer af agrose eller methylcellulose2. Denne teknik giver en fremragende visualisering af embryogenese over tid. Schmid et al. Beskriv montering af op til seks embryoner i agopstået i FEB rør til lysplade mikroskopi3 giver visualisering af flere embryoner i en Imaging session. Forme er blevet brugt til at skabe embryon arrays til effektiv montering af større antal embryoner4. Masselkink et al. har konstrueret 3D trykte plastik forme, der kan bruges til at lave silicium kaster, at Zebra embryoner på forskellige stadier kan placeres i, hvilket muliggør montering i en konstant position til billeddannelse, herunder konfokale Imaging5. 3D-print er også blevet brugt til at lave forme til konsekvent positionering af Zebra embryoner i 96-Well format6. Nogle forme er tilpasset til visse stadier og kan ikke tillade ubegrænset vækst i lange perioder, mens andre forme er mere fleksible. For nylig udgav weijts et al. design og fabrikation af en fire-brønd skål til levende billeddannelse af Zebra embryoner7. I denne skål, halen og stammen af bedøvet fiskeembryoner er placeret manuelt under et klart silikone tag vedhæftet lige over et cover glas til at danne en lomme. Embryonet fastsættes derefter i denne position ved tilsætning af 0,4% agopstået. Denne montering giver mulighed for billeddannelse af den omkring 2 mm lange posterior del (krop og hale) af embryonet, og som op til 12 embryoner kan monteres pr brønd, metoden giver mulighed for billeddannelse af flere prøver. På samme måde har Hirsinger og Steventon for nylig præsenteret en metode, hvor lederen af fisken er monteret i agopstået, mens halen kan frit vokse, og denne metode også effektivt letter billeddannelse af stammen og hale regionen af embryonet8.
I denne artikel beskrives en lagdelt monteringsmetode for Zebra-embryoner, der begrænser embryonerne bevægelser og samtidig giver mulighed for ubegrænset vækst. Fordelene ved denne monteringsmetode er, at det er en billig, hurtig og nem metode til at montere embryoner i forskellige stadier til billeddannelse ved hjælp af et inverteret mikroskop. Monteringen tillader langtids billeder af hele kroppen (hoved, bagagerum og hale) under embryo udvikling. For at fremvise anvendeligheden af denne metode, hele embryo vaskulære, neuronal og muskel udvikling blev afbildet i transgene fisk. To embryoner pr. session, på to bølgelængder i 3D blev afbildet af time-lapse mikroskopi i 55 sammenhængende timer til at gengive film af vævs udvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

Dynamikken i udviklingen kan følges op af Konfokal tidsforskudt mikroskopi af levende transgene Zebra-embryoner, der udtrykker fluorescens i bestemte væv eller celler. Et problem med billeddannelse hele embryo udvikling er, at Zebra embryoner vokse betydeligt i længden. Når den er monteret som regelmæssigt udført i 0,3-1% lavsmelte agopstået, den agopstået pålægger vækst restriktion, hvilket fører til forvridninger i den bløde embryo-krop. Men for at udføre Konfokal tidsforskudt mikroskopi skal embryonet være immobiliseret. Denne artikel beskriver en lagdelt monteringsmetode for Zebra-embryoner, der begrænser motilitet af embryonerne, samtidig med at der tillades ubegrænset vækst. Monteringen udføres i lag af agopstået ved forskellige koncentrationer. For at demonstrere anvendeligheden af denne metode, hele embryo vaskulære, neuronal og muskel udvikling blev afbildet i transgene fisk for 55 sammenhængende timer. Denne monteringsmetode kan bruges til nem, billig billeddannelse af hele Zebra-embryoner ved hjælp af inverterede mikroskoper uden behov for forme eller særligt udstyr.

Udvikling af monteringsmetoden Hovedformålet med dette arbejde var at udvikle en omkostningsbesparende monterings teknik til tidsforskudt billeddannelse af Zebra-udvikling i længere tid ad gangen. Den lagdelte monteringsmetode blev udviklet for at give mulighed for fuld vækst af den skrøbelige Zebra embryo krop, mens begrænse dens bevægelser. Hvis den agrejste koncentration af lag 1 er for høj, vil embryonerne blive forvrænget og buet (figur 2). Embryoner dyrket v...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Denne artikel beskriver en metode til at montere skrøbelige Zebra embryoner til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi. Denne lavpris metode er nem at udføre ved hjælp af almindelige glas bunds mikroskopi retter til billeddannelse på ethvert inverteret mikroskop. Monteringen udføres i lag af agopstået ved forskellige koncentrationer.

