Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Wir danken Albert Pan und Arndt Sieakmann für die Geschenke von transgenen Fischen. Wir danken Koichi Kawakami vom National Institute of Genetics, dem National BioResource Project des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Japans für die Gabe des transgenen Zebrafisches HGn39b. Wir danken auch Fatima Merchant und Kathleen Gajewski für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Tracey Theriault für Fotos.
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Environmental Health Sciences der National Institutes of Health (Grant-Nummer P30ES023512 und Vertragsnummer HHSN273201500010C) unterstützt. SU wurde durch ein Stipendium des Keck Computational Cancer Biology Programms (Gulf Coast Consortia CPRIT Grant RP140113) und von Hugh Roy und Lillie Endowment Fund unterstützt. Unterstützt wurde er von der Robert A. Welch Foundation (E-0004).

Die hier vorgestellte Tierarbeit wurde von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) der University of Houston und der Indiana University genehmigt.
1. Fischzucht
HINWEIS: Die Arbeit mit Wirbeltiermodellen erfordert ein von der IACUC zugelassenes Protokoll. Sie sollte nach den einschlägigen nationalen und internationalen Leitlinien durchgeführt werden.
<ol><li>Pflegen Sie erwachsene Zebrafische, wie in der zuvor veröffentlichten Literatur<sup cl...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Hier wird ein Montageverfahren zur erweiterten zeitraffenenkonfokalen Mikroskopie ganzer Zebrafischembryonen beschrieben. Der wichtigste Schritt für die Montagemethode besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose zu identifizieren, die ein uneingeschränktes Wachstum von Zebrafischembryonen ermöglicht und gleichzeitig die Embryonen in einer vollständig fixierten Position für die konfokale Bildgebung hält. Da die optimale Konzentration von Agarose sehr gering ist, ist dieser Wert sehr empfindlich auf die Feh...

Der Zebrafisch ist seit langem ein Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie, und die Mikroskopie ist die wichtigste Methode, um die embryonale Entwicklung zu visualisieren. Die Vorteile der Verwendung von Zebrafischembryonen für Entwicklungsstudien sind geringe Größe, optische Klarheit, schnelle Entwicklung und hohe Fruchtbarkeit der erwachsenen Fische. Die Erzeugung transgener Zebrafischlinien, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen exdrücken, hat eine direkte Visualisierung der Gewebeentwicklung auf eine Weise ermöglicht, die bei größeren Wirbeltieren nicht möglich ist. In Kombination mit der Zeitraffermikroskopie lassen sich Details und Dynamiken der Gewebeentwicklung leicht untersuchen.
Ein Problem bei der Bildgebung der Zebrafischentwicklung ist, dass die Embryonen erheblich in der Länge wachsen; der Embryo verlängert seine Länge viermal innerhalb der ersten 3 Tage des Lebens1. Auch der Körper des frühen Embryos ist weich und wird leicht verzerrt, wenn das Wachstum eingeschränkt wird. Doch um eine konfokale Mikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Um Embryonen in einer festen Position für konfokale Zeitraffer-Bildgebung zu halten, werden sie regelmäßig beäscht und in 0,3-1% niedrigschmelzender Agarose montiert. Dies hat den Vorteil, dass während der Bildgebung für einen bestimmten Zeitraum ein gewisses Wachstum ermöglicht wird, während gleichzeitig die Bewegungen des Embryos eingeschränkt werden. Teile des Embryos können effizient so abgebildet werden. Bei der Verwendung dieser Methode zur Bildgebung des gesamten Embryos über einen längeren Zeitraum werden jedoch Verzerrungen aufgrund des durch die Agarose verursachten eingeschränkten Wachstums beobachtet. Daher sind weitere Montagemethoden erforderlich. Kaufmann und Kollegen haben eine alternative Montage von Zebrafischembryonen für die Lichtbogenmikroskopie beschrieben, wie z.B. die selektive Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM), indem die Embryonen in fluorierten Ethylenpropylen (FEP)-Röhren montiert werden, die geringe Konzentrationen von Agarose oder Methylcellulose2enthalten. Diese Technik erzeugt eine hervorragende Visualisierung der Embryogenese im Laufe der Zeit. Schmid et al. beschreiben die Montage von bis zu sechs Embryonen in Agarose in FEB-Röhren für die Lichtbogenmikroskopie3, die die Visualisierung mehrerer Embryonen in einer Bildgebungssitzung ermöglicht. Formen wurden verwendet, um Embryo-Arrays für die effiziente Montage einer größeren Anzahl von Embryonen zu erstellen4. Masselkink et al. haben 3D-gedruckte Kunststoffformen konstruiert, die verwendet werden können, um Siliziumgüsse herzustellen, in denen Zebrafischembryonen in verschiedenen Stadien platziert werden können, was die Montage in einer konstanten Position für die Bildgebung ermöglicht, einschließlich konfokaler Bildgebung5. 