Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Nous remercions Albert Pan et Arndt Sieakmann pour les dons de poissons transgéniques. Nous remercions Koichi Kawakami à l'Institut national de génétique, le projet national bioresource du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon pour le don du poisson zèbre transgénique HGn39b. Nous remercions également Fatima Merchant et Kathleen Gajewski pour leur aide en microscopie confocale, et Tracey Thériault pour ses photographies.
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national des sciences de la santé environnementale des National Institutes of Health (numéro de subvention P30ES023512 et numéro de contrat HHSN27320150010C). SU a reçu l'appui d'une bourse du programme de biologie du cancer computationnelle Keck (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) et du Hugh Roy and Lillie Endowment Fund. La Fondation Robert A. Welch (E-0004) a soutenu la Fondation Robert A. Welch.

Le travail animalier présenté ici a été approuvé par les Comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux (CCIA) de l'Université de Houston et de l'Université de l'Indiana.
1. Élevage de poissons
REMARQUE : Le travail avec des modèles de vertébrés nécessite un protocole approuvé par l'IACUC. Elle doit être menée conformément aux directives nationales et internationales pertinentes.
<ol><li>Maintenir le poisson zèbre adulte tel que d?...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Une méthode de montage pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre est décrite ici. L'étape la plus critique pour la méthode de montage est d'identifier la concentration optimale d'agarose qui permettra une croissance sans restriction des embryons de poisson zèbre, et en même temps de garder les embryons dans une position complètement fixe pour l'imagerie confocale. Parce que la concentration optimale d'agarose est très étroite, cette valeur est très sensible au...

