Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

We danken Albert pan en Arndt Sieakmann voor de geschenken van transgene vis. We danken Koichi Kawakami aan het National Institute of Genetics, het nationale Bioresource project van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan voor de gave van de transgene zebravis HGn39b. We bedanken ook Fatima Merchant en Kathleen Gajewski voor hulp bij confocale microscopie en Tracey Theriault voor foto's.
Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Environmental Health Sciences van de National Institutes of Health (subsidie nummer P30ES023512 en contractnummer HHSN273201500010C). SU werd gesteund door een Fellowship van het Keck Computational Cancer biologie Program (Gulf Coast consortia CPRIT Grant RP140113) en Hugh Roy en Lillie Endowment Fund. J-Å G werd gesteund door de Robert A. Welch Foundation (E-0004).

Het hier gepresenteerde dier werk werd goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités (IACUCs) van de Universiteit van Houston en de Universiteit van Indiana.
1. vishouderij
Opmerking: voor werken met gewervelde modellen is een door IACUC goedgekeurd protocol vereist. Het moet worden uitgevoerd volgens de relevante nationale en internationale richtlijnen.
<ol><li>Volwassen zebravis onderhouden zoals beschreven in eerder gepubliceerde literatuur...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Hier wordt een montagemethode beschreven voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's. De meest kritieke stap voor de montagemethode is het bepalen van de optimale concentratie van agarose die de embryo groei met onbeperkte zebravis mogelijk maakt en tegelijkertijd de embryo's in een volledig vaste positie voor confocale beeldvorming houdt. Omdat de optimale concentratie van agarose zeer smal is, is deze waarde zeer gevoelig voor de fouten in de meting van het gewicht van de agarose en ...