En lagdelt monteringsmetode til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebrafish-embryoner

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Vi har udviklet en monteringsmetode til time-lapse-billeddannelse, der giver mulighed for ubegrænset vækst af skrøbelige zebrafiskembryoner og samtidig holder dem i en helt fast position. Denne monteringsmetode er hurtig, nem og billig, og den virker til laboratoriebilledbehandling på et omvendt mikroskop. Vi udviklede denne metode til billeddannelse af levende zebrafiskembryoner, men den kunne ændres til billeddannelse af andre små akvatiske dyremodeller.Start med at avle den voksne zebrafisk. Om eftermiddagen skal fiskene sættes i avlstanke i forholdet mellem han og hun på en-til-to. Derefter forberede en bestand opløsning på 1% lav smelte agarose i embryo medier og opløse det ved at opvarme det i en mikrobølgeovn.Agaroseopløsningen aliquot i 1,5 milliliterrør. Lav en lagerløsning på 4% tricain i destilleret vand og opbevar agarose og tricain ved fire grader Celsius. Tricain er giftigt og skal vejes og tilberedes i en røghætte.Efter parring, høst zebrafisk embryoner i E3 i en petriskål og inkubere dem ved 26,5 grader Celsius i ca 28 timer før montering. Bedøve embryoner med 0,02% tricain og dechorionate dem under et mikroskop ved forsigtigt gribende og trække chorion fra hinanden for at frigive fosteret. Lige før montering opvarmes agaroseopløsningen til 65 grader Celsius, og lad den derefter køle af til ca. 30 grader Celsius, så fosteret ikke skades af varmen og tilsæt tricain til agaroseopløsningen.Brug 35 millimeter glasbund retter med et tal nul coverglas bund. Forsigtigt placere en dechorionated embryo med en af sine laterale sider mod bunden af skålen med et glas pipette eller en mikropipette, derefter forsigtigt fjerne eventuelle resterende E3 med en mikropipette. Tilsæt den første agaroseopløsning til den lille brønd, der er skabt af dækglasset fastgjort til bunden af skålen for at dække fosteret, og sørg for, at agarose dækker den lille brønd, men ikke overløb det.Dæk den lille brønd med et dækglas for at skabe et smalt agarosefyldt rum med fosteret mellem de to dækglas. Placer et lag på 1% agarose opløsning på toppen af coverglass over hele bunden af skålen, som vil holde coverglas på plads, da det størkner. Fyld derefter den resterende del af skålen med E3 indeholdende 0,02% tricain for at holde systemet hydreret.For at identificere den optimale agarosekoncentration for lag et monteres embryonerne i stigende koncentrationer af agarose og udføre time-lapse-billeddannelse for at identificere den koncentration, der minimerer embryoforvrængning og motilitet, og test derefter en finere række koncentrationer baseret på resultaterne. Det mest kritiske trin i denne protokol er at identificere den optimale koncentration af agarose for lag 1. Test forskellige nanokoncentrationer af agarose såsom 0,030%0,032% osv.for at finde den optimale koncentration. For at udføre time-lapse billeddannelse af embryoner, bruge et mikroskop fase med en kuvøse sat til 28,5 grader Celsius og billede i op til 55 timer. For samtidig billede flere embryoner, skal du bruge en fase adapter, der holder flere retter og rotere retterne én efter én, så embryonerne er vandret placeret.Vælg en lav forstørrelse målsætning, derefter finde embryoner ved hjælp af okularet og endelig justere dem vandret ved at dreje retterne. Skab embryos placering i softwaren og oprette et filnavn til automatisk gemme data. Indstil pinhole-størrelsen, scanningshastigheden, billedstørrelsen og zoom.Vælg derefter en højere forstørrelse til optagelse af billeder og de fluorescenskanaler, der skal afbildes. For hver kanal skal du justere lasereffekten og detektorens højspænding og sørge for at indsamle det bedst mulige dynamiske område, samtidig med at mætning og begrænsning af fotoblegning undgås. Dernæst for at afbilde hele fosteret med en 10X mål, skal du indstille de store billedoptagelse indstillinger i softwaren til billede