Le poisson zèbre a longtemps été un organisme modèle pour la biologie du développement, et la microscopie est la principale méthode pour visualiser le développement embryonnaire. Les avantages de l'utilisation d'embryons de poisson zèbre pour les études de développement comprennent la petite taille, la clarté optique, le développement rapide et la fécondité élevée des poissons adultes. La génération de lignées transgéniques de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans certains tissus ou cellules a permis une visualisation directe du développement des tissus d'une manière qui n'est pas possible avec les plus grands vertébrés. En combinaison avec la microscopie time-lapse, les détails et la dynamique du développement des tissus peuvent être facilement étudiés.
Une difficulté avec le développement de poisson zèbre d'imagerie est que les embryons se développent sensiblement dans la longueur ; l'embryon étend sa longueur quatre fois dans les 3 premiers jours de la vie1. En outre, le corps de l'embryon précoce est mou, et devient facilement déformé si la croissance est limitée. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale, l'embryon doit être immobilisé. Pour maintenir les embryons dans une position fixe pour l'imagerie confocale en accéléré, ils sont régulièrement anesthésiés et montés en agarose à faible fonte de 0,3 à 1 %. Cela a l'avantage de permettre une certaine croissance pendant l'imagerie pendant une certaine période de temps, tout en limitant les mouvements de l'embryon. Certaines parties de l'embryon peuvent être efficacement représentées comme ceci. Cependant, lors de l'utilisation de cette méthode pour l'imagerie de l'embryon entier pendant de longues périodes de temps, des distorsions sont observées en raison de la croissance restreinte causée par l'agarose. Ainsi, d'autres méthodes de montage sont nécessaires. Kaufmann et ses collègues ont décrit un montage alternatif d'embryons de poisson zèbre pour la microscopie par feuille de lumière, comme la microscopie sélective d'éclairage d'avion (SPIM), en montant les embryons dans des tubes de propylène d'éthylène fluoré (FEP) contenant de faibles concentrations d'agarose ou de méthylcellulose2. Cette technique produit une superbe visualisation de l'embryogenèse au fil du temps. Schmid et coll. décrivent le montage de jusqu'à six embryons dans l'agarose dans les tubes FEB pour la microscopie de feuille de lumière3 fournissant la visualisation de plusieurs embryons dans une session d'imagerie. Les moules ont été utilisées pour créer des tableaux d'embryons pour le montage efficace d'un plus grand nombre d'embryons4. Masselkink et coll. ont construit des moules en plastique imprimés en 3D qui peuvent être utilisés pour fabriquer des moulages de silicium dans lequel les embryons de poissons zèbres à différents stades peuvent être placés, permettant le montage dans une position constante pour l'imagerie, y compris l'imagerie confocale5. L'impression 3D a également été utilisée pour fabriquer des moules pour un positionnement cohérent des embryons de poissons zèbres dans le format6de 96 puits. Certains moules sont personnalisés pour certaines étapes et peuvent ne pas permettre une croissance illimitée pendant de longues périodes, tandis que d'autres moules sont plus flexibles. Récemment, Weijts et coll. ont publié la conception et la fabrication d'un plat à quatre puits pour l'imagerie en direct des embryons de poissons zèbres7. Dans ce plat, la queue et le tronc des embryons de poissons anesthésiés sont placés manuellement sous un toit en silicone transparent fixé juste au-dessus d'un verre de couverture pour former une poche. L'embryon est alors fixé dans cette position par l'ajout de 0,4% agarose. Ce montage permet l'imagerie de la partie postérieure d'environ 2 mm de long (tronc et queue) de l'embryon, et comme jusqu'à 12 embryons peuvent être montés par puits, la méthode permet l'imagerie de plusieurs échantillons. De même, Hirsinger et Steventon ont récemment présenté une méthode où la tête du poisson est montée en agarose, tandis que la queue peut se développer librement, et cette méthode facilite également efficacement l'imagerie de la région du tronc et de la queue de l'embryon8.
Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui restreignent les mouvements des embryons tout en permettant une croissance illimitée. Les avantages de cette méthode de montage sont qu'il s'agit d'une méthode peu coûteuse, rapide et facile pour monter des embryons de différentes étapes pour l'imagerie à l'aide de n'importe quel microscope inversé. Le montage permet l'imagerie à long terme de l'ensemble du corps (tête, tronc et queue) pendant le développement de l'embryon. Pour mettre en valeur la convivialité de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire de l'embryon entier a été représenté chez des poissons transgéniques. Deux embryons par session, à deux longueurs d'onde en 3D ont été photographiés par microscopie en time-lapse pendant 55 heures consécutives pour rendre des films de développement de tissu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

La dynamique du développement peut être suivie d'une microscopie confocale en accéléré d'embryons transgéniques vivants de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans des tissus ou des cellules spécifiques. Une difficulté avec le développement entier d'embryon d'imagerie est que les embryons de poisson zèbre se développent sensiblement dans la longueur. Lorsqu'elle est montée comme régulièrement fait dans 0.3-1% agarose basse de fonte, l'agarose impose la restriction de croissance, menant aux distorsions dans le corps mou d'embryon. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale en time-lapse, l'embryon doit être immobilisé. Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui limitent la motilité des embryons tout en permettant la croissance sans restriction. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations. Pour démontrer la facilité d'utilisation de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire d'embryon entier a été imaged dans les poissons transgéniques pendant 55 heures consécutives. Cette méthode de montage peut être utilisée pour l'imagerie facile et peu coûteuse d'embryons entiers de poisson zèbre à l'aide de microscopes inversés sans exigences de moules ou d'équipement spécial.

Développement de la méthode de montage L'objectif principal de ce travail était de développer une technique de montage à faible coût pour l'imagerie en accéléré du développement du poisson zèbre pendant de longues périodes de temps. La méthode de montage en couches a été développée pour permettre la pleine croissance du corps fragile d'embryons de poisson zèbre, tout en limitant ses mouvements. Si la concentration d'agarose de la couche 1 est trop élevée, les embryons seront défor...

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A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.

Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Nous avons mis au point une méthode de montage pour l’imagerie en accéléré qui permet la croissance sans restriction des embryons fragiles de poisson zèbre et en même temps les maintient dans une position complètement fixe. Cette méthode de montage est rapide, facile et bon marché et il fonctionne pour l’imagerie de laboratoire sur n’importe quel microscope inversé. Nous avons mis au point cette méthode d’imagerie d’embryons vivants de poissons zèbres, mais elle pourrait être modifiée pour l’imagerie d’autres petits modèles d’animaux aquatiques.Commencez par élever le poisson zèbre adulte. Dans l’après-midi, placer le poisson dans des cuves de reproduction à un rapport homme-femelle de un à deux. Préparez ensuite une solution de bouillon de 1% d’agarose de fonte faible dans les médias embryonnaires et dissolvez-la en la chauffant dans un four à micro-ondes.Aliquot la solution agarose en tubes de 1,5 millilitre. Faire une solution de stock de 4% tricaine dans l’eau distillée et stocker l’agarose et la tricaine à quatre degrés Celsius. Tricaine est toxique et doit être pesé et préparé dans un capot de fumée.Après l’accouplement, récolter les embryons de poisson zèbre à l’E3 dans une boîte de Pétri et les incuber à 26,5 degrés Celsius pendant environ 28 heures avant de monter. Anesthésier les embryons avec 0,02% de tricaine et les déchorionner au microscope en saisissant doucement et en tirant la chorion à part pour libérer l’embryon. Juste avant le montage, chauffer la solution agarose à 65 degrés Celsius, puis laisser refroidir à environ 30 degrés Celsius afin que l’embryon ne soit pas blessé par la chaleur et ajouter de la tricaine à la solution agarose.Utilisez des plats de fond en verre de 35 millimètres avec un fond de couverture numéro zéro. Placez délicatement un embryon déchorionné avec l’un de ses côtés latéraux vers le fond du plat avec une pipette en verre ou une micropipette, puis retirez soigneusement tout E3 restant avec une micropipette. Ajouter la première solution d’agarose au petit puits créé par la couverture fixée au fond du plat pour couvrir l’embryon en s’assurant que l’agarose recouvre le petit puits mais ne le déborde pas.Couvrir le petit puits d’un verre de couverture pour créer un espace étroit rempli d’agarose avec l’embryon entre les deux lunettes de couverture. Placez une couche de solution agarose de 1% sur le dessus de la couverture partout dans le fond du plat qui gardera le verre de couverture en place pendant qu’il solidifie. Remplissez ensuite la partie restante du plat d’E3 contenant 0,02 % de tricaine pour garder le système hydraté.Pour identifier la concentration optimale d’agarose pour la première couche, monter les embryons dans des concentrations croissantes d’agarose et effectuer une imagerie en accéléré pour identifier la concentration qui minimise la distorsion et la motilité de l’embryon, puis tester une gamme plus fine de concentrations basées sur les résultats. L’étape la plus critique de ce protocole est d’identifier la concentration optimale d’agarose pour la première couche. Testez différentes nano concentrations d’agarose telles que 0,030%0,032%, etc.pour trouver la concentration optimale. Pour effectuer l’imagerie en accéléré des embryons, utilisez une étape de microscope avec un incubateur réglé à 28,5 degrés Celsius et une image jusqu’à 55 heures. Pour imager simultanément plusieurs embryons, utilisez un adaptateur de scène qui contient plusieurs plats et faites pivoter les plats un par un afin que les embryons soient placés horizontalement.Sélectionnez un objectif de grossissement faible, puis localisez les embryons à l’aide de l’oculaire et alignez-les finalement horizontalement en faisant pivoter la vaisselle. Enregistrez l’emplacement des embryons dans le logiciel et créez un nom de fichier pour l’autoavage des données. Réglez la taille du sténopé, la vitesse de balayage, la taille de l’image et le zoom.Sélectionnez ensuite un grossissement plus élevé pour capturer des images et les canaux de fluorescence à imager. Pour chaque canal, ajustez la puissance laser et la haute tension du détecteur en vous assurant de collecter la meilleure plage dynamique possible tout en évitant