De zebravis is al lang een modelorganisme voor ontwikkelingsbiologie, en microscopie is de belangrijkste methode om embryonale ontwikkeling te visualiseren. De voordelen van het gebruik van zebravis embryo's voor ontwikkelingsstudies omvatten kleine afmetingen, optische helderheid, snelle ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid van de volwassen vis. De generatie van transgene zebravis lijnen die fluorescentie in bepaalde weefsels of cellen uitdrukken, heeft een directe visualisatie van weefsel ontwikkeling mogelijk op een manier die niet met grotere gewervelde dieren kan worden veroorzaakt. In combinatie met timelapse-microscopie kunnen Details en dynamiek van de weefsel ontwikkeling gemakkelijk worden bestudeerd.
Een probleem met de ontwikkeling van de zebravis is dat de embryo's in de lengte aanzienlijk toenemen; het embryo breidt zijn lengte vier maal uit binnen de eerste 3 dagen van leven1. Ook is het lichaam van het vroege embryo zacht en wordt het gemakkelijk vervormd als de groei beperkt is. Maar om confocale microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Om embryo's in een vaste positie te houden voor confocale timelapse-beeldvorming, worden ze regelmatig verdoiliseerd en gemonteerd in 0,3-1% laag smelt agarose. Dit heeft het voordeel dat er gedurende een bepaalde periode enige groei mogelijk is tijdens de beeldvorming, terwijl de bewegingen van het embryo worden beperkt. Delen van het embryo kunnen zo efficiënt als deze worden afgebeeld. Bij het gebruik van deze methode voor de beeldvorming van het hele embryo gedurende langere perioden worden echter verstoringen waargenomen vanwege de beperkte groei die door de agarose wordt veroorzaakt. Er zijn dus andere montage methodes nodig. Kaufmann en collega's hebben een alternatieve montage van zebravis-embryo's voor lichte blad microscopie beschreven, zoals selectieve vlak verlichtings microscopie (spim), door de embryo's te monteren in buisjes met gefluoreerde ethyleen propyleen (FEP) die lage concentraties agarose of Hydroxypropyl methylcellulose2bevatten. Deze techniek produceert in de loop van de tijd een uitmuntende visualisatie van embryogenese. Schmid et al. Beschrijf de montage van maximaal zes embryo's in agarose in VBO-buisjes voor lichte microscopie3 die verschillende embryo's visualiseren in één beeldvormings sessie. Mallen zijn gebruikt om embryo arrays te maken voor een efficiënte montage van grotere aantallen embryo's4. Masselkink et al. hebben 3D-gedrukte kunststof mallen gebouwd die kunnen worden gebruikt om silicium te maken dat zebravis-embryo's in verschillende stadia kunnen worden geplaatst, waardoor montage in een constante positie voorbeeld vorming mogelijk wordt, inclusief confocale Imaging5. 3D-printen is ook gebruikt om mallen te maken voor een consistente positionering van zebravis embryo's in 96-well format6. Sommige mallen zijn aangepast voor bepaalde stadia en kunnen geen onbeperkte groei voor lange perioden toestaan, terwijl andere mallen flexibeler zijn. Onlangs publiceerde Weijts et al. het ontwerp en de fabricage van een vier-waterput voor Live beeldvorming van zebravis embryo's7. In dit gerecht worden de staart en romp van verdoven vissen embryo's handmatig geplaatst onder een duidelijk silicone dak bevestigd net boven een afdekglas om een zak te vormen. Het embryo wordt vervolgens in deze positie vastgesteld door toevoeging van 0,4% agarose. Deze montage zorgt voor de beeldvorming van het ongeveer 2 mm lange posterieure deel (romp en staart) van het embryo, en aangezien tot 12 embryo's per put kunnen worden gemonteerd, maakt de methode het mogelijk om meerdere monsters te maken. Op dezelfde manier presenteerden Hirsinger en Steventon onlangs een methode waarbij het hoofd van de vis wordt gemonteerd in agarose, terwijl de staart vrij kan groeien, en deze methode vergemakkelijkt ook de beeldvorming van het stam-en staart gebied van het embryo8.
Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis embryo's die de bewegingen van de embryo's beperken en tegelijkertijd onbeperkte groei mogelijk maken. De voordelen van deze montagemethode zijn dat het een goedkope, snelle en eenvoudige methode is om embryo's van verschillende stadia te monteren voorbeeld vorming met behulp van een omgekeerde Microscoop. De montage maakt lange-termijn beeldvorming van het hele lichaam (hoofd, romp en staart) tijdens de ontwikkeling van de embryo. Om de bruikbaarheid van deze methode te demonstreren, werd whole embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling afgebeeld in transgene vis. Twee embryo's per sessie, met twee golflengten in 3D, werden door time-lapse microscopie voor 55 opeenvolgende uren afgebeeld om films van weefsel ontwikkeling te renderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

De dynamiek van de ontwikkeling kan gevolgd worden door een confocale time-lapse microscopie van levende transgene zebravis embryo's die fluorescentie uitdrukken in specifieke weefsels of cellen. Een probleem bij het opstellen van een hele embryo ontwikkeling is dat zebravis embryo's aanzienlijk groeien. Bij montage zoals regelmatig gedaan bij 0,3-1% laag smelt agarose, legt de agarose groei beperking op, wat leidt tot verstoringen in het zachte embryo lichaam. Maar om confocale timelapse-microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis-embryo's die de beweeglijkheid van de embryo's beperken en tegelijkertijd de onbeperkte groei mogelijk maken. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties. Om te demonstreren de bruikbaarheid van deze methode, hele embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling werd afgebeeld in transgene vis voor 55 opeenvolgende uren. Deze montagemethode kan worden gebruikt voor eenvoudige, laaggeprijsde beeldvorming van hele zebravis embryo's met omgekeerde microscopen zonder eisen van mallen of speciale apparatuur.