3D-Druck wurde auch verwendet, um Formen für die konsistente Positionierung von Zebrafisch-Embryonen im 96-Well-Format6zu machen. Einige Formen sind für bestimmte Stufen angepasst und erlauben möglicherweise nicht uneingeschränktes Wachstum für längere Zeiträume, während andere Formen flexibler sind. Vor kurzem veröffentlichten Weijts et al. das Design und die Herstellung einer Vier-Brunnen-Schale für die Live-Bildgebung von Zebrafisch-Embryonen7. In dieser Schale werden Schwanz und Rumpf von anästhesierten Fischembryonen manuell unter einem klaren Silikondach platziert, das knapp über einem Deckglas befestigt ist, um eine Tasche zu bilden. Der Embryo wird dann in dieser Position durch die Zugabe von 0,4% Agarose fixiert. Diese Montage ermöglicht die Abbildung des etwa 2 mm langen hinteren Teils (Stamm und Schwanz) des Embryos, und da bis zu 12 Embryonen pro Bohrgut montiert werden können, ermöglicht das Verfahren die Abbildung mehrerer Proben. In ähnlicher Weise präsentierten Hirsinger und Steventon vor kurzem eine Methode, bei der der Kopf des Fisches in Agarose montiert ist, während der Schwanz frei wachsen kann, und diese Methode erleichtert auch effizient die Bildgebung des Rumpf- und Schwanzbereichs desEmbryos 8.
Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Bewegungen der Embryonen einschränken und gleichzeitig ein uneingeschränktes Wachstum ermöglichen. Die Vorteile dieser Montagemethode sind, dass es sich um eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode zur Montage von Embryonen verschiedener Stadien für die Bildgebung mit jedem invertierten Mikroskop handelt. Die Montage ermöglicht eine langzeitige Bildgebung des ganzen Körpers (Kopf, Rumpf und Schwanz) während der Embryoentwicklung. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu zeigen, wurde die entwicklung von ganzen Embryonastagen, Neuronalen und Muskeln in transgenen Fischen dargestellt. Zwei Embryonen pro Sitzung, bei zwei Wellenlängen in 3D, wurden durch Zeitraffermikroskopie für 55 aufeinander folgende Stunden abgebildet, um Filme der Gewebeentwicklung zu rendern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

Auf die Entwicklungsdynamik kann eine konfokale Zeitraffermikroskopie lebender transgener Zebrafischembryonen folgen, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen ausdrücken. Ein Problem bei der Bildgebung der entwicklung ganzer Embryonen ist, dass Zebrafischembryonen erheblich in der Länge wachsen. Bei regelmäßiger Montage in 0,3-1% niedriger Schmelzagarose erzwingt die Agarose Wachstumseinschränkungen, was zu Verzerrungen im weichen Embryokörper führt. Doch um eine konfokale Zeitraffermikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Beweglichkeit der Embryonen einschränken und gleichzeitig das uneingeschränkte Wachstum ermöglichen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde die entwicklung von ganzen Embryonen, Neuronalen und Muskeln 55 Stunden lang in transgenen Fischen abgebildet. Dieses Montageverfahren kann zur einfachen, kostengünstigen Abbildung ganzer Zebrafischembryonen mit invertierten Mikroskopen ohne Anforderungen an Formen oder spezielle Ausrüstung eingesetzt werden.

Entwicklung des Montageverfahrens Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer kostengünstigen Montagetechnik für die Zeitraffer-Bildgebung der Zebrafischentwicklung über einen längeren Zeitraum. Die geschichtete Montagemethode wurde entwickelt, um das volle Wachstum des zerbrechlichen Zebrafisch-Embryokörpers zu ermöglichen und gleichzeitig seine Bewegungen einzuschränken. Wenn die Agarosekonzentration der Schicht 1 zu hoch ist, werden die Embryonen verzerrt und gekrümmt (<strong cla...