flere synsfelter og sy dem sammen justere placeringen af fosteret for at sikre, at det passer inden for dette store billedområde.Konfigurer indstillingerne for hentning af Z-stakke i henhold til håndskriftsanvisningerne. For at bevare fokus for flere embryoner under langtidsscanning af tidsforskydninger skal du bruge et automatiseret fokus og justere de individuelle offsetniveauer for hvert embryon for at fokusere på referenceplanet. Konfigurer derefter time-lapse-parametre i mikroskopsoftwaren til afbildning i en varighed på 55 timer med en times mellemrum.Ved hver cyklus opfanger du to embryodatasæt fortløbende, og gem data automatisk. Brug mikroskopsoftwaren til at behandle billederne. Hvis der blev afbildet mere end ét embryon, skal du oprette uafhængige filer for hvert embryon ved at opdele datasættene baseret på billeddannelsens placering.Konverter 3D-tidsdatasættene til 2D-tidsdatasæt ved hjælp af maksimale intensitetsprojektioner eller et lignende værktøj. Endelig skal du oprette filmfiler ved at gemme som AVI og vælge indstillingen ingen komprimering med intervaller på 200 millisekunder for en afspilningshastighed på fem billeder pr. sekund. Denne lagdelte monteringsmetode gør det muligt at afbilde zebrafiskembryoner, samtidig med at de får mulighed for at vokse, men begrænser samtidig deres bevægelse.Hvis agarosekoncentrationen er for høj, bliver embryonerne forvrænget. Men hvis det er for lavt, vil de bevæge sig ud af synsfeltet under time-lapse mikroskopi. Den optimale agarosekoncentration viste sig at være mellem 0,028 og 0,034 %Levende transgene zebrafisk, der udtrykker RFP i hele embryoet og GFP i endotelcellerne i vaskulaturen, afbildet i 55 timer, hvor det intersegementale kar spirede, subintestinale og hovedvaskulære tarmkanal udviklede, og caudal vene plexus kondens med trunkudvidelse forevede.Embryoner, der udtrykker GFP og motoriske neuroner blev afbildet for at visualisere motor neuron udvikling. Motoren neuron axoner spire fra ventrale neurale rør over somitter mod ventrale side af fosteret. Den fælles udvikling af dorsal spiring af motor neuron axoner i forhold til placeringen af intersegmentale fartøjer blev afbildet ved hjælp af en højere forstørrelse.Dette gjorde det muligt at visualisere de finere detaljer af ventral axon spiring samt dorsale axon spiring fra neuralrøret. Som somite numre steg, somites også udvide i længde og bredde. Denne proces blev afbildet ved hjælp af transgene embryoner, der udtrykker GFP i musklerne.Da den optimale koncentration af agarose er meget snæver, er den meget følsom over for små variationer i målingerne, når der tilberedes en lageropløsning af agarose, og den skal omdefineres for hvert nyt parti af agaroseopløsning. Det er vigtigt omhyggeligt at indstille billeddannelse parametre, herunder billedstørrelse og opløsning, scanning hastighed, zoom, detektor høj spænding, og laser magt for at sikre overensstemmelse mellem eksperimenter og også for at reducere muligheden for foto toksicitet og foto blegning under lang sigt time-lapse billeddannelse. Ved hjælp af denne monteringsmetode for transgene zebrafiskembryoner efterfulgt af forlænget time-lapse-billeddannelse af hele organismen kan vi visualisere, hvordan forskellige væv udvikler sig sammen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Optagelse Tissue Repair i zebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Migration hjælp Cell transplantationer og Time-lapse Imaging i zebrafisk embryoner

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En neddykket Filter Paper Sandwich til Langsigtet<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging af Early Chick embryoner

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Et alsidigt Montering Metode til Long Term Imaging af zebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Encellede kvantificering af Protein nedbrydning satser for Time-Lapse Fluorescens mikroskopi i vedhængende cellekultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...