Ontwikkeling van de montagemethode Het belangrijkste doel van dit werk was het ontwikkelen van een goedkope montagetechniek voor de timelapse-beeldvorming van zebravis ontwikkeling voor langere tijd. De gelaagde montagemethode is ontwikkeld om het fragiele zebravis-embryo lichaam volledig te laten groeien en tegelijkertijd zijn bewegingen te beperken. Als de agarose-concentratie van laag 1 te hoog is, worden de embryo's vervormd en gebogen (Figuur 2). Embryo's geteeld op ...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

We hebben een montagemethode ontwikkeld voor time-lapse beeldvorming die onbeperkte groei van fragiele zebravisembryo's mogelijk maakt en tegelijkertijd in een volledig vaste positie houdt. Deze montagemethode is snel, eenvoudig en goedkoop en werkt voor lab imaging op elke omgekeerde microscoop. We ontwikkelden deze methode voor beeldvorming van levende zebravisembryo's, maar het kan worden aangepast voor beeldvorming van andere kleine aquatische diermodellen.Begin met het fokken van de volwassen zebravis. Plaats 's middags de vis in kweektanks bij een man-op-vrouw verhouding van één-op-twee. Bereid vervolgens een voorraadoplossing van 1% laag smelt in embryomedia en los deze op door het te verwarmen in een magnetron.Aliquot de agarose oplossing in 1,5 milliliter buizen. Maak een voorraad oplossing van 4%tricaine in gedestilleerd water en bewaar de agarose en tricaine op vier graden Celsius. Tricaïne is giftig en moet worden gewogen en bereid in een rookkap.Na de paring, oogst de zebravis embryo's in E3 in een petrischaaltje en broed ze op 26,5 graden Celsius gedurende ongeveer 28 uur voor de montage. Verdoven de embryo's met 0,02%tricaine en dechorionate ze onder een microscoop door zachtjes aangrijpen en trekken van de chorion uit elkaar om het embryo vrij te geven. Net voor montage verwarm je de agarose-oplossing tot 65 graden Celsius en laat het afkoelen tot ongeveer 30 graden Celsius, zodat het embryo niet wordt beschadigd door de hitte en tricaïne toe te voegen aan de agarose-oplossing.Gebruik 35 millimeter glazen bodemschotels met een nummer nul coverglass bodem. Plaats voorzichtig een gedechorioneerde embryo met een van de zijkanten naar de onderkant van de schotel met een glazen pipet of een micropipet, verwijder dan voorzichtig de resterende E3 met een micropipet. Voeg de eerste agarose oplossing aan de kleine goed gemaakt door de coverglass bevestigd aan de onderkant van de schotel om het embryo te dekken ervoor te zorgen dat de agarose de kleine put bedekt, maar niet overloopt.Bedek de kleine put met een coverglass om een smalle agarose gevulde ruimte met het embryo tussen de twee coverglasses te creëren. Plaats een laag van 1%agarose oplossing op de top van de coverglass over de bodem van de schotel die de coverglass op zijn plaats zal houden als het stolt. Vul vervolgens het resterende gedeelte van de schotel met E3 met 0,02% tricaine om het systeem gehydrateerd te houden.Om de optimale agaroseconcentratie voor laag één te identificeren, monteer je de embryo's in toenemende concentraties van agarose en voer time-lapse beeldvorming uit om de concentratie te identificeren die embryovervorming en beweeglijkheid minimaliseert, test dan een fijner concentratiebereik op basis van de resultaten. De meest kritieke stap van dit protocol is het identificeren van de optimale concentratie van agarose voor laag één. Test verschillende nanoconcentraties van agarose zoals 0,030%0,032%, enz.om de optimale concentratie te vinden. Gebruik een microscoopstadium met een couveuse van 28,5 graden Celsius en beeld voor maximaal 55 uur om timelape-beeldvorming van de embryo's uit te voeren. Om tegelijkertijd verschillende embryo's in beeld te brengen, gebruikt u een podiumadapter die meerdere gerechten bevat en draai de gerechten één voor één zodat de embryo's horizontaal worden geplaatst.Selecteer een lage vergrotingsdoelstelling, lokaliseer vervolgens de embryo's met behulp van het oculair en lijn ze uiteindelijk horizontaal uit door de gerechten te draaien. Nota van de locatie van de embryo's in de software en maak een bestandsnaam voor het automatisch afvleven van de gegevens. Stel de pinholegrootte, scansnelheid, afbeeldingsgrootte en zoom