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A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Wir haben eine Montagemethode für die Zeitraffer-Bildgebung entwickelt, die ein uneingeschränktes Wachstum empfindlicher Zebrafischembryonen ermöglicht und sie gleichzeitig in einer völlig festen Position hält. Diese Montagemethode ist schnell, einfach und kostengünstig und funktioniert für die Labor-Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop. Wir haben diese Methode zur Abbildung lebender Zebrafischembryonen entwickelt, aber sie könnte für die Abbildung anderer kleiner Aquatiermodelle modifiziert werden.Beginnen Sie mit der Zucht der erwachsenen Zebrafische. Am Nachmittag legen Sie die Fische in Zuchtbecken mit einem Verhältnis von 1 zu 2 von Mann zu Frau. Dann bereiten Sie eine Lagerlösung von 1%niedriger Schmelze Agarose in Embryo-Medien und lösen Sie es durch Erhitzen in einer Mikrowelle.Aliquot die Agarose-Lösung in 1,5-Milliliter-Röhren. Machen Sie eine Lagerlösung von 4%Tricain in destilliertem Wasser und lagern Sie die Agarose und Tricaine bei vier Grad Celsius. Tricain ist giftig und muss gewogen und in einer Dunstabzugshaube zubereitet werden.Nach der Paarung die Zebrafisch-Embryonen in E3 in einer Petrischale ernten und bei 26,5 Grad Celsius für etwa 28 Stunden vor der Montage bebrüten. Anästhetisieren Sie die Embryonen mit 0,02% Tricain und dechorionieren Sie sie unter dem Mikroskop, indem Sie sanft greifen und ziehen Sie die Chorion auseinander, um den Embryo zu befreien. Kurz vor der Montage die Agarose-Lösung auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann auf ca. 30 Grad Celsius abkühlen lassen, damit der Embryo nicht durch die Hitze geschädigt wird, und Der Agarose-Lösung Tricain hinzufügen.Verwenden Sie 35 Millimeter Glasbodenschalen mit einer Zahl Null Coverglas Boden. Legen Sie vorsichtig einen dechorionierten Embryo mit einer seiner Seiten zur Unterseite der Schale mit einer Glaspipette oder einer Mikropipette, dann entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden E3 mit einer Mikropipette. Fügen Sie die erste Agarose-Lösung zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch das an der Unterseite der Schale befestigte Deckglas erstellt wurde, um den Embryo zu bedecken, um sicherzustellen, dass die Agarose den kleinen Brunnen bedeckt, aber nicht überfließt.Bedecken Sie den kleinen Brunnen mit einem Deckglas, um einen schmalen Agarose-gefüllten Raum mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern zu schaffen. Legen Sie eine Schicht von 1%Agarose-Lösung auf die Oberseite des Deckglases auf der unterdem der Schale, die das Deckglas an Ort und Stelle halten wird, wie es erstarrt. Dann füllen Sie den restlichen Teil der Schale mit E3 mit 0,02%Tricain, um das System hydratisiert zu halten.Um die optimale Agarose-Konzentration für Schicht eins zu identifizieren, montieren Sie die Embryonen in zunehmenden Konzentrationen von Agarose und führen Sie Zeitraffer-Bildgebung durch, um die Konzentration zu identifizieren, die die Embryoverzerrung und Beweglichkeit minimiert, und testen Sie dann einen feineren Konzentrationsbereich auf der Grundlage der Ergebnisse. Der wichtigste Schritt dieses Protokolls besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose für Schicht eins zu identifizieren. Testen Sie verschiedene Nanokonzentrationen von Agarose, wie 0,030%0,032% usw.um die optimale Konzentration zu finden. Um die Embryonen mit Zeitraffer zu bebildern, verwenden Sie ein Mikroskopstadium mit einem Inkubator von 28,5 Grad Celsius und einem Bild für bis zu 55 Stunden. Um mehrere Embryonen gleichzeitig abzubilden, verwenden Sie einen Bühnenadapter, der mehrere Gerichte hält, und drehen Sie die Gerichte nacheinander, so dass die Embryonen horizontal positioniert sind.Wählen Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung, lokalisieren Sie dann die Embryonen mit dem Okular und richten Sie sie schließlich horizontal aus, indem Sie die Gerichte drehen. Zeichnen Sie den Standort der Embryonen in der Software auf, und erstellen Sie einen Dateinamen zum automatischen Speichern der Daten. Legen Sie die Lochgröße, die Scangeschwindigkeit, die