la saturation et en limitant le blanchiment des photos. Ensuite, pour visualiser l’embryon entier avec un objectif de 10X, définissez les paramètres de capture d’image grande dans le logiciel pour l’image de plusieurs champs de vision et de les assembler en ajustant la position de l’embryon pour s’assurer qu’il s’inscrit dans cette grande zone d’image.Configurez les paramètres pour capturer les piles Z selon les instructions manuscrites. Afin de maintenir la concentration de plusieurs embryons pendant l’imagerie à long terme, utilisez une mise au point automatisée et ajustez les niveaux de décalage individuels pour chaque embryon pour qu’il se concentre sur le plan de référence. Ensuite, configurez des paramètres time-lapse dans le logiciel microscope pour l’image pour une durée de 55 heures à intervalles d’une heure.À chaque cycle, capturez deux ensembles de données sur l’embryon séquentiellement et enregistrez automatiquement les données. Utilisez le logiciel microscope pour traiter les images. Si plus d’un embryon a été photographié, créez des fichiers indépendants pour chaque embryon en divisant les ensembles de données en fonction de l’emplacement de l’imagerie.Convertissez les ensembles de données de temps 3D en ensembles de données de temps 2D à l’aide de projections d’intensité maximale ou d’un outil similaire. Enfin, créez des fichiers de film en économisant en tant qu’AVI et en sélectionnant l’option sans compression avec des intervalles de 200 millisecondes pour une vitesse de lecture de cinq images par seconde. Cette méthode de montage en couches permet d’imager les embryons de poisson zèbre tout en leur permettant de croître tout en limitant leur mouvement.Si la concentration d’agarose est trop élevée, les embryons deviennent déformés. Mais s’il est trop bas, ils sortiront du champ de vision pendant la microscopie time-lapse. La concentration optimale d’agarose s’est trouvée entre 0.028 et 0.034%Poisson zèbre transgénique vivant exprimant RFP dans l’embryon entier et GFP dans les cellules endothéliales de la vasculature ont été imaged pendant 55 heures pendant lesquelles le vaisseau intersegemental a germé, vasculature subintestinal et tête s’est développée, et condensation caudale de plexus de veine avec l’extension de tronc s’est produite.Des embryons exprimant GFP et neurones moteurs ont été photographiés pour visualiser le développement de neurones moteurs. Les axones du neurone moteur poussent du tube neural ventral sur les somites vers le côté ventral de l’embryon. Le co-développement de la germination dorsale des axones des neurones moteurs par rapport à la position des vaisseaux intersegmentaux a été photographié à l’aide d’un grossissement plus élevé.Cela a permis de visualiser les détails les plus fins de la germination ventrale de l’axon ainsi que la germination dorsale de l’axon à partir du tube neural. Au fur et à mesure que le nombre de somites augmentait, les somites s’étendent également en longueur et en largeur. Ce processus a été photographié à l’aide d’embryons transgéniques exprimant GFP dans les muscles.Parce que la concentration optimale de l’agarose est très étroite, il est très sensible aux petites variations dans les mesures lors de la préparation de la solution de stock de l’agarose et il doit être redéfini pour chaque nouveau lot de solution d’agarose. Il est important de définir soigneusement les paramètres d’imagerie, y compris la taille et la résolution de l’image, la vitesse de balayage, le zoom, la haute tension du détecteur et la puissance laser afin d’assurer la cohérence entre les expériences et aussi de réduire la possibilité de toxicité photo et de blanchiment de photos pendant l’imagerie à long terme. En utilisant cette méthode de montage pour les embryons transgéniques de poisson zèbre suivie d’une imagerie prolongée en accéléré de l’organisme tout entier, nous pouvons visualiser comment différents tissus se développent ensemble.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

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Recherche

Biologie du développement

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en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

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