in.Selecteer vervolgens een hogere vergroting voor het vastleggen van beelden en de fluorescentiekanalen die moeten worden weergegeven. Pas voor elk kanaal het laservermogen en de hoogspanning van de detector aan om het best mogelijke dynamische bereik te verzamelen, terwijl verzadiging wordt vermeden en het bleken van foto's wordt beperkt. Vervolgens, om het hele embryo met een 10X-doelstelling in beeld te geven, stel de grote instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen in de software in om verschillende gezichtsvelden in beeld te krijgen en ze samen te naaien en de positie van het embryo aan te passen om er zeker van te zijn dat het binnen dit grote beeldgebied past.Configureer de instellingen voor het vastleggen van Z-stacks op basis van de routebeschrijving van het manuscript. Om de focus van meerdere embryo's te behouden tijdens lange termijn time-lapse imaging, gebruik maken van een geautomatiseerde focus en aanpassen van de individuele offset niveaus voor elk embryo om zich te concentreren op het referentievlak. Stel vervolgens time-lapse parameters in de microscoopsoftware in op beeld voor een duur van 55 uur met intervallen van een uur.Leg bij elke cyclus twee embryodatasets achtereenvolgens vast en sla gegevens automatisch op. Gebruik de microscoopsoftware om de beelden te verwerken. Als er meer dan één embryo is afgebeeld, maakt u onafhankelijke bestanden voor elk embryo door de gegevenssets te splitsen op basis van de locatie van de beeldvorming.Converteer de 3D-tijdgegevenssets in 2D-tijdgegevenssets met behulp van projecties met maximale intensiteit of een vergelijkbaar gereedschap. Maak ten slotte filmbestanden door op te slaan als AVI en de optie geen compressie te selecteren met intervallen van 200 milliseconden voor een afspeelsnelheid van vijf frames per seconde. Deze gelaagde montagemethode maakt het mogelijk om zebravisembryo's in beeld te brengen terwijl ze kunnen groeien, maar tegelijkertijd hun beweging beperken.Als de agaroseconcentratie te hoog is, worden de embryo's vervormd. Maar als het te laag is, zullen ze uit het gezichtsveld tijdens time-lapse microscopie. De optimale agaroseconcentratie bleek tussen 0,028 en 0,034% te liggen Levende transgene zebravissen die RFP uitdrukken in het gehele embryo en GFP in de endotheelcellen van de vasculatuur gedurende 55 uur werden afgebeeld waarin het intersegementale vat ontkiemde, sub-darm- en hoofdvaatculatuur ontwikkelde, en caudale adervlechtenamencondensatie met de romp van de verlengde romp plaatsvonden.Embryo's die GFP en motorneuronen uitdrukken werden afgebeeld om de ontwikkeling van motorneuronen te visualiseren. De motorneuron axonen ontspruiten uit de ventrale neurale buis over de somites naar de ventrale kant van het embryo. De co-ontwikkeling van de dorsale ontkieking van motorneuron axonen in relatie tot de positie van intersegmentale vaten werd afgebeeld met behulp van een hogere vergroting.Dit maakte het mogelijk om de fijnere details van ventrale axon ontkiemen evenals dorsale axon ontspruiten uit de neurale buis te visualiseren. Naarmate de somietaantallen toenam, breiden de somites zich ook in lengte en breedte uit. Dit proces werd afgebeeld met behulp van transgene embryo's uitdrukken GFP in de spieren.Omdat de optimale concentratie van agarose zeer smal is, is het zeer gevoelig voor kleine variaties in metingen bij het voorbereiden van de voorraadoplossing van agarose en moet deze opnieuw worden gedefinieerd voor elke nieuwe batch agarose-oplossing. Het is belangrijk om de beeldvormingsparameters zorgvuldig in te stellen, waaronder beeldgrootte en resolutie, scansnelheid, zoom, detectorhoogspanning en laservermogen om consistentie tussen experimenten te garanderen en ook om de mogelijkheid van fototoxiciteit en fotobleken tijdens lange termijn time-lapse imaging te verminderen. Met behulp van deze montagemethode voor transgene zebravisembryo's, gevolgd door uitgebreide time-lapse beeldvorming van het hele organisme, kunnen we visualiseren hoe verschillende weefsels zich samen ontwikkelen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo&#39;s

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo&#39;s

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...