Bildgröße und den Zoom fest.Wählen Sie dann eine höhere Vergrößerung für die Aufnahme von Bildern und die zu bebildernden Fluoreszenzkanäle aus. Passen Sie für jeden Kanal die Laserleistung und die Hochspannung des Detektors an, um den bestmöglichen Dynamikbereich zu erfassen und gleichzeitig Sättigung zu vermeiden und das Bleichen von Fotos zu begrenzen. Um als Nächstes den gesamten Embryo mit einem 10-fachen Objektiv abzubilden, legen Sie die Einstellungen für die große Bildaufnahme in der Software fest, um mehrere Sichtfelder abzubilden und sie zusammenzufügen und die Position des Embryos anzupassen, um sicherzustellen, dass er in diesen großen Bildbereich passt.Konfigurieren Sie die Einstellungen für die Erfassung von Z-Stacks entsprechend den Manuskriptrichtungen. Um den Fokus mehrerer Embryonen während der Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung zu erhalten, verwenden Sie einen automatisierten Fokus und passen Sie die einzelnen Offset-Werte für jeden Embryo an, um sich auf die Referenzebene zu konzentrieren. Richten Sie dann Zeitrafferparameter in der Mikroskopsoftware ein, um für eine Dauer von 55 Stunden in Einem Stunde-Intervallen abzubilden.Erfassen Sie in jedem Zyklus zwei Embryo-Datasets sequenziell und speichern Sie Daten automatisch. Verwenden Sie die Mikroskop-Software, um die Bilder zu verarbeiten. Wenn mehr als ein Embryo abgebildet wurde, erstellen Sie unabhängige Dateien für jeden Embryo, indem Sie die Datensätze basierend auf dem Speicherort der Abbildung aufteilen.Konvertieren Sie die 3D-Zeit-Datasets mithilfe von Projektionen mit maximaler Intensität oder einem ähnlichen Werkzeug in 2D-Zeit-Datasets. Erstellen Sie schließlich Filmdateien, indem Sie sie als AVI speichern und die Option "Keine Komprimierung" mit 200 Millisekundenintervallen für eine Wiedergabegeschwindigkeit von fünf Bildern pro Sekunde auswählen. Diese geschichtete Montagemethode ermöglicht es, Zebrafisch-Embryonen abzubilden, während sie wachsen können, aber gleichzeitig ihre Bewegung einschränken.Wenn die Agarose-Konzentration zu hoch ist, werden die Embryonen verzerrt. Aber wenn es zu niedrig ist, werden sie während der Zeitraffermikroskopie aus dem Sichtfeld herauskommen. Die optimale Agarose-Konzentration lag zwischen 0,028 und 0,034%Live-transgenen Zebrafischen, die RFP im gesamten Embryo und GFP in den Endothelzellen der Vaskulatur exzessierten, wurden 55 Stunden lang abgebildet, während der das intersegementale Gefäß sprießen, subintestinale und Kopfvaskulatur entwickelten und kaudalen Venenplexuskondensation mit Rumpfdehnung auftraten.Embryonen, die GFP und motorische Neuronen exezieren, wurden abgebildet, um die Entwicklung des motorischen Neuronens zu visualisieren. Die motorischen Neuronaxone sprießen aus dem ventralen Neuralrohr über die Sods zur ventralen Seite des Embryos. Die Ko-Entwicklung des dorsalen Keimens von motorischen Neuronaxonen in Bezug auf die Position der intersegmentalen Gefäße wurde mit einer höheren Vergrößerung abgebildet.Dies ermöglichte es, die feineren Details des ventralen Axons, das aus dem Neuralrohr sprießen, sowie des dorsalen Axons zu visualisieren. Mit zunehmender Zahl verlängern sich die Soden auch in Länge und Breite. Dieser Prozess wurde mit transgenen Embryonen abgebildet, die GFP in den Muskeln exzessizieren.Da die optimale Konzentration von Agarose sehr gering ist, ist sie bei der Herstellung der Vorratslösung von Agarose sehr empfindlich gegenüber kleinen Messschwankungen und muss für jede neue Charge von Agarose-Lösung neu definiert werden. Es ist wichtig, die bildgebenden Parameter wie Bildgröße und -auflösung, Scangeschwindigkeit, Zoom, Hochspannung des Detektors und Laserleistung sorgfältig einzustellen, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten und auch die Möglichkeit von Fototoxizität und Fotobleiche während der Langzeitzeitraffis-Bildgebung zu reduzieren. Mit dieser Montagemethode für transgene Zebrafischembryonen, gefolgt von einer erweiterten Zeitraffer-Bildgebung des gesamten Organismus, können wir visualisieren, wie sich verschiedene Gewebe zusammen entwickeln.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...